Termoplastik mikroakışkan Kanallar imalatı

Summary

Burada sıcak kabartma ve ısı sızdırmazlık kullanarak termoplastik mikroakışkan cips nasıl imal göstermektedir. Sonra kompozit katı faz sütunları oluşturmak için mühürlü çip aracılığıyla yerinde ışık aşılama yüzey ve polimerizasyon nasıl kullanılacağını göstermektedir.

Abstract

Laboratuvarda başarıyla doğrudan polimer / nanoparçacık kompozit microscale lizis ve katı faz ekstraksiyon sütunları kullanarak insan kan, idrar ve dışkı mikrolitrelik ve submicroliter birimleri nükleik asitlerin, izole var. Kurtarılan örnekleri herhangi bir ek temizleme olmadan, PCRable konsantre, küçük hacimli örnekleri vardır. Burada, nasıl sıcak kabartma ve ısı sızdırmazlık kullanarak termoplastik mikroakışkan cips imal göstermektedir. Sonra, kompozit katı faz sütunları oluşturmak için mühürlü çip aracılığıyla yerinde ışık aşılama yüzey ve polimerizasyon nasıl kullanılacağını göstermektedir. Biz aşılama ve bakteri hücre lizis için karbon nanotüp / polimer kompozit sütun polimerizasyonu göstermektedir. Daha sonra, silika / polimer kompozit sütun kullanarak çip üzerinde örnek nükleik asitlerin katı faz ekstraksiyon takip parçalama süreci göstermektedir. Ekli protokoller lizis ve katı faz ekstraksiyon sütunun her ikisinin de nasıl yapılacağı hakkında ayrıntılı talimatlar içerir.

Protocol

Mikroakışkan kanalları döngüsel bir poliolefin (Zeonex ® 690R, Zeon Kimya A.Ş., Louisville, KY) imal edilir. Zeonex gözenekli Monolith oluşumunda kullanılan ışık yönettiği kimya için gerekli olan, 136 ° C cam geçiş sıcaklığı (T _g) ve şeffaf UV. Mikro mikroakışkan platformu negatif (ters) özellikleri olan bir Nico electroformed ana-kalıp, mikro-sıcak kabartma tarafından imal edilir. Sıcak kabartma aşağıdaki şekilde yapılır:

1. Kalıp ve polimer substrat paralel iki metal plaka arasına yerleştirilir.
2. Plakaları kabartma sıcaklık (166 ° C), Zeonex T _g yukarıda 30 º C 'ye kadar ısıtılır.
3. Plakaları yaklaşık 5 dakika sonra bir araya sıkıştırılmaktadır ve basıncı 250 psi tutulur.
4. 1-2 dakika soğuması için izin verilen ısıtmalı plakaları, kalıp ve yüzey sonra kaldırılır ve daha sonra elle birbirinden ayrılır.
5. 1.5 mm çapında Wells örnek giriş ve toplama kanalları ucunda delinir.
6. Kabartmalı plastik substrat daha sonra termal Zeonex kapalı mikroakışkan kanalları oluşturmak için başka bir parça ile yapıştırılır. Kabartmalı substrat ve kapak parçası, UV-ozon veya plazma Sızdırmazlık verimliliğini artırmak ve kapalı kanal yapısı (Bhattacharyya ve Klapperich, 2007) sadakat sağlamak için termal yapıştırma önce tedavi edilebilir.

Plastik mikroakışkan kanallar içinde katı faz ekstraksiyon (SPE) sütun Fabrikasyon

Fabrikasyon katı-faz iki aşamalı bir süreçtir. İlk başta, fabrikasyon mikro SPE sütun yapışma plastik cihaz geliştirmek amacıyla yüzeyi modifiye edilmiştir. Yüzey fotopolimerizasyon yoluyla Aşılama polimerik mikro duvarları functionalize için kullanılır.

