Biology

Fabricage van de Thermoplastic Microfluïdische Kanalen

Published: February 3, 2008 doi: 10.3791/664

Arpita Bhattacharyya¹, Dominika Kulinski¹, Catherine Klapperich¹

¹Department of Biomedical Engineering, Boston University

Summary

Hier laten we zien hoe thermoplastische microfluïdische chips met behulp van hete embossing en warmte afdichting fabriceren. Dan laten we zien hoe de in situ licht gericht oppervlak enten en polymerisatie gebruik door de afgesloten chip aan de composiet vaste fase kolommen te vormen.

Abstract

In ons lab hebben we met succes geïsoleerde nucleïnezuren direct van microliter en submicroliter volumes van menselijk bloed, urine en ontlasting met behulp van polymeer / nanodeeltjes composiet microschaal lysis en vaste fase extractie kolommen. De herstelde monsters worden geconcentreerd, klein volume monsters die zijn PCRable, zonder extra schoonmaakbeurt. Hier laten we zien hoe om thermoplastische microfluïdische chips met behulp van hete embossing en warmte afdichting fabriceren. Dan laten we zien hoe de in situ licht gericht oppervlak enten en polymerisatie gebruik door de afgesloten chip aan de composiet vaste fase kolommen te vormen. Tonen we enten en polymerisatie van een koolstof nanobuisje / polymeer composiet kolom voor bacteriële cel lysis. Vervolgens hebben we tonen de lysis proces gevolgd door een vaste-fase extractie van nucleïnezuren uit de steekproef op de chip met behulp van een silica / polymeer composiet kolom. De bijgevoegde protocollen bevat gedetailleerde instructies over hoe om zowel lysis en vaste fase extractie kolommen te maken.

Protocol

De microfluïdische kanalen zijn vervaardigd in een cyclische polyolefine (Zeonex ® 690R, Zeon Chemical Inc, Louisville, KY). Zeonex heeft een glas-transitie temperatuur (T _g) van 136 ° C en is UV transparant, die essentieel is voor het licht gericht chemie gebruikt in de poreuze monoliet formatie. De microkanalen worden vervaardigd door micro-hot-embossing met een NiCo electroformed meester-schimmel, die de negatieve (omgekeerde) kenmerken van de microfluïdische platform heeft. De hot-embossing gaat als volgt:

De mal en het polymeer substraat worden geplaatst tussen twee parallelle metalen platen.
De platen worden verwarmd tot de embossing temperatuur (166 ° C), dat is 30 º C boven de _Tg van Zeonex.
De platen worden vervolgens geperst samen voor ongeveer 5 min en de druk wordt gehandhaafd op 250 psi.
De mal en de ondergrond worden vervolgens verwijderd uit de verwarmde platen, laten afkoelen voor 1-2 min, en vervolgens handmatig van elkaar gescheiden.
Putten van 1,5 mm diameter worden geboord aan de uiteinden van de kanalen voor de sample introductie en collectie.
Het reliëf plastic substraat wordt vervolgens thermisch gebonden met een ander stuk van Zeonex op ingesloten microfluïdische kanalen vormen. Het reliëf ondergrond en het deksel stuk kan UV-ozon of plasma voorafgaand aan de thermische binding behandeld om de afdichting efficiency te verbeteren en de trouw van de bijgevoegde kanaal structuur (Bhattacharyya en Klapperich, 2007) te garanderen.

Fabricage van solid-phase extractie (SPE) kolom binnen de kunststof microfluïdische kanalen

Fabricage van de vaste fase is een proces in twee stappen. In het begin van de gefabriceerde microkanalen zijn oppervlakte gewijzigd om de hechting van de SPE kolom te verbeteren om de plastic apparaat. Enten via het oppervlak fotopolymerisatie wordt gebruikt om de muren van het polymère microkanalen functionaliseren.

