Här beskriver vi en procedur som möjliggör organomfattande detektion av patogena bakterier under infektion och kvantifiering av fluorescerande reporteraktiviteter.
De flesta infektioner sker i tredimensionella värdvävnader med invecklad anatomi och lokalt varierande värdfysiologi. Positioneringen av patogena celler i denna mångsidiga miljö påverkar avsevärt deras stressnivåer, svar, öde och bidrag till den övergripande utvecklingen av sjukdomen och behandlingsmisslyckandet. På grund av de tekniska svårigheterna att lokalisera μm-stora patogenceller i cm-stora värdorgan har detta forskningsområde varit relativt outforskat. Här presenterar vi en metod för att ta itu med denna utmaning. Vi använder seriell tvåfotontomografi och AI-förbättrad bildanalys för att lokalisera enskilda salmonellaceller i hela mjälten, leverloberna och hela lymfkörtlarna hos infekterade möss. Med hjälp av fluorescerande rapportörer och administrering av antikroppar in vivo kan replikationshastigheten för enskilda salmonellaceller , deras lokala interaktion med specifika immunceller och bakteriella svar på antibiotika bestämmas. Dessa metoder öppnar vägar för en omfattande undersökning av infektioner, deras förebyggande och behandling inom den tredimensionella vävnadskontexten.
Infektioner förekommer i vävnader med komplex anatomi och uppdelad fysiologi. De olika mikromiljöer som samexisterar i den infekterade vävnaden kan bestämma ödet för lokala patogener och deras bidrag till det totala sjukdomsutfallet 1,2,3. En omfattande 3D-kartläggning av mikrobiella patogener i cm-stora vävnader är dock fortfarande en utmaning4. Avbildning av hjärnan och andra organ är ett mycket aktivt forskningsområde med ständigt förbättrade experimentella strategier5, men många metoder saknar fortfarande den sub-μm-upplösning som skulle krävas för att identifiera bakteriella patogener i μm-storlek med säkerhet. Däremot möjliggör seriell tvåfotontomografi(STP) 6 automatiserad flerfärgad, deformationsfri avbildning av hela vävnader med sub-μm upplösning i planet, vilket ger fullständiga volymetriska datamängder. Denna metod kombinerar upprepad fysisk snittning av vävnaden med hjälp av en vibratom med intermittent tvåfotonavbildning av de framväxande blockytorna med infrarött ljus. STP-tomografi har använts i stor utsträckning för att kartlägga tunna axoner i hjärnan för att fastställa konnektivitetskartor 7,8,9,10.
STP-tomografi möjliggör också 3D-kartläggning av enskilda mikrobiella patogenceller (Salmonella, Toxoplasma) i hela den infekterade vävnaden11,12 med hjälp av en tomograf. Den andra övertonsgenerationen avslöjar kollagenhöljen runt artärer och i fibrösa band som mjältens trabekler, vilket ger ett anatomiskt sammanhang. In vivo injicerade fluorescerande antikroppar kan användas för att färga värdceller för att avslöja interaktioner mellan enskilda patogena celler och infiltrerande immunceller som neutrofiler. Här beskrivs pipelinen som involverar bearbetning av vävnaden, avbildning, sammanfogning av bildplattor med belysningskorrigering, stapling av bilder i tre dimensioner och segmentering med hjälp av maskininlärningsverktyg. Denna pipeline ger 3D-positioner för enskilda patogener, celler och mikrokolonier inom deras värdkontext. Att räkna antalet enskilda celler inom mikrokolonier är fortfarande svårt på grund av upplösningsgränser, men sådana antal kan uppskattas baserat på mikrokolonins integrerade ljusstyrka. Pipelinen kan enkelt anpassas till andra infektionsmodeller om rekombinanta GFP- eller YFP-uttryckande patogener finns tillgängliga.
Den lokala vävnadskontexten för bakteriella patogener är avgörande för att bestämma lokala värdattacker, bakteriella anpassningar, det lokala resultatet av värdpatogeninteraktioner och antimikrobiell kemoterapi, och de individuella bidragen till det övergripande sjukdomsresultatet. Att avbilda mikrometerstora bakterier i centimeterstora organ har varit utmanande. Seriell tvåfotontomografi (STP) ger tillräcklig rumslig upplösning för att detektera enskilda bakterieceller i hela organ, automatiserad snittning och avbildning och tillräcklig genomströmning (~1 organ per dag)11. Värdantigener kan färgas in vivo, men patogena celler bör uttrycka lämpliga fluorescerande proteiner för att säkerställa omfattande detektion av intracellulära patogenceller. De resulterande datamängderna (0,5-1,5 TeraByte per organ) innebär betydande utmaningar för IT-infrastrukturer för dataanalys och lagring.
