이 프로토콜은 거의 생리학적 조건에서 세포 기능을 연구하기 위해 사망한 장기 기증자로부터 인간 췌장 절편을 생성하는 방법을 설명합니다. 이 혁신적인 접근법은 정상 및 구조적으로 손상된 섬과 내분비 구획 간의 복잡한 상호 작용을 조사할 수 있게 합니다.
제1형 당뇨병(T1D) 및 제2형 당뇨병(T2D)과 관련된 병태생리학적 메커니즘뿐만 아니라 췌장의 내분비 및 외분비 생리학 및 상호 작용을 이해하기 위해 인간의 췌장을 연구하는 것이 중요합니다. 고립된 췌장 섬에 대한 연구에서 많은 것을 배웠지만, 이것은 전체 조직의 맥락에서 췌장섬의 기능과 상호 작용을 조사하는 것을 방해합니다. 췌장 절편은 원래 환경 내에서 정상, 염증 및 구조적으로 손상된 섬의 생리학을 탐구할 수 있는 독특한 기회를 제공하며, 이를 통해 내분비 구획과 외분비 구획 간의 상호 작용 연구를 통해 췌장 조직의 복잡한 역학을 더 잘 조사할 수 있습니다. 따라서 살아있는 췌장 절편 플랫폼의 채택은 이 분야에서 상당한 발전을 나타냅니다. 이 프로토콜은 아가로스 및 진동 슬라이싱에 조직을 매끼워 사망한 장기 기증자로부터 살아있는 조직 절편을 생성하는 방법과 동적 분비 및 라이브 세포 이미징과 같은 기능적 판독을 평가하는 데 활용하는 방법을 설명합니다.
섬 생리학에 대한 연구는 당뇨병의 발병 기전을 이해하고 새로운 치료법을 개발하는 데 필수적입니다. 지금까지의 연구는 고립된 섬에 의존해 왔는데, 이는 섬을 기계적 및 효소적 스트레스에 노출시켜 세포 생리학에 변화를 일으킬 가능성이 있습니다. 더욱이, 자연 조직 환경의 맥락에서 섬 기능을 평가하는 것은 불가능하며, 이는 무엇보다도 외분비 및 혈관 세포의 영향을 받을 수 있습니다1. T1D로 기증자의 췌장을 연구할 때, 췌장의 섬은 분리하기 어렵고 격리 중에 단편화될 수 있으며, 이는 in vivo2에서 개체군을 대표하지 않을 수 있는 섬에 선택 효과를 생성할 수 있다는 문제가 있습니다. 더욱이, 섬은 복잡한 환경 및 세포 연결, 특히 염증이 있는 섬에서 발견되고 섬 주변에서 더 풍부하게 발견되는 침투 면역 세포로부터 분리될 것입니다. 따라서 고립된 섬은 당뇨병 연구의 초석 도구이지만 한계가 있습니다. 이에 대응하여 우리는 살아있는 췌장 절편을 생성하기 위한 획기적인 프로토콜을 도입하여 이러한 문제에 대한 솔루션을 제공합니다.
