Summary

Charakterisierung von Multidrug-Efflux-Systemen in Acinetobacter baumannii unter Verwendung eines Efflux-defizienten Bakterienstamms und eines Single-Copy-Genexpressionssystems

Published: January 05, 2024
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Summary

Wir beschreiben ein einfaches Verfahren zur chromosomalen Einzelkopie-Komplementierung eines Efflux-Pumpengens unter Verwendung eines mini-Tn7-basierten Expressionssystems in einen gentechnisch veränderten Efflux-defizienten Stamm von Acinetobacter baumannii. Dieses präzise genetische Werkzeug ermöglicht eine kontrollierte Genexpression, die für die Charakterisierung von Effluxpumpen in multiresistenten Krankheitserregern von entscheidender Bedeutung ist.

Abstract

Acinetobacter baumannii ist aufgrund seiner weit verbreiteten Resistenz gegen Antibiotika als anspruchsvoller gramnegativer Erreger anerkannt. Es ist entscheidend, die Mechanismen hinter dieser Resistenz zu verstehen, um neue und wirksame Therapieoptionen zu entwickeln. Leider wird unsere Fähigkeit, diese Mechanismen bei A. baumannii zu untersuchen, durch den Mangel an geeigneten Genmanipulationswerkzeugen behindert. Hier beschreiben wir Methoden zur Verwendung eines chromosomalen mini-Tn7-basierten Systems, um eine Einzelkopie-Genexpression in einem A. baumannii-Stamm zu erreichen, dem funktionelle RND-Typ-Efflux-Mechanismen fehlen. Einzelkopieninsertion und induzierbare Effluxpumpenexpression sind sehr vorteilhaft, da das Vorhandensein von RND-Efflux-Operonen auf Plasmiden mit hoher Kopienzahl von Bakterienzellen oft schlecht vertragen wird. Darüber hinaus hilft der Einbau rekombinanter mini-Tn7-Expressionsvektoren in das Chromosom eines Surrogat-A . baumannii-Wirts mit erhöhter Effluxempfindlichkeit, Interferenzen durch andere Effluxpumpen zu umgehen. Dieses System ist nicht nur für die Untersuchung uncharakterisierter bakterieller Effluxpumpen wertvoll, sondern auch für die Bewertung der Wirksamkeit potenzieller Inhibitoren, die auf diese Pumpen abzielen.

Introduction

Acinetobacter baumannii ist aufgrund seiner umfassenden Resistenz gegen alle Klassen von Antibiotika ein Krankheitserreger der Weltgesundheitsorganisation mit höchster Priorität1. Es ist ein opportunistischer Erreger, der hauptsächlich hospitalisierte, verletzte oder immungeschwächte Menschen betrifft. A. baumannii entzieht sich Antibiotika weitgehend über Effluxpumpen, wobei die relevanteste die Exporteursfamilie der Resistance-Nodulation-Division (RND)ist 2. Wenn man versteht, wie diese Effluxpumpen mechanistisch funktionieren, kann man gezielte therapeutische Optionen entwickeln.

Eine gängige Methode, um zelluläre Prozesse spezifisch zu unterscheiden, ist die genetische Manipulation. Die für genetische Studien von A. baumannii verfügbaren Werkzeuge sind jedoch begrenzt, und um das experimentelle Design weiter zu verwirren, sind klinische Isolate oft resistent gegen die Antibiotika, die routinemäßig für die Selektion bei genetischen Manipulationen verwendet werden3. Eine zweite Hürde bei der Untersuchung von Ausflusspumpen besteht darin, dass sie streng reguliert werden – oft durch unbekannte Faktoren -, was es schwierig macht, eine einzelne Pumpe genau zu isolieren und ihrer Funktion zuzuordnen4. Angesichts dieser Notwendigkeit, den Forschungswerkzeugkasten zu erweitern, haben wir ein induzierbares Mini-Tn7-basiertes, induzierbares Expressionssystem mit Einzelkopie-Insertion entwickelt, das eine Flp-Rekombinase-Zielkassette (FRT) enthält, die die Entfernung des Selektionsmarkers 5,6,7 ermöglicht (Abbildung 1). Dieses elegante Klonierungs- und Expressionssystem wurde erstmals für Pseudomonas 8,9,10 entwickelt und verwendet, um Einzelkopie-Effluxpumpenkomplemente in einen RND-Effluxpumpen-defizienten Stamm von A. baumannii (ATCC 17978::ΔadeIJK,Δ adeFGH,Δ adeAB: im Folgenden als A. baumannii AB258 bezeichnet) zu erzeugen, den wir11. Wenn man in der Lage ist, eine Effluxpumpe nach der anderen zu untersuchen und die Bakterienzellen nicht mit einer hohen Kopienexpression zu überfordern (wie es im Allgemeinen bei plasmidbasierten Expressionssystemen der Fall ist), kann man die kritischen, physiologischen Aspekte jeder Effluxpumpe mit minimaler Interferenz und reduzierten Komplikationen besser kennenlernen.

