Tillverkning av termoplast mikroflödessystem kanaler

Summary

Här visar vi hur du tillverka termoplast mikroflödessystem marker med varmpressning och svetsning. Då kan vi visa hur man använder in situ riktat ljus yta ympning och polymerisation igenom en sluten krets för att bilda sammansatta fasta fasen kolumner.

Abstract

I vårt labb har vi isolerat framgångsrikt nukleinsyror direkt från mikroliter och submicroliter mängder av blod, urin och avföring med hjälp av polymer / nanopartiklar komposit mikroskala lysering och fast fas kolumner extraktion. Den återvunna proverna är koncentrerade, liten volym prov som PCRable, utan ytterligare sanering. Här visar vi hur man kan tillverka termoplast mikroflödessystem marker med varmpressning och svetsning. Sedan visar vi hur man använder in situ riktat ljus yta ympning och polymerisation igenom en sluten krets för att bilda sammansatta fasta fasen kolumner. Vi visar ympning och polymerisering av en Nanorör / polymerkomposit kolumnen för bakteriell cellslys. Vi visar då lys processen följt av fast fas extraktion av nukleinsyror från provet på chip med en kvarts / polymerkomposit kolumn. Den bifogade protokollen innehåller detaljerade instruktioner om hur man gör både lys och fast fas kolumner extraktion.

Protocol

Den mikroflödessystem kanaler tillverkas i en cyklisk polyolefin (Zeonex ® 690R, Zeon Chemical Inc., Louisville, KY). Zeonex har en glas-övergången temperatur (T _g) i 136 ° C och är UV-transparent, vilket är väsentligt för riktat ljus kemi används i porösa monolit bildas. De mikrokanaler tillverkas av mikro-hot-prägling med Nico electroformed master-mögel som har negativa (omvänt) funktioner i mikroflödessystem plattformen. Den hot-prägling sker enligt följande:

1. Formen och polymera substrat är placerade mellan två parallella metall plattor.
2. De plattor värms upp till prägling temperatur (166 ° C), som är 30 ° C över T _g Zeonex.
3. De plattor sedan pressas samman ca 5 min och trycket bibehålls vid 250 psi.
4. Formen och substratet sedan bort från den uppvärmda plattor, svalna i 1-2 minuter, och sedan manuellt separerade från varandra.
5. Wells av 1,5-mm diameter borras i ändarna av kanalerna för prov introduktion och samling.
6. Den präglade plasten Därefter sker termiskt bunden med en annan bit av Zeonex att bilda slutna mikroflödessystem kanaler. Den präglade substrat och locket pjäs kan vara UV-ozon eller plasma behandlats före termisk bindning för att öka tätningsförmåga och se till trohet i det bifogade kanalen struktur (Bhattacharyya och Klapperich, 2007).

Tillverkning av fast-fas extraktion (SPE) kolumn i plast mikroflödessystem kanaler

Tillverkning av fast fas är en process i två steg. Först de påhittade mikrokanaler är ytmodifierade för att förbättra vidhäftningen av SPE kolumnen till plast-enheten. Ympning via yta photopolymerization används för att functionalize väggarna i polymera mikrokanaler.

Den ympning Förfarandet är följande:

1. De mikrokanaler är fyllda med en 1:1 blandning av eten diacrylate (EDA) och metylmetakrylat (MMA) med 3% bensofenon, vilket är en väte abstrahera fotoinitiator. Europeiska försvarsbyrån, MMA och bensofenon köps från Sigma-Aldrich, St Louis, MO.
2. Chipet är då UV-bestrålning i 10 min vid 254 nm UV-våglängdsområdet och 200 mJ / cm ² energi i en ultraviolett exponering instrument (CL-1000 UV Crosslinker, UPV Inc., Upland, CA). Den ympning sker via H-abstraktion polymerisation och resulterar i yt-bundna polymerkedjorna, som får sitt säte inom polymerisation blandningen som används för framställning av monolit i det andra steget.
3. Överskottet monomer tas bort från de kanaler genom att skölja med 15 mikroliter av metanol med hjälp av vakuumaspiration.

Efter photografting processen, är en mikroporös polymer monolit bildas inom mikrokanaler att snärja den kiselpartiklar för DNA-extraktion. Den porösa monolit är beredd på plats enligt följande:

1. Ytan ändrade kanalerna är fyllda med en monolit föregångare blandning bestående av BUMA (15% WT), EDMA (10% WT), 1-dodecanol (52,5% WT), cyklohexanol (22,5% WT), DMPAP (1% wt med respekt till monomerer) och 0,7 ìm partiklar kiseldioxid (15% i förhållande till den totala volymen av före-polymer blandning). Den kvarts mikrosfärer köptes från Polysciences, Inc. (Warrington, PA) och de monomerer och porogenic lösningsmedel köps från Sigma-Aldrich, St Louis, MO.
2. Chipet bestrålas med UV i UV crosslinker vid 200 mJ / cm ² för 1,1 minuter att initiera polymerisation, och överskottet monomer tas bort från de kanaler genom att skölja med 15 mikroliter av metanol med hjälp av vakuumaspiration.
3. Den fluidic anslutningarna (NanoPorts ^TM anslutningar, Upchurch Scientific, Oak Harbor, WA) bifogas sedan införandet och brunnar insamling av mikroflödessystem kanaler.
4. Den porösa monolit är sedan tvättas igen med metanol i minst 30 min med sprutan pumpen vid ett flöde av 100mL/hour.