최근 췌장 조직 절단 기술의 개발 및 채택은 췌장의 복잡한 생물학과 기능을 탐구하는 우리의 능력에 대한 돌파구로 간주됩니다. 이 혁신은 자연적인 해부학적 맥락 내에서 내분비, 외분비, 신경, 혈관 및 면역 세포 간의 상호 작용과 섬 생리학의 역동적인 연구를 위한 새로운 길을 열었습니다. 기존의 접근법과 달리, 이 in vitro setting은 장기의 세포 구조를 상당 부분 보존하여 원래 생물학에 더 가까운 근사치를 가능하게 합니다. 2003년 Speier와 Rupnik에 의해 생쥐에서 처음 개발된 이 방법은 세포 내 및 세포 간 신호 전달 4,5,6,7,8,9에 대한 칼슘 이미징, 전기 생리학 및 호르몬 분비를 평가하는 유용성을 입증했습니다. 그런 다음 췌장 절편 플랫폼을 외과 생검 4,10,11,12를 통해 얻은 인간 췌장 조직 연구에 적용했습니다. 우리 그룹은 당뇨병이 있는 췌장 장기 기증자를 위한 네트워크(Network for Pancreatic Organ Donors with Diabetes, nPOD)13의 활동을 통해 사체 장기 기증자로부터 췌장 절편을 얻고 활용할 수 있는 가능성을 입증했습니다. nPOD는 인간 제1형 당뇨병에 대한 연구를 수행하는 승인된 연구자에게 췌장 조직을 제공하며, 췌장 절편 플랫폼을 채택한 이후 nPOD는 정기적으로 살아있는 췌장 절편을 생성하고 배포합니다 14,15,16,17. 2020년 췌장 절편 플랫폼을 구현한 이후 nPOD는 43명의 기증자(T1D 기증자 12명 포함)의 조직 절편을 수많은 연구자에게 성공적으로 배포했습니다. 이 절편을 사용하여 연구자들은 섬 기능의 중요한 측면에 대한 획기적인 연구를 수행하고 T1D 13,18,19,20,21,22,23,24의 맥락에서 섬과 혈관, 신경계 및 면역 세포 간의 상호 작용을 탐구했습니다 . 수많은 연구에서 전통적인 접근법의 한계를 강조하고 췌장 내의 역동적인 상호작용을 포착할 수 있는 기술의 중요성을 강조했습니다 25,26,27. 쥐에서 인간의 췌장에 이르는 슬라이싱 기술의 적응력과 당뇨병이 있는 췌장 장기 기증자 네트워크(nPOD)와 같은 프로그램으로의 통합은 제1형 당뇨병과 같은 질병에 대한 귀중한 통찰력을 제공할 수 있는 이 방법의 잠재력에 대한 인식이 커지고 있음을 보여줍니다.
여기에서는 생존 가능한 췌장 조직 절편을 생성하고 동적 호르몬 분비 및 기능 이미징과 같은 기능적 판독을 위한 사용을 위한 프로토콜을 제시합니다. 인간 섬 분리와 유사하게, 절편 절차의 성공은 기증자 특성, 조직 운송 시간 및 조직 품질을 포함한 다양한 요인에 의해 영향을 받는다25,29. 따라서 실험을 위한 조직 샘플을 신중하게 선택하고 허혈 시간을 최소한으로 유지하는 것이 중요합니다. 이러한 맥락에서, 사체 기증자 외에 인간 조직의 다른 잠재적 출처를 신중하게 고려해야 한다. 수술 기증자를 포함하면 기능적 절편 데이터를 동일한 환자의 관련 in vivo 정보와 결합할 수 있는 옵션이 제공되어 번역 관련성이 강화됩니다11. 그러나 이 조직 공급원은 일반적으로 국소 종양으로 인해 췌장 절제술을 받는 고령 환자로부터 생검을 받기 때문에 다른 요인을 가져옵니다. 특히, 췌장 생검은 당뇨병과 관련하여 수행되지 않습니다.
실제 슬라이싱 절차를 수행할 때 적시에 조직을 처리하는 것이 중요합니다. 절편은 이 프로토콜에 설명된 대로 몇 시간 동안 보관하거나 Qadir et al.19에 설명된 대로 장기간 배양할 수 있습니다. 현재로서는 이 프로토콜이 장기간에 걸쳐 절편 생존력을 유지할 수 있는 유일한 방법이지만, 향후 노력은 다양한 배양 시간에 걸친 기능적 변화를 평가하고 동일한 공여체의 고립된 섬과 비교해야 합니다.
이 과정에서 가장 중요한 단계는 아가로스에 삽입하기 전에 신중한 조직 준비입니다. 큰 덕트와 섬유화 조직은 슬라이싱 과정을 복잡하게 만들 수 있으며 잠재적으로 아가로스에서 조직 블록이 떨어져 나올 수 있습니다. 이 문제가 발생하고 조각이 적절한 크기로 유지되면 슬라이싱을 위해 다시 처리하고 포함할 수 있습니다. 좋은 조직 품질과 세심한 가공을 유지하면 슬라이싱 절차의 효율성이 크게 향상되고 슬라이스의 최대량과 품질을 얻을 수 있습니다. 조직 준비에서 절편 생성까지 경과된 시간은 2-3시간을 초과해서는 안 되며, 간격이 길면 조직 생존력에 큰 영향을 미칩니다.
slice perifusion 동안 간단하지만 중요한 단계는 챔버에 완벽하게 맞도록 slice를 정밀하게 트리밍하는 것입니다. 이를 통해 조직의 적절한 목욕과 중단 없는 흐름이 가능합니다. 프로토콜이 시작되면 호르몬 방출의 원치 않는 급증을 방지하기 위해 챔버의 추가 조작을 피하는 것이 중요합니다. 충분한 완충액을 준비해야 하며, 공기 흡입 및 챔버 건조를 방지하기 위해 튜브가 용액 바닥에 도달해야 합니다.