Dieser Artikel beschreibt, wie das Mini-Tn7-System verwendet wird, um ein deletiertes Gen von Interesse, die RND-Effluxpumpe adeIJK, durch eine Reihe von unkomplizierten Schritten, die im Laufe von 9 Tagen durchgeführt werden, in das Chromosom von A. baumannii AB258 zu ergänzen7. Die erste Gruppe von Schritten führt die deletierten Effluxpumpengene, die in das mini-Tn7-basierte Insertionsplasmid kloniert wurden (Abbildung 2A), an der einzelnen att-Tn7-Insertionsstelle stromabwärts des gut konservierten glmS-Gens wieder ein (Abbildung 3A). Dieser Prozess wird durch ein nicht-replikatives Helferplasmid (Abbildung 2B) erleichtert, das für die Transposase-Gene kodiert, die für die Tn7-gesteuerte Insertion benötigt werden. Die zweite Gruppe von Schritten verwendet ein Exzisionsplasmid (Abbildung 2C) zur Flp-Rekombinase-vermittelten Entfernung des Gentamicin-Gens, flankiert von FRT-Stellen (Abbildung 3B), um einen unmarkierten Stamm zu erzeugen. Obwohl dieses System verwendet wird, um die wesentlichen Rollen und möglichen Inhibitoren von RND-Effluxpumpen in Bezug auf Antibiotikaresistenz aufzuklären, kann es zur Untersuchung jedes Gens von Interesse verwendet werden.

Protocol

1. Experimentelle Vorbereitung Reinigen Sie das Plasmid pUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gm9 (Insertionsplasmid, Abbildung 2A) mit dem interessierenden Gen.HINWEIS: Hier ist das interessierende Gen adeIJK. Die endgültige Plasmidkonzentration sollte ≥100 ng/μl betragen. Reinigen Sie das Helferplasmid (pTNS2)9 und das Exzisionsplasmid (pFLP2ab)6 (Abb…

Representative Results

Das Chromosomeninsertionsverfahren dauert insgesamt nur 2 Stunden über 3 Tage, um ein Ergebnis zu sehen – Kolonien wachsen auf einer selektiven Agarplatte (Abbildung 1A-C). Die erwartete Anzahl von Kolonien auf der Transformationsplatte ist stammabhängig: Man kann 20-30 oder sogar Hunderte von Kolonien sehen, da die Insertion von Tn7 an attTn7-Stellen spezifisch und effizient ist9. Das Patchen von Transformationsplattenkolo…

Discussion

Auch wenn dieses Verfahren zur chromosomalen Insertion eines induzierbaren Einzelkopie-Genexpressionssystems in A. baumannii technisch einfach und nicht arbeitsintensiv ist, gibt es einige wichtige Schritte, die hervorgehoben werden müssen. Zunächst muss die Präparation der kompetenten Zellen so weit wie möglich auf Eis erfolgen, da die Zellen beim Austausch des Mediums durch eiskaltes Wasser zerbrechlich werden. Idealerweise werden die Zentrifugationsschritte bei 4 °C durchgeführt, aber eine Zentrifugatio…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch einen Discovery Grant des Natural Science and Engineering Council of Canada an AK unterstützt. Die in den Abbildungen verwendeten Schaltpläne werden mit BioRender.com erstellt.

