Summary
Aquí se demuestra cómo fabricar chips de microfluidos con termoplástico estampado en caliente y sellado por calor. Luego se muestra cómo utilizar la luz en la superficie in situ dirigidos injerto y la polimerización a través del chip sellado para formar las columnas compuestas en fase sólida.
Abstract
En nuestro laboratorio, hemos logrado ácidos nucleicos aislados directamente de los volúmenes de microlitro y submicroliter de la sangre humana orina y las heces con polímero / nanopartículas compuestas lisis micro y sólidas columnas de extracción en fase. Las muestras recuperadas son muestras de concentrado, pequeño volumen que se PCRable, sin ningún tipo de limpieza adicional. En este sentido, se muestra cómo fabricar chips de microfluidos con termoplástico estampado en caliente y sellado por calor. Luego, se demuestra cómo utilizar la luz en la superficie in situ dirigidos injerto y la polimerización a través del chip sellado para formar las columnas compuestas en fase sólida. Demostramos injerto y la polimerización de un nanotubo de carbono / polímero columna compuesta para la lisis celular de las bacterias. A continuación, muestran el proceso de lisis seguido de la extracción en fase sólida de los ácidos nucleicos de la muestra en el chip con un contenido de sílice / columna de compuesto de polímero. Los protocolos adjuntos contienen instrucciones detalladas sobre cómo hacer que tanto la lisis y la extracción en fase sólida columnas.
Protocol
Los canales de microfluidos son fabricados en una poliolefina cíclica (Zeonex ® 690R, Zeon Chemical Inc., Louisville, KY). Zeonex tiene una temperatura de transición vítrea (Tg) de 136 ° C y UV es transparente, lo cual es esencial para la química de la luz dirigida utilizado en la formación monolito porosa. Los microcanales son fabricados por micro-estampado en caliente con una NiCo electroformada maestro de molde, que tiene la negativa (inversa) características de la plataforma de microfluidos. El estampado en caliente se realiza de la siguiente manera:
- El molde y el sustrato de polímero se colocan entre dos placas metálicas paralelas.
- Los platos se calientan hasta la temperatura de estampación (166 ° C), que es de 30 º C por encima de la Tg de Zeonex.
- Los platos se prensan junto durante unos 5 min y la presión se mantiene a 250 psi.
- El molde y el sustrato se retiran de las placas se calienta, se deja enfriar durante 1-2 minutos, y luego manualmente separados unos de otros.
- Pozos de diámetro de 1,5 mm son perforados en los extremos de los canales para la introducción de la muestra y recolección.
- El sustrato de plástico en relieve es entonces adherido térmicamente con otro pedazo de Zeonex formulario adjunto a los canales de microfluidos. El sustrato en relieve y la pieza de la cubierta se puede UV-ozono o plasma tratado antes de la unión térmica para mejorar la eficiencia de sellado y garantizar la fidelidad de la estructura del canal cerrado (Bhattacharyya y Klapperich, 2007).
Fabricación de extracción en fase sólida (SPE) de columna dentro de los canales de microfluidos de plástico
La fabricación de la fase sólida es un proceso de dos pasos. Al principio, los microcanales son fabricados superficie modificada con el fin de mejorar la adherencia de la columna de la SPE en el dispositivo de plástico. Injerto a través de fotopolimerización superficie se utiliza para funcionalizar las paredes de los microcanales poliméricos.
El procedimiento de injerto es el siguiente:
- Los microcanales se llena con una mezcla de 1:1 de diacrilato de etileno (EDA) y metacrilato de metilo (MMA) con 3% de benzofenona, que es un fotoiniciador de hidrógeno abstracción. La EDA, MMA y benzofenona son adquiridos de Sigma-Aldrich, St. Louis, MO.
- El chip es entonces irradiados con UV durante 10 minutos a 254 nm de longitud de onda UV y 200 mJ / cm 2 de la energía en un instrumento de la exposición ultravioleta (CL-1000 Crosslinker UV, UPV Inc., Upland, CA). El injerto se produce a través de la polimerización abstracción de H y los resultados de las cadenas de polímero anclada en la superficie, que se incorporan en la mezcla de polimerización utilizada para la preparación del monolito en el segundo paso.
- El monómero se elimina el exceso de los canales de lavado con 15 l de metanol con aspiración al vacío.
Después del proceso de photografting, un polímero microporoso monolito se forma dentro de los microcanales que atrapan las partículas de sílice para la extracción de ADN. El monolito porosa se prepara in situ de la siguiente manera:
- Los canales de superficie modificada se llena con una mezcla de precursores monolito compuesto de Buma (15% en peso), EDMA (10% en peso), 1-dodecanol (52,5% en peso), ciclohexanol (22,5% en peso), DMPAP (en peso del 1% con respecto a los monómeros) y 0,7 micras partículas de sílice (15% con respecto al volumen total de la mezcla de pre-polímero). El microesferas de sílice fueron adquiridos de Polysciences, Inc. (Warrington, PA) y los monómeros y disolventes porogenic son adquiridos de Sigma-Aldrich, St. Louis, MO.
- El chip se irradia con luz UV en el reticulador UV a 200 mJ / cm 2 de 1.1 minutos para iniciar la polimerización, el monómero y se elimina el exceso de los canales de lavado con 15 l de metanol con aspiración al vacío.
- Las conexiones de fluidos (NanoPorts conexiones TM, Upchurch Scientific, Oak Harbor, WA) se unen después de la introducción y pozos de captación de los canales de microfluidos.
- El monolito porosa se lava de nuevo con metanol durante un mínimo de 30 minutos utilizando la bomba de jeringa con un caudal de 100mL/hour.