Het enten procedure is als volgt:

De microkanalen zijn gevuld met een 1:1 mengsel van ethyleen diacrylaat (EDA) en methylmethacrylaat (MMA) met 3% benzofenon, dat is een waterstof-abstraherende foto-initiator. Het EDA, MMA en benzofenon worden ingekocht bij Sigma-Aldrich, St. Louis, MO.
De chip wordt dan UV-bestraald gedurende 10 min bij 254 nm golflengte van UV en 200 mJ / cm ^2-energie in een blootstelling aan ultraviolet licht instrument (CL-1000 UV Crosslinker, UPV Inc, Upland, CA). Het enten gebeurt via H-abstractie polymerisatie en resulteert in een oppervlakte-tethered polymeerketens, die je opgenomen in het polymerisatiemengsel gebruikt voor de bereiding van de monoliet in de tweede stap.
De overmaat monomeer wordt verwijderd uit de kanalen door te spoelen met 15 pi van methanol met behulp van vacuüm aspiratie.

Na het photografting proces, is een microporeuze polymeer monoliet gevormd binnen de microkanalen die vangen de silica deeltjes voor DNA-extractie. De poreuze monoliet is bereid in situ als volgt:

Het oppervlak aangepaste kanalen zijn gevuld met een mengsel bestaande monoliet voorloper van Buma (15% gew), EDMA (10% wt), 1-dodecanol (52,5% wt), cyclohexanol (22,5% wt), DMPAP (1% gew met respect monomeren) en 0,7 micrometer silica deeltjes (15% ten opzichte van het totale volume van de pre-polymeer-mengsel). De silica microsferen werden gekocht van Polysciences, Inc (Warrington, PA) en de monomeren en porogenic oplosmiddelen zijn gekocht bij Sigma-Aldrich, St. Louis, MO.
De chip wordt bestraald met UV in de UV-crosslinker bij 200 mJ / cm ² voor 1,1 min tot polymerisatie te initiëren, en de overmaat monomeer wordt verwijderd uit de kanalen door te spoelen met 15 pi van methanol met behulp van vacuüm aspiratie.
De vloeibare verbindingen (NanoPorts ^{TM-aansluitingen,} Upchurch Scientific, Oak Harbor, WA) worden vervolgens bevestigd aan de introductie en opvangputten van de microfluïdische kanalen.
De poreuze monoliet is dan weer gewassen met methanol gedurende minstens 30 minuten met behulp van de spuit pomp met een debiet van 100mL/hour.

Fabricage van CNT lysis monoliet in het plastic microfluïdische kanalen

Fabricage van de CNT (koolstof nanobuisje) lysis monoliet is een proces in twee stappen. Ten eerste, de gefabriceerde microkanalen zijn oppervlakte-gemodificeerde (geënt) op dezelfde wijze als voor de SPE kolommen in de plastic apparaat.

Na het photografting proces, is een microporeuze polymeer monoliet gevormd binnen de microchannel die is geïmpregneerd met multi-walled carbon nanotubes. De poreuze monoliet is bereid in situ als volgt:

Meerwandige nanobuisjes zijn geresuspendeerd in cyclohexanol bij een concentratie van 2.27M. Dit resuspensie is ultrasonicated gedurende 30 minuten op 50% amplitude en 50% duty cycle met een sonifier cel disruptor (Sonifier S-250D, vervaardigd door Branson Ultrasonic, Danbury, CT). De ultrasoonapparaat voorzien van een doeltreffend en stabiele 0,5 M opschorting van de CNTs. De CNTs werden gekocht bij Nanolabs (Brighton, MA).
Het oppervlak aangepaste kanalen zijn gevuld met een soortgelijke monoliet precursormengsel behalve dat nu de oplossing van cyclohexanol + CNTs wordt gebruikt. De monoliet mengsel bestaat van Buma (15% gew), EDMA (10% wt), 1-dodecanol (52,5% wt), en cyclohexanol + CNTs (22,5% gew). Aan deze oplossing de foto-initiator DMPAP wordt toegevoegd (1,13% gew met betrekking tot de monomeren). De monomeren, porogenic oplosmiddelen en DMPAPA worden ingekocht bij Sigma-Aldrich, St. Louis, MO.
De chip wordt bestraald met UV in de UV-crosslinker bij 120 mJ / cm ² voor 0,9 min tot polymerisatie te initiëren. Het apparaat is 180 graden omgedraaid in de crossliker en bestraald voor een andere 0,9 min bij 120 mJ / cm ^2. De overmaat monomeer wordt verwijderd uit de kanalen door te spoelen met 50 ul van methanol met behulp van vacuüm aspiratie.
De vloeibare verbindingen (NanoPorts ^{TM-aansluitingen,} Upchurch Scientific, Oak Harbor, WA) worden vervolgens bevestigd aan de introductie en opvangputten van de microfluïdische kanalen.

