Summary

Kvantifierbar och billig cellfri fluorescerande metod för att bekräfta nya föreningars förmåga att kelera järn

Published: February 23, 2024
doi:

Summary

Vi beskriver en fluorescerande analys som snabbt och billigt kan bekräfta nya föreningars förmåga att kelera järn. Analysen mäter föreningarnas förmåga att konkurrera ut den järnbindande aktiviteten hos den svaga järnkelaterande fluorescerande sonden Calcein, vilket resulterar i en kvantifierbar ökning av fluorescens när kelering inträffar.

Abstract

Cancerceller kräver stora mängder järn för att upprätthålla sin förökning. Järnmetabolism anses vara ett kännetecken för cancer, vilket gör järn till ett giltigt mål för anti-cancermetoder. Utvecklingen av nya föreningar och identifieringen av potentiella effekter för ytterligare modifiering kräver att validering av mekanismer kan styrkas. Det finns många analyser för att utvärdera effekterna på spridningen. Förmågan att kelera järn är dock ett viktigt och ibland förbisett slutpunktsmått på grund av de höga kostnaderna för utrustning och utmaningen att snabbt och reproducerbart kvantifiera styrkan i kelering. Här beskriver vi en kvantifierbar och billig cellfri fluorescerande metod för att bekräfta nya föreningars förmåga att kelera järn. Vår analys bygger på det kommersiellt tillgängliga billiga fluorescerande färgämnet Calcein, vars fluorescens kan kvantifieras på de flesta fluorescerande mikrotiterplattläsare. Kalcein är en svag järnkelator, och dess fluorescens släcks när den binder Fe2+/3+; fluorescensen återställs när en ny kelator konkurrerar ut Calcein för bunden Fe2+/3+. Avlägsnandet av fluorescerande kylning och den resulterande ökningen av fluorescensen gör det möjligt att bestämma kelatbildningsförmågan hos en ny förmodad kelator. Därför erbjuder vi en billig analys med hög genomströmning som möjliggör snabb screening av nya potentiella kelatorföreningar.

Introduction

Fenotypiska förändringar i celler som relaterar till utvecklingen av cancer genom en gemensam uppsättning förändrade biologiska förmågor kallas nu ofta för kännetecken för cancer. Bland dem finns förändringar som är ett resultat av omprogrammering av energimetabolismen, som är utbredda inom cancercellbiologi1. Sådan metabolisk omprogrammering inkluderar ett ökat behov av järn för att stödja snabb proliferation och tumörtillväxt2. Denna törst efter järn leder till en dysreglerad järnmetabolism, vilket i sig anses vara ett kännetecken för cancer 3,4, med dysreglering i alla stadier5. Kännetecknen för metastasering, som nyligen föreslagits av Welch och Hurst, inkluderar en roll för järn6 eftersom järn kan inducera oxidativ stress, och detta kan i sin tur förmedla förändringar i genomet, epigenomet och proteomet, vilket ökar möjligheten till metastasering7. Ett samband mellan järnnivåer och en ökad förekomst av cancer har visats genom epidemiologiska studier8.

Eftersom cancerceller kräver stora mängder järn är de känsliga för järnbrist och därmed järnkelering. Vi har nyligen publicerat en översiktsartikel som belyser potentialen för järnkelering för att vända flera kännetecken för cancer genom att NDRG1 stör onkogena signalvägar9. Användningen av järnkelering som fristående cancerbehandling har dock inte gett positiva resultat i kliniska prövningar på grund av deras toxicitet, korta halveringstid, snabba metabolism och nya resistensmekanismer. Icke desto mindre har järnkelatbildare visat sig lovande i in vitro – och in vivo-undersökningar , vilket tyder på att mer arbete behövs för att utveckla effektiva järnkelatorer för cancerterapi. Specifik järnkelering är en validerad strategi vid upptäckt av anticancerläkemedel, men endast ett fåtal klasser har hittills rapporterats10.

Identifieringen och karakteriseringen av nya järnkelatorer kräver förmågan att mäta deras effekt på flera effektmått. Många av dessa (såsom proliferation, apoptos, bildning av reaktiva syreföreningar) mäts rutinmässigt och har beskrivits och granskats i litteraturen som metoder för att utvärdera kännetecknen för cancer11. Vid utvärdering av en ny järnkelator undersöker många grupper rutinmässigt effekten på anti-proliferativa och redoxaktiviteter samt effekter på järninflöde eller utflöde. In silico-prediktionstekniker12 ökar ytterligare den växande poolen av järnkelatorer som kan screenas.

S-kreening av järnkelatorer kräver förmågan att mäta deras effekt på järnnivåer som ett sätt att effektivt visa bevis på princip. För närvarande är den vanligaste metoden för att göra det flödescytometri13 som är kostsam, tidskrävande och dåligt kvantifierbar. Valet av analys baseras ofta på tillgången på experimentell utrustning, hastighet och kostnad för en analys. Därför kan förmågan att kelera järn vara ett förbisett slutpunktsmått på grund av de höga kostnaderna för utrustning och utmaningen att snabbt och reproducerbart kvantifiera styrkan i kelering. Här beskriver vi en kvantifierbar och billig cellfri fluorescerande metod för att bekräfta nya föreningars förmåga att kelera järn.