칼슘 이미징의 경우 실험적 요구와 설계에 따라 관심 영역을 신중하게 선택하는 것이 중요합니다. 빛 노출을 줄이거나 전체 프로토콜 시간을 단축하는 이미징 매개변수를 선택하여 광표백을 최소화하는 것이 중요합니다. 동적 호르몬 분비와 마찬가지로 적절한 용액 흐름과 가열된 설정을 유지하는 것이 중요한데, 이는 절편이 최적의 기능을 위해 거의 생리학적 조건(예: 37°C)을 필요로 하기 때문입니다.
췌장 조직 절편은 췌장의 구조적 무결성을 효과적으로 유지하여 다양한 세포 유형 간의 세포 간 연결을 보존합니다. 결과적으로, 그들은 고립된 섬과 함께 작업하는 것에 대한 대안을 제공하여 내분비 및 외분비 기능과 그들의 상호 작용에 대한 동시 탐색을 용이하게 합니다. 개별 세포 유형의 상호 작용을 평가하려면 세포 유형을 구별하는 것이 중요합니다. 사후 염색도 한 가지 옵션이지만, 사용 가능한 형광 프로브와 정확한 세포층을 찾는 데 어려움이 있다는 점에서 한계가 있습니다. 따라서, 반응에 기초한 세포 구별을 가능하게 하기 위해 세포 특이적 자극을 프로토콜에 통합하는 것이 바람직하다. 생쥐 또는 인간 절편의 세포 유형을 구별하기 위해 효과적인 자극에는 알파 세포21,30에 대한 아드레날린, 델타 세포31에 대한 그렐린, 아시나 세포 5,32에 대한 세룰린, 유관 세포33에 대한 담즙산, 혈관 세포22에 대한 노르에피네프린이 포함됩니다. 분비 반응을 측정하기 위해 유사한 자극을 사용할 수 있습니다. 이미징 연구는 개별 세포에 초점을 맞추는 반면, 분비 연구는 집단 반응을 분석합니다. 따라서 원하는 결과를 감지하기 위해 충분한 수의 슬라이스를 포함하는 것이 중요합니다. 최적의 양은 세포 유형에 따라 다를 수 있으며, 내분비 세포에 충분한 것으로 입증된 세 조각이 있습니다. 그러나 중요한 정보가 누락될 위험이 있는 것보다 검색 가능성을 보장하기 위해 더 많은 조각을 사용하는 것이 좋습니다.
다른 방법과 마찬가지로 조직 절편에는 결과를 해석할 때 고려해야 하는 제한 사항이 있습니다. 특정 세포 유형을 표적으로 하는 자극 적용은 slice의 다른 세포 유형에 영향을 미칠 수 있으며, 잠재적으로 피드백 루프를 트리거할 수 있습니다. 그러나 이러한 것들 또한 연구하는 것이 중요하므로 측정된 반응은 생리적 반응을 더 잘 나타낼 수 있습니다. 선택적 세포 표적화를 위해 기존의 in vitro 프로토콜을 사용할 수 있습니다. 중요한 것은 아시나 세포에는 단백질을 분해하고 조직 절편을 소화할 수 있는 췌장 효소가 포함되어 있어 몇 시간 내에 세포가 분해된다는 것입니다. 생존력을 유지하기 위해서는, 트립신 억제제의 적용이 라벨링 목적으로 사용되는 바이러스의 성공적인 전달을 방해할 수 있더라도 절편이 정적 상태에 있을 때 트립신 억제제의 일관된 사용이 필수적입니다.