Materials

0.2 mL PCR tube VWR 20170-012 For colony boil preparations and PCR reactions
1.5 mL microfuge tubes Sarstedt 72-690-301 General use
13-mL culture tubes, Pyrex Fisher 14-957K Liquid culture vessels
6x DNA loading buffer Froggabio LD010 Agarose gel electrophoresis sample loading dye
Acetic acid, glacial Fisher 351271-212 Agarose gel running buffer component
Agar Bioshop AGR003 Solid growth media
Agarose BioBasic D0012 Electrophoretic separation of PCR reaction products; used at a concentration of 0.8–2%
Agarose gel electrophoresis unit Fisher 29-237-54 Agarose gel electrophoresis; separation of PCR reaction products
Carbenicillin Fisher 50841231 Selective media
Culture tube closures Fisher 13-684-138 Stainless steel closure for 13-mL culture tubes
Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) set Biobasic DD0058 PCR reaction component; supplied as 100 mM each dATP, dCTP, dGTP, dTTP; mixed and diluted for 10 mM each dNTP
Dry bath/block heater Fisher 88860023 Isotemp digital dry bath for boil preparations
Electroporation cuvettes VWR 89047-208 2 mm electroporation cuvettes with round cap
Electroporator Cole Parmer 940000009 110 VAC, 60 Hz electroporator
Ethidium bromide Fisher BP102-1 Visualization of PCR reaction products and DNA marker in agarose gel
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) VWR CA-EM4050 Agarose gel running buffer component
Gentamicin Biobasic GB0217 For the preparation of selective media
Glycerol Fisher G33 Preparation of bacterial stocks for long-term storage in an ultra-low freezer
Incubator (shaking) New Brunswick Scientific M1352-0000 Excella E24 Incubator Shaker for liquid culture growth
Incubator (static) Fisher 11-690-550D Isotemp Incubator Oven Model 550D for solid (LB agar) culture growth
Inoculation loop Sarstedt 86.1562.050 Streaking colonies onto agar plates
Inoculation spreader Sarstedt 86.1569.005 Spreading of culture onto agar plates
Lysogeny broth (LB) broth, Lennox Fisher BP1427 Liquid growth media (20 g/L: 5 g/L sodium chloride, 10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract)
Microfuge Fisher 75002431 Sorvall Legend Micro 17 for centrifugation of samples
Mini-centrifuge Fisher S67601B Centrifugation of 0.2 mL PCR tubes
Petri dishes SPL Life Sciences 10090 For solid growth media (agar plates): 90 x 15 mm
Pipettes  Mandel Various Gilson single channel pipettes (P10, P20, P200, P1000)
Power supply Biorad 1645050 PowerPac Basic power supply for electrophoresis
Primers IDT NA PCR reaction component; specific to gene of interest; prepared at 100 μM as directed on the product specification sheet
Sucrose BioBasic SB0498 For the preparation of counterselective media for removal of the pFLP2ab plasmid from transformed A. baumannii
Taq DNA polymerase FroggaBio T-500 PCR reaction component; polymerase supplied with a 10x buffer
Thermal cycler Biorad 1861096 Model T100 for PCR
Toothpicks Fisher S24559 For patching colonies onto agar plates
Trizma base Sigma T1503 Agarose gel running buffer component
Ultrapure water Millipore Sigma ZLXLSD51040 MilliQ water purification system: ultra pure water for media and solution preparation, and cell washing
Wide range DNA marker Biobasic M103R-2 Size determination of PCR products on an agarose gel
Wooden inoculating sticks Fisher 29-801-02 Inoculating cultures with colonies from agar plates

References

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Cite This Article
White, D., Kumar, A. Characterizing Multidrug Efflux Systems in Acinetobacter baumannii Using an Efflux-Deficient Bacterial Strain and a Single-Copy Gene Expression System. J. Vis. Exp. (203), e66471, doi:10.3791/66471 (2024).

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