Bacteriële Monstervoorbereiding voor gebruik met de CNT lysis monoliet

Het monster voorbereiding voor een bacteriële monster impliceert het nemen van een optische dichtheid meting bij 600 nm om ervoor te zorgen dat het monster niet is uitermate zo geconcentreerd te voorkomen verstopping van het kanaal.

Neem een OD lezen bij 600 nm met de bacteriën in de media, wordt dit gedaan met een biophotometer (Eppendorf BioPhotometer, Eppendorf Scientific, Inc, Westbury, NY). Verdun het monster tot de OD waarden vallen binnen het bereik 0.18-0.25 A.
Centrifugeer het monster bij 6500 rpm gedurende 5 minuten en decanteer het supernatant.

Lysis

Resuspendeer bacteriën in GuSCN * + 0,01% SDS + 4% proteïnase K (0.8mg/ml). Vortex kort (1 ml van bacteriën in de media moet worden gesuspendeerd in 1 ml GuSCN). Proteinase K werd toegevoegd aan de oplossing voor steun met denatureren eiwitten die verbonden zijn aan het bacteriële DNA en DNAases en RNAases remmen. Een bijkomend voordeel van het proteinase K is dat het ook helpt met het afbreken van de cellulaire eiwitten die muur is wenselijk omdat zowel gram-positieve bacteriën en Gram-negatieve bacteriën celwanden bevatten grote hoeveelheden eiwit (hoewel gram-negatieve bacteriën hebben meestal meer eiwit ). De chaotrope buffer helpt bovendien de proteïnase K met denatureren eiwitten, terwijl de detergent verstoort de celwand. Proteinase K en guanidiniumthiocyanaat (GuSCN) werden gekocht bij Qiagen Inc (Valencia, CA). SDS (natriumdodecylsulfaat) werd gekocht van Pierce (Rockford, IL).
Onmiddellijk belasting het monster in een spuit is aangesloten op PEEK-buizen. Aspireren de spuit zodat er geen lucht in het systeem. Sluit de slang aan op de nanoport en het kanaal.

Een KDS100 injectiepomp (vervaardigd door KD Scientific, Holliston, MA) werd gebruikt voor de experimenten en het gebruikte debiet is 450 pL / uur voor alle stappen. Debiet van het monster lysis kanaal op 450ul/hr.

Verzamel het monster en overgaan tot de DNA-extractie via SPE (zie DNA-extractie protocol). LET OP: Deze bacteriële monster niet hoeft te laden stap 2 volgen, omdat de schorsing is GuSCN *.

DNA-extractie protocol

De extractie procedure bestaat uit drie stappen:

Belasting.
Wash
Elueren.

KDS100 injectiepomp (vervaardigd door KD Scientific, Holliston, MA) werd gebruikt voor de experimenten en de gebruikte stroom bedroeg 300 pL / uur voor alle stappen.

Belasting

Toestand van het kanaal met chaotrope buffer (GuSCN ^*, guanidiniumthiocyanaat) voor 1-2 minuten voordat het experiment.
Meng het monster met chaotrope buffer in 1:1 verhouding.
Bemonsteringsstromen mengsel door het kanaal voor 3 minuten.

Wassen