Automatically Generated

Summary

Her presenterer vi en protokoll som beskriver anskaffelse, prosessering og analyse av en serie NMR-eksperimenter som tar sikte på å karakterisere protein-glykan-interaksjoner i løsning. De vanligste ligandbaserte og proteinbaserte metodene er skissert, som utvilsomt bidrar til feltene strukturell glykobiologi og molekylære gjenkjennelsesstudier.

Abstract

Interaksjonene mellom glykaner og proteiner modulerer mange hendelser relatert til helse og sykdom. Faktisk er etableringen av disse anerkjennelseshendelsene og deres biologiske konsekvenser nært knyttet til de tredimensjonale strukturene til begge partnere, så vel som til deres dynamiske egenskaper og deres presentasjon på de tilsvarende cellerommene. NMR-teknikker er unike for å løse disse egenskapene, og faktisk har forskjellige NMR-baserte metoder blitt utviklet og brukt for å overvåke bindingshendelsene til glykaner med deres assosierte reseptorer. Denne protokollen skisserer prosedyrene for å anskaffe, behandle og analysere to av de kraftigste NMR-metodene som brukes innen NMR-glykobiologifeltet, ¹H-metningsoverføringsforskjell (STD) og ^{1 H,15}N-N-Heteronukleær enkeltkvantekoherens (HSQC) titreringseksperimenter, som komplementært gir informasjon fra henholdsvis glykan- og proteinperspektivet. Når de kombineres, tilbyr de faktisk et kraftig verktøysett for å belyse både de strukturelle og dynamiske aspektene ved molekylære gjenkjenningsprosesser. Denne omfattende tilnærmingen forbedrer vår forståelse av glykan-protein-interaksjoner og bidrar til å fremme forskning innen kjemisk glykobiologi.

Introduction

Molekylær gjenkjennelse av glykaner er avgjørende for mange prosesser knyttet til helse og sykdom. Spesifisiteten og selektiviteten til biologiske reseptorer (lektiner, antistoffer, enzymer) for glykaner avhenger sterkt av å justere den prekære balansen mellom de forskjellige komponentene av entalpi (CH-π og van der Waals, hydrogenbindinger, elektrostatikk) og entropi (hydrofobisitet, dynamikk, solvasjons-oppløsning)¹.

Gitt det store kjemiske mangfoldet og den dynamiske naturen til glykaner, har NMR-metoder blitt mye brukt for å dissekere glykaninteraksjoner i mer enn 25 år², siden disse metodene gir suveren informasjon om molekylære gjenkjennelseshendelser med presise detaljer, ved atomoppløsning ^3,4, selv når de nødvendige interaksjonsbevisene ikke kan hentes ved å bruke andre metoder. Som nøkkelpoeng er NMR allsidig og gjør det mulig å studere dynamiske hendelser, på atomnivå, på forskjellige tidsskalaer, og utgjør den desidert beste teknikken for å studere strukturen, konformasjonen og dynamikken til glykaner i løsning. Likevel kan det å løsrive denne informasjonen være en ganske kompleks prosess som krever bruk av veldefinerte strategier sammen med nøye dataanalyse⁵.

NMR-teknikker er forskjellige, og det er faktisk mange metoder som kan brukes for å løse glykan-protein-interaksjoner⁶. Vi beskriver her to grunnleggende NMR-tilnærminger som for tiden brukes til å tyde glykan-reseptor-interaksjoner ^7,8, og legger vekt på hvordan man kan løse presentasjonen av nøkkelglykanepitopen så vel som proteinbindingsstedet⁹.

I enhver molekylær gjenkjennelseshendelse, når en reseptor binder seg til en gitt ligand, er det en kjemisk utvekslingsprosess som påvirker mange NMR-parametere til deltakerne i bindingen¹⁰. Derfor, fra NMR-perspektivet, kan interaksjonen overvåkes enten fra glykanligandens synspunkt eller fra proteinreseptoren¹¹. Generelt sett er proteinreseptoren et stort biomolekyl (langsom rotasjonsbevegelse, med hastigheter i ns tidsskala, og derfor rask tverrgående avslapning), mens den interagerende glykanen kan betraktes som et lite-mellomstort molekyl (rask rotasjonsbevegelse, med hastigheter i ps-tidsskalaen, og langsom tverrgående avslapning)¹². Fra et standardperspektiv er NMR-signalene til glykanen smale, mens de fra reseptoren er brede¹³.