Aşılama işlemi aşağıdaki gibi:

1. Mikro,% 3 hidrojen soyutlayarak photoinitiator benzofenon, etilen diacrylate (EDA) ve metil metakrilat (MMA) 1:1 karışımı ile doldurulur. EDA, MMA ve benzofenon Sigma-Aldrich, St Louis, MO temin edilmektedir.
2. Çip ultraviyole maruz kalma aracı (CL-1000 UV Çapraz, UPV Inc, Upland, CA) 254 nm UV dalga boyu ve 200 mJ / cm ² enerji az 10 dakika sonra UV ışınlanmış. Aşılama ikinci adımda Monolith hazırlanması için kullanılan polimerizasyon karışımı içinde dahil olsun yüzey gergin polimer zincirleri, H-soyutlama polimerizasyon ve sonuçları ile oluşur.
3. Fazla monomer 15 mcL vakum aspirasyon kullanarak metanol ile durulama kanalları kaldırılır.

Mikrogözenekli bir polimer Monolith photografting işleminden sonra, mikro içinde oluşan silika partikülleri DNA ekstraksiyonu için tuzağa düşürürler. Gözenekli Monolith yerinde aşağıdaki gibi hazırlanmıştır:

1. Yüzeyi modifiye kanal buma (% 15 ağırlık), EDMA (% 10 ağırlık), 1-dodecanol (% 52.5 wt), siklohekzanole (% 22.5 wt), DMPAP oluşan bir gökdelenin habercisi karışımı saygı ile (% 1 ağırlık ile dolu. monomerlerin) ve 0.7 mikron silika partikülleri (pre-polimer karışımı toplam hacmine göre% 15). Silika mikrosferler Polysciences, Inc (Warrington, PA) satın alındı ​​ve monomerler ve porogenic çözücüler Sigma-Aldrich, St Louis, MO temin edilmektedir.
2. Polimerizasyonu başlatmak için 1.1 dakika için 200 mJ / cm ² çip UV çapraz bağlayıcı UV ile ışınlanmış ve fazla monomer vakum aspirasyon ile 15 mcL metanol ile durulama kanalları çıkarılır.
3. Daha sonra akışkan bağlantıları ^(NanoPorts TM bağlantıları, Upchurch Bilimsel, Oak Harbor, WA) mikroakışkan kanalların giriş ve toplama kuyuları bağlıdırlar .
4. Gözenekli Monolith sonra 100mL/hour bir akış hızında şırınga pompa kullanarak en az 30 dakika süreyle metanol ile tekrar yıkanır.

Plastik mikroakışkan kanallar içinde CNT lizis Monolith Fabrikasyon

CNT (karbon nanotüp) lizis Monolith Fabrikasyon iki aşamalı bir süreçtir. İlk olarak, fabrikasyon mikro plastik cihaz SPE sütunlar için aynı şekilde yüzey değiştirilmiş (aşılı).

Photografting işleminden sonra, mikrogözenekli bir polimer monolit, çok duvarlı karbon nanotüpler ile emdirilmiş olduğu Mikrokanallı içinde oluşur. Gözenekli Monolith yerinde aşağıdaki gibi hazırlanmıştır:

1. Çok duvarlı nanotüpler 2.27M bir konsantrasyon siklohekzanole yeniden bekletildi. Bu tabanda% 50 genlik az 30 dakika süreyle ultrasonicated ve sonifier hücre Topu (% 50 görev döngüsü Sonifier S-250Ultrasonik Branson, Danbury, CT) tarafından üretilen D,. Sonication CNTs etkili ve kararlı 0.5M süspansiyon sağladı. CNTs Nanolabs (Brighton, MA) satın alındı.
2. Yüzeyi modifiye kanalları şimdi siklohekzanole çözümü + CNTs kullanılır dışında benzer bir monolit öncü karışımı ile doldurulur. Monolith karışımı buma (% 15 ağırlık), EDMA (% 10 ağırlık), 1-dodecanol (% 52.5 wt), ve siklohekzanole + CNTs (% 22.5 ağırlıkça) oluşur. Bu çözüm için photoinitiator DMPAP (monomerler için saygı ile ağırlıkça% 1.13) eklenir. Monomerler, porogenic solventler ve DMPAPA Sigma-Aldrich, St Louis, MO temin edilmektedir.
3. Çip polimerizasyonu başlatmak için 0.9 dakika 120 mJ / cm ² UV çapraz bağlayıcı UV ile ışınlanmış. Cihaz crossliker 180 derece saygısız ve 120 mJ / cm ² az bir dakika süreyle 0.9 ışınlanmış. Fazla monomer 50 mcL vakum aspirasyon kullanarak metanol ile durulama kanalları kaldırılır.
4. Daha sonra akışkan bağlantıları ^(NanoPorts TM bağlantıları, Upchurch Bilimsel, Oak Harbor, WA) mikroakışkan kanalların giriş ve toplama kuyuları bağlıdırlar .