Det finns flera viktiga steg i den här metoden. Först krävs en patogenstam med detekterbart och homogent uttryck av fluorescerande protein GFP eller YFP. I idealfallet används en kromosomuttryckskassett25 för att minimera fluorescensheterogenitet på grund av variation i plasmidernas kopienummer. Tillräcklig fluorescensintensitet krävs, men för höga nivåer av fluorescerande protein bör undvikas för att undvika att patogenens kondition försämras23. Lämpliga uttrycksnivåer kan erhållas genom val av en lämplig promotor och finjustering av det ribosomala bindningsstället25 eller hela den 5′ oöversatta regionen (UTR)26. För det andra bör perfusionsfixeringen innebära en initial tvätt med buffert för att avlägsna så många erytrocyter som möjligt från blodcirkulationen. Detta är särskilt viktigt för mjälte och lever (även om det är svårt att fullständigt avlägsna erytrocyter från dessa organ). Kvarvarande erytrocyter absorberar ljus i den synliga delen av spektrumet, vilket äventyrar bildkvaliteten27. För det tredje är lagring av de fasta vävnaderna i kryoprotektiviteten avgörande för att minska vävnadsautofluorescens, som är särskilt hög i inflammerade vävnader och kan överskugga den jämförelsevis svaga fluorescensen hos de patogena cellerna11. För det fjärde är den effektiva tvärbindningen av vävnaden till det omgivande agarosblocket avgörande för smidig vibratomskärning utan att vävnaden hoppar ut ur agarosblocket. För det femte måste fluorescerande signaler och deras identifiering som patogena celler verifieras oberoende med hjälp av ortogonala metoder såsom färgning med antikroppar mot patogenkomponenter (såsom lipopolysackarid för gramnegativa bakterier) och konfokalmikroskopi av de sektioner som hämtats från tomografen11. Vissa infekterade vävnader innehåller autofluorescerande partiklar med liknande form och överlappande fluorescensspektra som lätt kan misstolkas som patogena celler. För det sjätte bör mängden patogena celler i mikrokolonier jämföras med ortogonala metoder såsom konfokalmikroskopi för att bedöma noggrannheten. Den totala bakteriebelastningen baserat på dessa beräkningar bör verifieras genom jämförelse med ortogonala metoder som flödescytometri och plätering.
Viktiga modifieringar av det allmänt använda STP-protokollet inkluderar att placera ett smalt bandpassfilter 510/20 nm framför fotomultiplikatorn 211, för att minska interferensen av grön-gul autofluorescens som är särskilt stark i infekterade och inflammerade lever-, mjält- och Peyers fläckar. Den starka autofluorescensen och den ökade ljusspridningen av sådana organ jämfört med hjärnan (som dominerar andra tillämpningar av STP) genererar också ett behov av effektivare korrigering för ojämn belysning. Som en annan modifiering använder detta protokoll CIDRE-metoden22 för detta ändamål (figur 3) och AI-baserad segmentering av bakterier. Slutligen förändrades vävnadsförbehandlingen genom att inkludera ett inkubationssteg i kryoprotektiv vid -20 °C, vilket minskar vävnadens autofluorescens och därmed underlättar detektion av små patogenceller med relativt svag fluorescens11.
Felsökning kan vara nödvändig om inga patogensignaler kan detekteras, eller om segmentering ger otillräcklig känslighet (för många patogenceller missas) eller otillräcklig precision (för många bakgrundspartiklar segmenteras som patogenceller). Om autofluorescens i bakgrundsvävnad kan detekteras men det finns för få patogensignaler, kan patogenerna innehålla otillräckliga mängder fluorescerande proteiner. Detta kan testas med hjälp av konfokalmikroskopi av vävnadssnitt från samma infekterade vävnad eller flödescytometri av vävnadshomogenat19,28. Underliggande orsaker kan vara otillräckliga uttrycksnivåer eller instabilitet i uttryckskassetten. Begränsningsstrategier kan innefatta alternativa promotorer för att driva uttrycket, kodonanpassning av de gener som kodar för det fluorescerande proteinet för den patogena arten, användning av episomala konstruktioner med högre kopieantal, eller stabilisering av expressionskassetter genom kromosomal integration eller balanserad-letal komplementering29. Valet av fluorescerande protein är också viktigt, men detektion är möjlig med GFP.mut2, mWasabi, YPet och TIMERbac. Om segmenteringen är felaktig kan detta orsakas av för svag patogenfluorescens, vilket kan åtgärdas enligt beskrivningen ovan, eller för hög bakgrund av vävnadsautofluorescens. Omfattande perfusion av tvättlösning eller långvarig inkubation i lagringsbuffert omedelbart före inbäddning i agarosblocket och tomografi kan lösa dessa problem. Slutligen krävs tillräcklig träning av det neurala nätverket för exakt klassificering, men överdriven träning kan leda till överanpassning som försämrar prestandan för nya prover.