Fabricación de CNT lisis monolito dentro de los canales de microfluidos de plástico
La fabricación de la lisis CNT monolito (nanotubos de carbono) es un proceso de dos pasos. En primer lugar, los microcanales son fabricados superficie modificada (injertados) en la misma forma que para las columnas de SPE en el dispositivo de plástico.
Después del proceso de photografting, un polímero microporoso monolito se forma dentro del microcanal que está impregnado con nanotubos de carbono de pared múltiple. El monolito porosa se prepara in situ de la siguiente manera:
- Multi-nanotubos se resuspenden en ciclohexanol a una concentración de 2.27m. Esta es la resuspensión ultrasonicated durante 30 minutos a 50% de la amplitud y el 50% ciclo de trabajo con una célula Sonifier disruptor (Sonifier S-250D, fabricado por ultrasonidos Branson, Danbury, CT). Los ultrasonidos proporcionan una suspensión de 0,5 eficaz y estable de la CNT. Los nanotubos de carbono fueron adquiridos de Nanolabs (Brighton, MA).
- Los canales de superficie modificada se llena con una mezcla de precursores similares monolito sólo que ahora la solución de ciclohexanol + CNT se utiliza. La mezcla consiste monolito de Buma (15% en peso), EDMA (10% en peso), 1-dodecanol (52,5% en peso), y ciclohexanol + CNT (22,5% en peso). A esta solución la DMPAP fotoiniciador se añade (1,13% en peso con respecto a los monómeros). Los monómeros, disolventes y porogenic DMPAPA son adquiridos de Sigma-Aldrich, St. Louis, MO.
- El chip se irradia con luz UV en el reticulador UV a 120 mJ / cm 2 para 0,9 minutos para iniciar la polimerización. El dispositivo se voltea 180 grados en la crossliker e irradiado por otros 0,9 minutos a 120 mJ / cm 2. El monómero se elimina el exceso de los canales de lavado con 50 l de metanol con aspiración al vacío.
- Las conexiones de fluidos (NanoPorts conexiones TM, Upchurch Scientific, Oak Harbor, WA) se unen después de la introducción y pozos de captación de los canales de microfluidos.
Preparación de muestras de bacterias para su uso con CNT lisis monolito
La preparación de la muestra para una muestra bacteriana consiste en tomar una medida de la densidad óptica a 600 nm para asegurar que la muestra no es muy concentrada con el fin de evitar la obstrucción del canal.
- Tome una lectura de DO a 600 nm con la bacteria en los medios de comunicación, esto se hace con un BioPhotometer (Eppendorf BioPhotometer, Eppendorf Scientific, Inc., Westbury, NY). Diluir la muestra hasta que las lecturas de OD dentro del rango 0.18-0.25 A.
- Centrifugar la muestra a 6500 rpm durante 5 minutos y decantar el sobrenadante.
Lisis
- Resuspender las bacterias en GuSCN * + 0.01% SDS + 4% proteinasa K (0.8mg/ml). Agitar brevemente (1 ml de bacterias en los medios de comunicación deben ser resuspendido en 1 ml GuSCN). Proteinasa K fue agregado a la solución para ayudar con la desnaturalización de las proteínas que se unen al ADN bacteriano y para inhibir la DNAases y RNAases. Un beneficio adicional de la proteinasa K es que también ayuda a romper las proteínas de la pared celular, lo que es deseable, ya que tanto bacterias gram-positivas y gram-negativos paredes celulares de las bacterias contienen grandes cantidades de proteínas (aunque bacterias gram-negativas suelen tener más proteínas ). El buffer caotrópico además ayuda a la proteinasa K con desnaturalización proteínas, mientras que el detergente rompe la pared celular. Proteinasa K y tiocianato de guanidinio (GuSCN) fueron adquiridos de Qiagen Inc. (Valencia, CA). SDS (dodecil sulfato de sodio) fue adquirido de Pierce (Rockford, IL).
- Inmediatamente la carga de la muestra en una jeringa conectada a un tubo PEEK. Aspirar la jeringa para que no haya aire en el sistema. Conecte el tubo a la NanoPort y el canal.
Una bomba de jeringa KDS100 (fabricado por KD Scientific, Holliston, MA) fue utilizado para los experimentos y el caudal utilizado es de 450 l / h para todos los pasos. El flujo del canal de la lisis de la muestra en 450ul/hr.
- Recoger la muestra y proceder a la extracción de ADN a través de la SPE (véase el protocolo de extracción de ADN). NOTA: Esta muestra bacteriana no tendrá que seguir el paso de carga 2, ya que la suspensión es GuSCN *.
Protocolo de extracción de ADN
El procedimiento de extracción consiste en tres pasos:
- De carga.
- Washington
- Eluir.
Bomba de jeringa KDS100 (fabricado por KD Scientific, Holliston, MA) fue utilizado para los experimentos y la velocidad de flujo usada fue de 300 l / h para todos los pasos.
Carga
- La condición del canal con buffer caotrópico (GuSCN *, tiocianato de guanidinio) durante 1-2 minutos antes de comenzar el experimento.
- Mezclar la muestra con tampón caotrópico en proporción de 1:1.
- El flujo de mezcla de la muestra a través del canal durante 3 min.
Lavar
- Lavar el canal con el 70% de etanol durante 2 min.
- Lavar el canal con etanol al 100% durante 2 min.
Eluir
- Eluir el ADN extraído en agua Millipore durante 3 min. Recoge 15 l de agua purificada, lista para PCR de ADN.
* El GuSCN del kit de Qiagen (Buffer RLT) se utilizó.
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References
- Bhattacharyya, A., Klapperich, C. M. Mechanical and chemical analysis of plasma and ultraviolet-ozone surface treatments for thermal bonding of polymeric microfluidic devices. Lab Chip. 7, 876-882 (2007).