Bakteriyel Numune Hazırlama CNT lizis Monolith ile kullanmak için

Bakteriyel bir numune için numune hazırlama, numune kanal tıkanmaları önlemek için aşırı derecede konsantre değildir ki sağlamak için 600Nm bir optik yoğunluk ölçümü alarak içerir.

1. Medya bakteri ile 600Nm bir OD okuma, bu biophotometer (Eppendorf BioPhotometer, Eppendorf Scientific, Inc, Westbury, NY) ile yapılır. OD okumaları aralığı 0,18-0,25 A. giren kadar örnek sulandırınız
2. 6500 rpm'de 5 dakika santrifüj ve örnek süpernatantı süzün.

Lizis

1. GuSCN yeniden süspanse bakteri * +% 0,01 SDS +% 4 Proteinaz K (0.8mg/ml). Vortex kısaca (medya içinde bakteri 1 ml 1 ml GuSCN yeniden süspanse olması gerekir). Proteinaz K bakteriyel DNA eklenir ve DNAases ve RNAases inhibe proteinler denatüre yardım çözüm eklendi. Proteinaz K ek bir yararı, aynı zamanda, gram-negatif bakteriler genellikle daha fazla protein olmasına karşın, Gram-pozitif bakterilerin ve gram-negatif bakterilerin hücre duvarlarının büyük miktarlarda protein (içerdikleri için tercih edilir hücre duvarı proteinleri parçalayarak yardımcı .) Chaotropic tampon ayrıca deterjan hücre duvarı bozan proteinler denatüre proteinaz K yardımcı olur. Proteinaz K ve guanidinium tiyosiyanat (GuSCN) Qiagen A.Ş. (Valencia, CA) satın alındı. SDS (Sodyum dodesil Sülfat) Pierce (Rockford, IL) satın alınmıştır.
2. PEEK boru bağlı bir şırınga örnek hemen yükleyin. Herhangi bir hava sistemi böylece şırınga aspire edin. Nanoport ve kanal hortumu bağlayın.

KDS100 şırınga pompası (KD Bilimsel, Holliston, MA tarafından üretilen) deneyleri için kullanılan ve debisi kullanılan tüm adımlar için 450 mcL / saat oldu. 450ul/hr örnek lizis kanal akışı.

1. Örnek toplayın ve SPE ile DNA ekstraksiyonu (bkz. DNA ekstraksiyonu protokolü) devam edin. NOT: Bu bakteri örnek süspansiyon GuSCN olduğundan, Adım 2 Yük takip etmek gerek olmaz *.

DNA Ekstraksiyon Protokolü

Ekstraksiyon prosedürü 3 adımlardan oluşur:

1. Yük.
2. Wash
3. Zehir.

KDS100 şırınga pompası (KD Bilimsel, Holliston, MA tarafından üretilen) deneyleri için kullanılan ve kullanılan akış hızı 300 mcL tüm adımları / saat oldu.

Yük

1. Deney başlamadan önce 1-2 dakika süreyle chaotropic tamponu ile kanal (GuSCN ^* guanidinium tiyosiyanat) Durum.
2. 1:1 oranında chaotropic tamponu ile örnek karıştırın.
3. 3 dakika kanal üzerinden akış örnek karışımı.

Yıkama

1. Kanal 2 dakika süreyle% 70 etanol ile yıkayın.
2. Kanal 2 dakika süreyle% 100 etanol ile yıkayın.

Zehir

1. Millipore suda 3 dakika edilen DNA Zehir. 15 mcL, saflaştırılmış PCR hazır DNA toplayın.

* GuSCN Qiagen kiti (Buffer RLT) kullanılmıştır.