För närvarande finns det ingen annan metod som kan avbilda hela organ med tillräcklig rumslig upplösning i 3D för att detektera enskilda bakterier. Framtida förbättringar inom vävnadsrensning och light-sheet-mikroskopi kan uppnå liknande upplösning. Detta kan möjliggöra avbildning med högre hastighet och med fler fluorescerande kanaler.
En viktig begränsning av STP är pixelupplösningen i planet på ~0,5 μm och den vertikala upplösningen på 5 till 10 μm, vilket är otillräckligt för att lösa upp närbelägna bakterier, t.ex. i en tätt packad mikrokoloni. Det är dock möjligt att ta fram vävnadssnitt efter tomografi för sekundär högupplöst konfokalmikroskopi av utvalda vävnadsdelar. En annan begränsning med STP är tillgången till endast tre fluorescenskanaler, vilket begränsar antalet fluoroforer som kan avbildas samtidigt. Återigen kan sekundär analys av tillvaratagna vävnadssnitt med multiplexeringsmetoder avslöja platsen och intensiteten av många fler markörer för utvalda vävnadsdelar. Denna information kan integreras i den övergripande 3D-strukturen hos den omgivande vävnaden som bestämts med STP.
Sammanfattningsvis möjliggör detta protokoll detaljerade undersökningar av värd-patogeninteraktioner på lokal nivå och helorgannivå. Protokollet bör vara lätt att anpassa till andra patogener (förutsatt att de kan erhållas som fluorescerande stammar), andra organ och olika värdarter.
The authors have nothing to disclose.
Arbetet stöddes av Swiss National Science Foundation 310030_156818, 310030_182315 och NCCR_ 180541 AntiResist (till DB).
Chemicals | |||
Agarose Low Melt | Roth | Art. 6351.5 25g | |
Boric acid | Sigma-Aldrich | 6768-500G | |
Instant adhesive Loctite 435 | Henkel | ||
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
Poly(ethylene glycol) | Sigma-Aldrich | P5413-1kg | |
Polyvinylpyrrolidone | Sigma-Aldrich | PVP-100G | |
Sodium borohydride | Sigma-Aldrich | 71321-25g | |
Sodium hydroxide | Merck | 106453 | |
Sodium periodate | Sigma-Aldrich | 311448-100G | |
Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | 71640-250G | |
Sodium phosphate monobasic dihydrate | Sigma-Aldrich | 71500-1KG | |
Sodium tetraborate | Sigma-Aldrich | 221732-100g | |
Sucrose | AppliChem | A4734,1000 | |
Tris-buffered saline (TBS) | Merck | T5912-1L | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
Vacuum filtration 500 | TPP | TPP99250 | |
Equipment | |||
Blade | Campden Instruments Limited | 01-01-4692 | |
MAITAI Laser | Spectra-Physics | ||
Peel away plastic mold | Sigma-Aldrich | E6032-1CS | |
TissueCyte 1000 tomograph | TissueVision | ||
Antibody/dyes | |||
DAPI | Merck | D9542-5MG | |
Primary antibodies | |||
anti-LPS Salmonella, rabbit | Sifin | REF TS 1624 | |
anti-CD169-PE, clone 3D6.112 | Biolegend | 142403 | |
anti-Ly-6G-PE, clone 1A8 | Biolegend | 127608 | |
Secondary antibodies | Invitrogen | ||
chicken anti-rabbit Alexa 647 | Invitrogen | A-21443 | |
Software | Company | Version | |
Fiji | Image J | 1.54g or later | |
MATLAB | MathWorks | 2017b/2018b or later | |
Orchestrator (tomograph) | TissueVision | ||
Visualization software Imaris | Oxford Instruments | 9.9.0 or later |