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Summary

이 프로토콜은 박출률(HFpEF)이 보존된 고지혈증 유발 심부전의 쥐 모델을 복제하기 위한 자세한 접근 방식을 제시합니다. 이 설계는 아데노 관련 바이러스 9-심장 트로포닌 T-저밀도 지단백질 수용체(AAV9-cTnT-LDLR)와 폴록사머-407(P-407)의 투여를 결합합니다.

Abstract

지방 독성에 의해 유발되는 박출률 보존(HFpEF)을 동반한 심부전의 병태생리학은 완전히 이해되지 않았습니다. 심장 대사 HFpEF를 정확하게 모방하는 동물 모델에 대한 시급한 필요성을 감안하여 HFpEF 환자에서 볼 수 있는 표현형을 리버스 엔지니어링하여 고지혈증 유발 쥐 모델을 개발했습니다. 이 모델은 지방 독성과 대사 증후군 간의 상호 작용에 중점을 두고 HFpEF를 조사하는 것을 목표로 했습니다. 고지혈증은 지단백질 리파아제를 차단하는 블록 공중합체인 폴록사머-407(P-407)의 격주 복강내 주사와 아데노 관련 바이러스 9-심장 트로포닌 T-저밀도 지단백질 수용체(AAV9-cTnT-LDLR)의 단일 정맥 주사를 통해 야생형(WT) 마우스에서 유발되었습니다. 치료 후 4주에서 8주 사이에 심장 초음파, 혈압 기록, 전신 혈량측정, 심초음파(ECG) 원격 측정, 활동 휠 모니터링(AWM), 생화학 및 조직학적 분석을 포함한 광범위한 평가가 수행되었습니다. LDLR/P-407 마우스는 4주에 이완기 기능 장애, 박출률 보존, 좌심실 벽 두께 증가 등의 독특한 특징을 보였습니다. 특히 혈압과 신장 기능은 정상 범위 내로 유지되었습니다. 또한 ECG와 AWM에서 각각 심장 차단과 활동 감소가 나타났습니다. 이완기 기능은 8주에 악화되었으며 호흡수가 현저히 감소했습니다. 이중 치료 모델에 대한 추가 조사에서는 섬유증, 습식/건식 폐 비율, 심박 중량/체중 비율이 상승한 것으로 나타났습니다. LDLR/P-407 마우스는 황색종, 복수 및 심장 허혈을 나타냈다. 흥미롭게도, 돌연사는 치료 후 6주에서 12주 사이에 발생했다. murine HFpEF 모델은 지방 독성 매개 HFpEF의 맥락에서 이완기 기능 장애에 기여하는 대사 증후군의 복잡성을 설명하기 위한 가치 있고 유망한 실험 리소스를 제공합니다.

Introduction

박출률이 보존된 심부전(HFpEF)은 여러 동반 질환을 동반하는 심장대사 증후군을 의미하며 모든 심부전 사례의 50% 이상을 차지합니다 ^1,2. 더욱이, HFpEF의 빈도는 지난 10년 동안 꾸준히 증가해 왔다³. 치료 옵션이 제한적인 HFpEF는 다면적인 병태생리학을 감안할 때 심혈관 질환에서 가장 중요한 미충족 의학적 필요성이다⁴. 따라서 효과적인 치료법을 개발하기 위해 HFpEF의 기본 메커니즘과 병태생리학에 대한 이해를 높이는 것이 시급합니다.

최근 몇 년 동안 상당한 발전에도 불구하고 지방 독성에 기인하는 HFpEF의 병태생리학은 완전히 이해되지 않고 있습니다. HFpEF 환자는 박출률(HFrEF)이 감소한 심부전 환자에 비해 심근 지질 축적이 현저히 증가하고 건강한 대조군인 것으로 확인되었다⁵. 심장 생검의 RNA 염기서열 분석 데이터는 건강한 환자와 HFrEF 환자에 비해 HFpEF 그룹에서 지단백질 리파아제(LPL) 유전자의 하향 조절을 보여주었다⁶. Poloxamer-407 (P-407)은 LPL을 차단하여 고지혈증을 유발하는 블록 코폴리머로서, 이후 혈장 트리글리세리드와 저밀도 지단백(LDL) 콜레스테롤을 증가시켜 고지혈증을 유발한다⁷. 이전 연구에서는 HFpEF 마우스의 심장에서 높은 LDL-수용체(LDLR) 발현을 보여주었다⁸.