Protocol

1. Förberedelse av stamlösning När du förbereder Calcein lagerlösningar, förhindra fotoförsämring genom att förvara lösningarna i mörkret. Bered en 1 mM lösning av Calcein i Dulbeccos PBS, utan magnesium eller kalcium14. För 5 ml 1 mM Kalceinlösning, tillsätt 3,1 mg Kalcein (622,5 g/M) till 5 ml Dulbeccos PBS. Använd 1 mM strumpa av Calcein för att bereda 1 ml alikvoter av sekundära stamlösningar i mikrofugerör enligt…

Representative Results

För den metod som visades i steg 2 fastställde detta första experiment (figur 1) det linjära området för mikrotiterfluorescensplattans läsare vid detektering av fluorescerande Calcein-utsläpp. Våra representativa resultat visar ett brett linjärt intervall av Kalcein-fluorescens från 0-100 μM. ANOVA med LSD post hoc-analys visar att det finns en statistiskt signifikant skillnad i genomsnittlig RFU för alla Kalceinkoncentrationer jämfört med en …

Discussion

Cancerns överberoende av järn för att driva sin ämnesomsättning gör järnkelering till ett potentiellt tillägg till terapeutiska regimer4. Det finns dock en begränsad förmåga att snabbt screena nya metalljonkelatorer för deras förmåga att binda järnjoner. Den vanliga och allmänt tillgängliga fluorescerande sonden Calcein är känd för att fungera som en svag järnkelator och bindning av järnjoner släcker Calceins fluorescens. Fluorescens kan sed…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi vill tacka Northumbria University för deras stöd.

Materials

Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate Sigma-Aldrich 215406 other wise known as FAS
Calcein Sigma-Aldrich C0875
Deferiprone Sigma-Aldrich 379409
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline Sigma-Aldrich D5652 magnesium and calcium free
Greiner CELLSTAR 96 well plates Sigma-Aldrich M0812 any optically transparent 96 well plate will work

References

  1. Hsu, P. P., Sabatini, D. M. Cancer cell metabolism: Warburg and beyond. Cell. 134 (5), 703-707 (2008).
  2. Hsu, M. Y., Mina, E., Roetto, A., Porporato, P. E. Iron: An essential element of cancer metabolism. Cells. 9 (12), 2591 (2020).
  3. Torti, S. V., Torti, F. M. Iron and cancer: More ore to be mined. Nat Rev Cancer. 13 (5), 342-355 (2013).
  4. Zhang, C., Zhang, F. Iron homeostasis and tumorigenesis: Molecular mechanisms and therapeutic opportunities. Protein Cell. 6 (2), 88-100 (2015).
  5. Torti, S. V., Manz, D. H., Paul, B. T., Blanchette-Farra, N., Torti, F. M. Iron and cancer. Annu Rev Nutr. 38, 97-125 (2018).
  6. Welch, D. R., Hurst, D. R. Defining the hallmarks of metastasis. Cancer Res. 79 (12), 3011-3027 (2019).
  7. Lehmann, U., et al. Epigenetic defects of hepatocellular carcinoma are already found in non-neoplastic liver cells from patients with hereditary haemochromatosis. Hum Mol Genet. 16 (11), 1335-1342 (2007).
  8. Fonseca-Nunes, A., Jakszyn, P., Agudo, A. Iron and cancer risk–a systematic review and meta-analysis of the epidemiological evidence. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 23 (1), 12-31 (2014).
  9. Abdelaal, G., Veuger, S. Reversing oncogenic transformation with iron chelation. Oncotarget. 12 (2), 106-124 (2021).
  10. Brown, R. A. M., et al. Altered iron metabolism and impact in cancer biology, metastasis, and immunology. Front Oncol. 10, 476 (2020).
  11. Menyhárt, O., et al. Guidelines for the selection of functional assays to evaluate the hallmarks of cancer. Biochim Biophys Acta. 1866 (2), 300-319 (2016).
  12. Basu, A., et al. Discovering novel and diverse iron-chelators in silico. J Chem Inf Model. 56 (12), 2476-2485 (2016).
  13. Prus, E., Fibach, E. Flow cytometry measurement of the labile iron pool in human hematopoietic cells. Cytometry A. 73 (1), 22-27 (2008).
  14. Cold Spring Harb. . Phosphate-buffered saline (pbs). 2006 (1), (2006).
  15. Kontoghiorghes, G. J., Pattichis, K., Neocleous, K., Kolnagou, A. The design and development of deferiprone (l1) and other iron chelators for clinical use: Targeting methods and application prospects. Curr Med Chem. 11 (16), 2161-2183 (2004).

Play Video

Cite This Article
Carter, A., Veuger, S., Racey, S. Quantifiable and Inexpensive Cell-Free Fluorescent Method to Confirm the Ability of Novel Compounds to Chelate Iron . J. Vis. Exp. (204), e66421, doi:10.3791/66421 (2024).

View Video