섬 분리와 비교했을 때, 공여체 변동성과 조직 품질은 얻어진 절편의 양과 생존력 모두에 영향을 미칠 수 있습니다. 슬라이싱 후 생존력이 충분하지 않으면 수명이 짧아지고 슬라이스를 배양하는 능력이 저하될 수 있습니다. 또한, 섬 수는 기증자에 따라 크게 다를 수 있으므로 실험을 수행하기 전에 섬 함량을 추정하기가 어렵습니다. 결과적으로, 기증자 수용 기준을 신중하게 선택하고 분비 또는 기준선으로의 접힘 변화에 대한 호르몬 함량의 비율과 같은 적절한 정규화 방법의 구현이 중요합니다. 일관된 결과를 얻으려면 실험 전에 조직 절편 생존력을 평가하는 것이 좋습니다. 또한 관련 제어 자극(예: KCl)을 실험에 통합하는 것이 권장됩니다. 이미징과 같은 개별 세포 분석의 경우, 이러한 제어 자극에 대한 반응을 기반으로 세포를 사전 분류하는 방법을 구현할 수 있습니다. 언급된 어려움에도 불구하고 슬라이스는 현재 연구 방법에 귀중한 보강을 제공합니다.
설명된 프로토콜은 여러 응용 분야의 시작점으로 사용할 수 있으며, 췌장 절편을 조작하고 다양한 자극 후 반응을 검사할 수 있습니다. 또한 쥐 또는 인간의 췌장 절편을 활용한 수많은 연구 조사로 독자를 안내하여 실험을 계획하는 사람들에게 귀중한 통찰력을 제공합니다. 미래에는 췌장 절편을 사용하여 잠재적인 치료법을 조사하거나 질병 메커니즘을 모델링할 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
이 연구는 당뇨병을 앓고 있는 췌장 장기 기증자를 위한 네트워크(Network for Pancreatic Organ donors with Diabetes; RRID:SCR_014641), JDRF(nPOD: 5-SRA-2018-557-Q-R) 및 Leona M. & Harry B. Helmsley Charitable Trust(Grant#2018PG-T1D053, G-2108-04793)가 지원하는 공동 제1형 당뇨병 연구 프로젝트. 표현된 내용과 견해는 저자의 책임이며 반드시 nPOD의 공식 견해를 반영하는 것은 아닙니다. 연구 자원을 제공하기 위해 nPOD와 파트너 관계를 맺은 장기 조달 조직(OPO)은 http://www.jdrfnpod.org/for-partners/npod-partners/ 에 나열되어 있습니다. 저자는 귀중한 기여를 해준 기증자와 그 가족에게 감사를 표합니다. 이 연구는 미국 당뇨병 협회 4-22-PDFPM(J.K.P.) 및 Leona M. and Harry B. Helmsley Charitable Trust(보조금 2015-PG-T1D-052)의 지원을 받았습니다.
Alanine | Sigma | A7627 | amino acid |
AlexaFluor 488 goat anti-guineapig | Invitrogen | A11073 | secondary antibody |
AlexaFluor 546 goat anti-rat | Thermo Fisher | A11077 | secondary antibody |
AlexaFluor 647 goat anti-mouse | Thermo Fisher | A21235 | secondary antibody |
Aprotinin | Sigma | A1153 | inhibitor |
Arginine | Sigma | A5006 | amino acid |
Calbryte 520 AM | AAT Bioquest | 20651 | Calcium dye |
Fluo4-AM | Invitrogen | F14201 | Calcium dye |
Fluorescein diacetat | Sigma | F7378 | viability marker |
Glucagon | Sigma | G2654 | primary antibody |
Glucagon ELISA (human kit) | Mercodia | 10-1271-01 | ELISA for hormone detection |
Glutamine | Sigma | G3126 | amino acid |
Insulin | Dako | A-0546 | primary antibody |
Insulin ELISA (human) | Mercodia | 10-1113-01 | ELISA for hormone detection |
Low melting point agarose | Sigma | A9414 | |
LSM 900 | Zeiss | confocal microscope | |
Pancreas Slice Chamber | Biorep Technologies | PERI-PSC-001 | slice chamber for perifucion |
Pancreas Slice Chamber Extender Kit | Biorep Technologies | PERI-PSC-EXT | slice chamber for perifucion |
Pancreas Slice Chamber Perforated Plate | Biorep Technologies | PERI-PSC-PP | slice chamber for perifucion |
Perifusion system with automated tray handling | Biorep Technologies | PERI4-02-230-FA | |
Propidium iodide | Life technologies | P1304MP | dead marker |
Semi-automatic vibratome VT1200S | Leica | 14048142066 | |
Somatostatin | Millipore | MAB354 | primary antibody |