이러한 발견을 바탕으로 심장 대사 HFpEF를 정확하게 모방하는 동물 모델에 대한 긴급한 필요성을 인식하여 고지혈증 유발 쥐 모델이 개발되어 제시되었습니다. 이 모델은 HFpEF를 탐구하기 위해 맞춤화되었으며, 대사 증후군과 함께 지방 독성의 관여에 명시적으로 초점을 맞췄습니다. 고지혈증/LPL 차단 및 향상된 심장 LDLR 발현에 의해 유도된 이 모델은 P-407의 격주 복강내(i.p.) 주사와 아데노 관련 바이러스 9-심장 트로포닌 T-LDLR(AAV9-cTnT-LDLR^)의 단일 정맥(i.v) 주입을 통해 129J 배경의 WT-129 마우스에서 확립되었습니다.

치료 후 4주에서 8주 사이에 심초음파, 혈압 기록, 전신 혈류측정법(WBP), 연속 심전도(ECG) 원격 측정, 활동 휠 모니터링(AWM), 생화학 및 조직학적 분석을 포함하는 광범위한 평가가 수행되었다⁹. 4주가 되었을 때, LDLR/P407 또는 “이중 처리” 마우스는 이완기 기능 장애, 박출률 보존, 좌심실 벽 두께 증가 등 뚜렷한 HFpEF 특징을 보였다⁹. 또한 ECG 원격 측정과 AWM은 각각 심장 차단과 활동 감소를 나타냈습니다. 주목할 만한 점은 혈압과 신장 기능이 정상으로 유지되었다는^{점이다 9}. 8주가 지나자 이완기 기능이 저하되었고, WBP 측정 결과 호흡수가 감소한 것으로 나타났다⁹.

이중 치료 모델에 대한 추가 조사에서는 섬유증, 습식/건식 폐 비율 상승, 심박량/체중 비율이 확인되었다⁹. 부검 결과 복수, 심장 허혈, 황색종이 발견되었습니다. 흥미롭게도, 치료 후 6주에서 12주 사이에 돌연사가 보고되었다⁹. 이 쥐 고지혈증 기반 HFpEF 모델은 지방 독성 매개 HFpEF로 이완기 기능 장애에 기여하는 대사 증후군의 복잡성을 풀기 위한 빠르고 가치 있으며 유망한 실험 도구를 제공합니다.