Tillverkning av CNT lysering monolit i plast mikroflödessystem kanaler

Tillverkning av CNT (Nanorör) lys monolit är en process i två steg. För det första fabricerade mikrokanaler är ytmodifierade (ympade) på samma sätt som för SPE kolonner i plasten enheten.

Efter photografting processen, är en mikroporös polymer monolit bildas inom mikrokanalplatta som är impregnerat med Flerväggiga kolnanorör. Den porösa monolit är beredd på plats enligt följande:

1. Flerväggiga nanorör är suspenderade i cyklohexanol vid en koncentration av 2.27M. Denna resuspension är ultraljudsbehandlar i 30 minuter vid 50% amplitud och 50% duty cycle med en sonifier cell disruptor (Sonifier S-250D, som tillverkas av Branson ultraljud, Danbury, CT). Den sonication utgör en effektiv och stabil 0,5 suspension av cnts. Den cnts köptes från Nanolabs (Brighton, MA).
2. Ytan ändrade kanalerna är fyllda med en liknande monolit föregångare blandning förutom att nu är lösningen på cyklohexanol + är cnts används. Den monolit Blandningen består av BUMA (15% WT), EDMA (10% WT), 1-dodecanol (52,5% WT), och cyklohexanol + cnts (22,5% WT). Till denna lösning fotoinitiator DMPAP läggs (1,13 vikt-% i förhållande till monomerer). Monomererna, porogenic lösningsmedel och DMPAPA köps från Sigma-Aldrich, St Louis, MO.
3. Chipet bestrålas med UV i UV crosslinker vid 120 mJ / cm ² för 0,9 minuter att initiera polymerisation. Enheten är vänt 180 grader i crossliker och bestrålat för ytterligare 0,9 min vid 120 mJ / cm ^2. Överskottet monomer tas bort från de kanaler genom att skölja med 50 mikroliter av metanol med hjälp av vakuumaspiration.
4. Den fluidic anslutningarna (NanoPorts ^TM anslutningar, Upchurch Scientific, Oak Harbor, WA) bifogas sedan införandet och brunnar insamling av mikroflödessystem kanaler.

Bakteriell Provberedning för användning med CNT lys monolit

Provet förberedelse för en bakteriell prov innebär att man tar en optisk densitet mätning vid 600 Nm för att säkerställa att provet inte är extremt koncentrerad för att undvika igensättning kanalen.

1. Ta en OD läsning på 600 Nm med bakterier i media, görs detta med en biophotometer (Eppendorf BioPhotometer, Eppendorf Scientific, Inc., Westbury, NY). Späd provet tills OD avläsningar faller inom intervallet 0,18-0,25 A.
2. Centrifugera provet vid 6500 rpm i 5 minuter och dekantera supernatanten.

Lys

1. Resuspendera bakterier i GuSCN * + 0,01% SDS + 4% proteinas K (0.8mg/ml). Vortex kort (1 ml av bakterier i medier bör resuspenderas i 1 ml GuSCN). Proteinas K lades till lösningen på stöd med denaturera proteiner som är knutna till bakteriens DNA och hämma DNAases och RNAases. En ytterligare fördel av det proteinas K är att den också stöd med att bryta ner de cellulära muren proteiner som är önskvärt eftersom både grampositiva bakterier och gramnegativa bakterier väggarna cell innehåller stora mängder protein (även gramnegativa bakterier vanligtvis har mer protein ). Den chaotropic buffert hjälpmedel dessutom det proteinas K med denaturera proteiner medan tvättmedel stör cellväggen. Proteinas K och guanidinium tiocyanat (GuSCN) köptes från Qiagen Inc. (Valencia, CA). SDS (natriumdodecylsulfat) köptes från Pierce (Rockford, IL).
2. Omedelbart belastning provet i en spruta kopplad till PEEK slang. Sug på sprutan så att ingen luft i systemet. Anslut slangen till nanoport och kanal.

En KDS100 sprutpump (tillverkad av KD vetenskapliga, Holliston, MA) användes för experiment och flödet som används är 450 ml / timme för alla steg. Flow kanalen lysering av prov på 450ul/hr.

1. Samla provet och gå vidare till DNA-extraktion via SPE (se protokoll DNA-extraktion). OBS: Denna bakterie prov behöver inte följa Ladda steg 2, eftersom suspension GuSCN *.

DNA-extraktion Protokoll

Det extraktionsförfarande består av 3 steg:

1. Ladda.
2. Wash
3. Eluera.

KDS100 sprutpump (tillverkad av KD vetenskapliga, Holliston, MA) användes för experiment och flödet som användes var 300 ml / timme för alla steg.

Load

1. Villkor kanalen med chaotropic buffert (GuSCN ^*, guanidinium tiocyanat) i 1-2 minuter innan du startar experimentet.
2. Blanda provet med chaotropic buffert i förhållandet 1:1.
3. Flöde prov blandningen genom den kanal i 3 min.

Tvätta

1. Tvätta kanal med 70% etanol i 2 min.
2. Tvätta kanal med 100% etanol i 2 min.

Eluera

1. Eluera extraherade DNA i Millipore vatten i 3 min. Samla 15 mikroliter av renat, PCR-klar DNA.

* Den GuSCN från Qiagen satsen (buffert RLT) använts.