Protocol

동물 프로토콜은 미국 국립보건원(NIH) 지침(IACUC 프로토콜 23-103-ad03)에 따라 마이애미 대학교의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다. 본 연구를 위해 129J 배경의 야생형(WT) 마우스를 상업적 출처( 재료 표 참조)에서 획득하고 사내에서 사육했습니다. 모든 쥐는 129J 배경에서 새끼 동물이었습니다. 실험에는 수컷과 암컷 쥐가 모두 포함되었습니다. LDLR/P-407 HFpEF 마우스는 첫째 주에 AAV9-cTnT-LDLR을 1회 투여하고 4주 동안 격주로 p407을 투여함으로써 확립되었습니다. 1. AAV9-cTnT-LDLR 준비 및 관리 참고: AAV9-cTNT-hLDLR 플라스미드( 재료 표 참조)는 전체 인간 LDLR 단백질(2664bp)을 암호화합니다(그림 1). AAV-LDLR 바이러스 벡터 전처리동물의 수에 따라 AAV9 스톡 바이알을 얼음에서 20분 동안 해동한 다음 AAV 입자를 Dulbecco의 DPBS(Phosphate Buffered Saline)에 희석하여 100μL에서 1 x 1012 벡터 게놈/마우스의 농도를 얻습니다. 바이러스 용액을 1mL 주사기의 28-30G 바늘에 넣습니다. 바늘에 기포가 들어가지 않도록 주의하십시오. 정맥 주사(i.v.) 꼬리 정맥 주사 절차최대 0.5L/min의 산소를 켜고 이소플루란 마취 시스템을 4%-5%로 설정합니다. 동물이 반응하지 않을 때까지 마우스를 유도 챔버에 ~2분 동안 넣습니다. 동물을 쥐 꼬리 조명 장치 조절기(예: Braintree Scientific, Inc.(Braintree, MA))에 놓고 동물을 옆으로 누울 수 있습니다. 유지 보수를 위해 이소플루란 마취를 2%-3%까지 사용하십시오.알림: 억제 장치에 의한 가열은 생쥐 꼬리 정맥의 팽창을 유발하여 주입을 훨씬 쉽게 만듭니다. 측면 꼬리 정맥을 식별합니다. 거즈 패드를 사용하여 소독약으로 주사 부위를 청소하십시오. 꼬리 끝을 잡고 뻗고 정맥이 보일 때까지 손가락으로 쥐 꼬리를 마사지합니다. 바늘을 낮은 각도(10-15도 각도)로 삽입하고 희석된 AAV 100μL를 꼬리 정맥에 주입합니다(그림 2A). 바늘을 빼내고 출혈이 멈출 때까지 즉시 손가락으로 압력을 가하십시오. 마우스를 원래 케이지로 되돌립니다. 2. P-407 준비 및 관리 P-407 준비P-407 제제( 재료 표 참조)를 DPBS로 희석하여 흄 후드 내부의 최종 농도 100mg/mL로 용액을 준비합니다. P-40710의 용해를 용이하게 하기 위해 로테이터에서 용액을 4°C에서 밤새 냉장 보관합니다. 격주 복강내(i.p.) 주사 절차i.p. 주사 첫날에 각 마우스의 무게를 잰다. 1g/kg 공식을 사용하여 무게와 프리필 주사기에 따라 각 마우스에 대한 적절한 투여량을 계산합니다. 흄 후드 아래에서 머리와 몸을 아래쪽으로 기울인 상태에서 마우스를 수동으로 고정하여 내부 장기를 두개골 위치로 재배치합니다. 이 기술은 주변의 중요한 구조물에 구멍이 뚫리는 것을 방지합니다. 정중선 측면의 복부 하부 사분면에 있는 왼쪽 복막강을 식별합니다. 방부제로 현장을 청소하십시오. 45도 이하의 각도로 바늘을 복막강에 삽입합니다(그림 2B). 주사기가 적절하게 삽입되도록 흡입합니다. 흡인에 혈액이나 조직이 있는 경우 바늘을 빼내고 주사기가 깨끗해질 때까지 2.2.2-2.2.4단계를 반복합니다. 바늘을 적절한 날카로운 물건 용기에 버리고 마우스를 원래 케이지로 되돌립니다. 3. 심장 초음파 검사 준비촬영 전날 또는 촬영 몇 시간 전에 쥐의 가슴과 상복부에 제모 크림을 바릅니다. 2분 후 젖은 거즈로 크림을 제거합니다. 0.8L/min 유속에서 2.5%-3.0% 이소플루란으로 마우스를 마취하고 1%-1.5% 이소플루란으로 유지합니다. 그런 다음 전도성 젤로 전극 패드에 발을 대고 누운 자세의 적절한 플랫폼에 마우스를 고정하고 코와 입을 노즈 콘으로 덮어 이소플루란으로 지속적인 마취를 보장합니다. Parasternal 장축 보기마우스를 똑바로 놓은 상태에서 플랫폼의 오른쪽을 45도 기울입니다. 다음으로, 레일 시스템에서 트랜스듀서 프로브를 대각선으로 정렬하고 오른쪽 상단에서 왼쪽 복부까지 시계 방향으로 30-40도 각도를 조절하여 B 모드 이미지를 얻고 저장합니다. 초음파 분석 소프트웨어( 재료 표 참조)를 사용하여 B 모드 이미지를 분석하여 박출 분율을 얻습니다(그림 3A). Parasternal short-axis view레일 시스템의 트랜스듀서 프로브를 시계 방향으로 90도 회전하여 B 모드 및 M 모드 이미지를 얻고 저장합니다. 정점 보기플랫폼의 왼쪽 상단 모서리를 아래쪽과 오른쪽으로 기울입니다. 변환기를 동물의 오른쪽 어깨 쪽으로 향하게 합니다. B-모드와 컬러 도플러 모드에서 승모판을 시각화합니다. 펄스파(PW) 도플러 및 조직 도플러 영상 획득및 저장 5. 초음파 분석 소프트웨어를 사용하여 PW 도플러 및 조직 도플러 이미지를 분석하여 IVRT, E/E’ 및 E/A를 얻습니다(그림 3B-E). 4. 압력-부피(PV) 루프 데이터 기록 연구가 끝나면 이전에 설명한 절차11,12에 따라 좌심실(LV) 수축기 및 이완기 기능을 평가하기 위해 혈류역학 분석을 수행합니다.마우스에 이소플루란(3-5%, 유도 챔버)을 유도하는 것으로 시작합니다. 마취 작용이 시작되면 동물을 수술대로 옮기고 이소플루란(1-3%, 안면 마스크)으로 마취를 유지합니다. 기관 내 삽관(입을 통해)을 할 수 있도록 목 위의 피부를 약간 절개합니다. ~0.15-0.2mL 부피로 설정된 설치류 인공호흡기(예: Micro vent 모델 848, Harvard Apparatus)를 사용하여 산소와 이소플루란의 혼합물로 동물을 환기시킵니다. 온도 조절이 가능한 수술 테이블을 사용하여 절차 전반에 걸쳐 ~37°C ± 1°C에서 체온을 모니터링합니다. 유체 지원 투여를 위해 30G 바늘로 왼쪽 내부 경정맥을 노출시키고 캐뉼레이팅합니다. 정중 복부 경부 부위의 피부를 자르고 경동맥을 노출시킵니다. 우경동맥의 원위부 폐색 후 동맥을 약간 절개하여 좌심실(폐쇄 흉부 접근법)에 micro-tipped pressure-volume (PV) 카테터( 재료 표 참조)를 도입할 수 있도록 합니다. 정상 상태 및 하대정맥 폐색 중 PV 루프를 기록합니다. 실험이 끝나면 승인된 AVMA 방법(예: 이소플루란 후 자궁 경부 탈구)을 사용하여 동물을 인도적으로 안락사시킵니다(깊은 마취 하에). LabChart 소프트웨어( 재료 표 참조)를 사용하여 PV 데이터를 분석하고 심초음파 측정을 사용하여 부피를 보정합니다.

Representative Results

4주 동안 단일 용량의 i.v. AAV9-cTnT-LDLR과 격주 i.p.를 결합한 후 P-407 주사, 심장 초음파 검사에서 HFpEF는 박출률 보존, 뇌실 내 이완 시간(IVRT) 연장 및 E/E’, E/A 감소로 입증되었습니다(그림 3A-E). 더 심각한 이완기 기능 장애는 4주 후의 데이터와 비교했을 때 8주 후에 관찰되었습니다. 치료 8주 후 압력-부피(PV) 루프 분석은 이완기 말-혈압-부피 관계 기울기가 증가하여 이완기 기능 장애의 심장 초음파 소견을 확증했습니다(그림 3F). 특히, LDLR/P-407로 처리한 후 6주에서 12주 사이에 LDLR/P-407로 치료한 마우스의 상당수에서 돌연사가 발생했다(그림 3G). 이러한 결과는 심장 대사 HFpEF를 나타내며 이 프로토콜과 실험 설계의 효과를 확인합니다. 고지혈증은 총 콜레스테롤, 트리글리세리드, 초저밀도 지단백(VLDL), 저밀도 지단백(LDL) 콜레스테롤 및 정상 고밀도 지단백 콜레스테롤 수치 상승으로 입증된 바와 같이 4주와 8주에 LDLR/P407로 치료받은 마우스에서 나타났으며, 이는 고지혈증에 대한 우리의 연구 결과를 뒷받침합니다(그림 3H). 그림 1: AAV9-cTnT-LDLR에 대한 플라스미드 맵. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 2: 주입 절차. (A) 129J 균주 배경에서 WT 마우스에서 AAV9-cTnT-LDLR의 정맥(i.v) 꼬리 정맥 주입을 보여주는 대표 이미지. (B) 이전에 AAV9-cTnT-LDLR의 단일 i.v. 용량으로 치료한 129J 균주 배경에서 WT 마우스에서 P-407의 복강 내 주사 그림. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 3: 심장 대사 HFpEF. (A-E) LDLR/P-407 치료 4주(n = 17) 및 8주(n = 11) 후 보존된 박출률(HFpEF)을 나타내는 심초음파 매개변수와 치료하지 않은 마우스(n = 15). 이는 박출률 보존, IVRT(isovolumic relaxation time) 연장, E/E’ 증가 및 E/A 감소, 모두 이완기 기능 장애의 지표로 입증됩니다. (F) 압력-부피 루프 획득 및 분석은 치료 8주 후 EDPVR(말-이완기 압력-부피 관계) 기울기가 증가한 것으로 나타났습니다. (G) LDLR/P-407 치료 후 6주에서 12주 사이에 돌연사가 발생했다. (H) 지질 패널은 LDLR/P407로 치료한 마우스에서 총 콜레스테롤, 트리글리세리드, 초저밀도 지단백(VLDL), 저밀도 지단백(LDL) 콜레스테롤 및 정상 고밀도 지단백 콜레스테롤 수치가 처리되지 않은 마우스(n=5)에 비해 상승하여 입증된 고지혈증 결과를 뒷받침했습니다. 데이터는 평균 ± SD로 표시됩니다. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

지난 10년 동안 HFpEF의 유병률이 꾸준히 증가했음에도 불구하고, 근본적인 병태생리학에 대한 구체적인 이해는 여전히 어렵다¹³. 더욱이, 현재로서는 제한적인 근거중심치료법이 존재한다¹³. 심장 대사 HFpEF와 관련된 메커니즘에 대한 이해가 필요합니다. 이전에는 만성 신장 질환(CKD)이나 심장 LDLR OE 및 p407 주사에 의해 유발되는 고혈압이 없는 HFpEF를 모방하는 고지혈증 마우스 모델이 소개되었다⁹.

연구 결과, 심장 LDLR OE와 고지혈증의 조합은 4주 후 마우스에서 이완기 기능 장애, 부정맥, 좌심실(LV) 비대, 운동 과민증, 심장 지질 축적 및 섬유증을 초래한다는 것을 밝혀^냈다. 이 쥐의 심장, 간 및 골격근에서 LDL-콜레스테롤 흡수가 증가하고 심장과 간에서 트리글리세리드가 감소하는 것도 관찰되었습니다⁹. 이 방법의 장점은 최대 16주 및 20주가 소요되는 고지방 식단(HFD)과 같은 다른 고지혈증 HFpEF 마우스 모델에 비해 잘 이해되지 않는 심장 대사 증후군의 경로를 신속하게 조사할 수 있다는 데 있습니다¹⁴. 이 모델은 개발하는 데 4주가 걸리며 인간의 대사 이상을 모방합니다. 따라서 이 모델의 재현성이 필수적입니다.

AAV9-cTnT-LDLR 및 P-407의 철저한 준비 및 투여를 보장하는 것이 필수적입니다. 이 모델의 재현 가능성은 P-407 및 AAV9-cTnT-LDLR 농도 및 용량의 정확한 계산과 중량 측정에 크게 좌우됩니다. 용액 제제와 적절한 정맥 주사 및 복강 내 주사 기술도 마찬가지로 중요합니다. 이러한 기술의 편차는 상당한 변경과 원치 않는 결과를 초래할 수 있습니다.

이 모델의 효과와 효율성에도 불구하고 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 정맥 주사 및 복강 내 주사를 수행하기 위해서는 엄격한 훈련이 필요합니다. 또한 정맥 주사 및 빈번한 복강 내 주사와 관련된 이환율 및 사망률의 잠재적 위험이 있습니다. 정맥 주사를 할 때 쥐 꼬리 손상이 발생할 수 있으며, 복강 내 주사 시 결장 천자가 발생하여 복막염을 유발할 수 있다¹⁵. 이러한 부상은 일반적으로 잘못된 기술로 인해 발생하며 실험 대상자와 치료를 잃을 수 있습니다. 따라서 이러한 절차를 수행하기 전에 광범위한 교육이 필요합니다. 또 다른 제한 사항은 이 모델이 129J 변형에 초점을 맞춘다는 것입니다. 129J 균주를 선택한 이유는 미발표 연구에서 처음 연구한 C57BL/6 마우스에 비해 이 균주에서 더 빠른 이완기 기능 장애와 HFpEF 소견을 산출한 예비 연구에서 비롯되었습니다.

이러한 한계에도 불구하고 이 모델을 사용하면 HFpEF와 관련된 기본 메커니즘 및 잠재적으로 효과적인 치료 옵션에 대한 보다 신속한 조사를 수행할 수 있습니다. 이전 연구는 5-15주에 걸쳐 심장대사성 HFpEF 유도 HFD 및 N[w]-니트로-l-아르기닌 메틸 에스테르(L-NAME)에 대한 병태생리학적 모델의 개발로 이어졌다¹³. 그러나 HFpEF의 유병률이 꾸준히 증가함에 따라 심장 대사성 HFpEF의 병태생리학에 대한 더 깊은 이해와 효과적인 치료법 개발이 시급히 필요합니다. 이 심장 LDLR OE 및 p407 유발 고지혈증의 쥐 모델은 향후 연구 노력을 위해 심장 대사 HFpEF를 유도하는 빠르고 실현 가능한 방법입니다.

Materials

Adeno-associated virus 9-cardiac troponin T-LDLR (AAV9-cTnT-LDLR)	U. Penn Vector Core, funded by the NHLBI Gene Therapy Program (GTRP)		Transgene plasmids and AAVs particles were generated by the U. Penn Vector Core, funded by the NHLBI Gene Therapy Program (GTRP). AAV were provided in Dulbecco’s phosphate-buffered saline (PBS) with 0.001% Pluronic F68. The Core determined AAV titers by digital droplet polymerase chain reaction (ddPCR) and assessed all preparations for capsid protein ratio by SDS-PAGE and for the presence of endotoxin. Constructs include the human (h) transcripts tagged by 3X HA, Penn Vector Core (RRID: SCR_022432). AAV9-cTNT-hLDLR plasmid encodes the full human LDLR protein (2664bp).
Imaging systems with a high frequency transducer probe MS400	(VisualSonics, Toronto, ON, Canada)	Vevo 2100 or 3100
Isoflurane	Akorn Animal Health, Inc.	NDC: 59399-106-01
LabChart  software	ADInstruments	Pro version 8.1.5
Poloxamer 407	Sigma-Aldrich	16758
PV catheter	Millar Instrument	PVR 1035
Ultrasound analysis software	Vevo Lab
Wild-type (WT) mice on 129J background	Jackson Laboratory