Ligandbaserte NMR-metoder er avhengige av den dramatiske endringen som mange glykan NMR-parametere opplever når de passerer fra fri til bundet tilstand¹⁴. STD-NMR er den mest brukte eksperimentelle NMR-teknikken for å vurdere ulike glykanbindingsfunksjoner¹⁵, fra å utlede eksistensen av binding i løsningstilstanden til bestemmelsen av glykanbindingsepitopen; det vil si atomene i liganden som er i kontakt med proteinreseptoren¹⁶.

Alternativt overvåker reseptorbaserte NMR-metoder endringene som finner sted i signalene til proteinreseptoren i nærvær av glykanen i forhold til de som er registrert for apo-tilstanden¹⁷. Disse er hovedsakelig fokusert på å screene de kjemiske skiftforstyrrelsene av proteinsignalene mellom begge tilstandene. Det mest brukte eksperimentet er ^{1 H-15}N HSQC, eller dets TROSY-alternativer¹⁸.

Kombinasjonen av begge tilnærmingene gjør det mulig å bruke NMR på mange forskjellige systemer som viser et bredt spekter av affiniteter. For de reseptorbaserte NMR-metodene, i motsetning til de som er basert på liganden, må imidlertid en relativt stor mengde løselig, ikke-aggregert, stabilt isotopmerket (¹⁵N) protein være tilgjengelig.

Vi beskriver her begge metodene, og fremhever deres styrker og svakheter. Merk at de grunnleggende trinnene beskrevet i protokollen fungerer som eksamples for bruk av Bruker-spektrometre. Følgelig stemmer kommandoer og parameternavn overens med de som brukes i TopSpin (Brukers spektrometrekontrollprogramvare).

Protocol

1. Forskjell i metningsoverføring NMR (STD-NMR) MERK: De påfølgende linjene skisserer grunnleggende prosedyrer for å anskaffe, behandle og analysere STD-NMR-eksperimenter. Disse trinnene tjener til å eksemplifisere teknikkens nytte for å oppdage ligandbinding og for å belyse ligandbindingsepitopen. For en dypere forståelse av design og anskaffelse av NMR-eksperimenter, se den tilsvarende produsentens håndbok som følger med NMR-instrumentet. ErvervelseForbered prøven med protein-ligandkomplekset. Bruk glykan:lektin molare forhold mellom 10:1 og 100:1 med proteinkonsentrasjoner mellom 0,01 og 0,2 mM. For interaksjon mellom hGalectin-7 og LacNAc, bruk 50:1 protein: ligand-forhold i deuterert fosfatbufret saltvann ved pH 7,4.MERK: Proteinreseptoren skal være ren og være løselig i den valgte bufferen (i tilfelle av STD-NMR-eksperimenter er deutererte versjoner av den tilsvarende bufferen å foretrekke for å redusere mulig 1H NMR-signalinterferens). Konsentrasjonen av proteinet kontrolleres på forhånd ved hjelp av et spektrofotometer for å måle absorbansen ved 280 nm. Fra den tilberedte løsningen, overfør et totalt volum på 0,6 ml til et 5 mm NMR-rør ved hjelp av en pipette. Klargjør NMR-instrumentet ved ønsket temperatur (vanlige eksperimenttemperaturer faller mellom 10 °C og 45 °C). Åpne temperaturkontrollmonitoren ved å bruke edte-kommandoen og still inn ønsket temperatur. For hGalectin-7/LacNAc-studien ble temperaturen satt til 25 °C. Generer et nytt datasett som inneholder zg-pulssekvensen.For en enkel operasjon, åpne et eksisterende eksperiment og skriv inn edc-kommandoen . En dialogboks vises, definer tittelen, egenskapene (prøvespesifikasjoner, løsningsmiddel) og noen parametere for eksperimentet. Hvis en endring fra den opprinnelige pulssekvensen er nødvendig, naviger du gjennom ased (parametere) og AcquPars (opptaksparametere) vinduer. På dette tidspunktet velger du ønsket pulsprogram fra spektrometerets bibliotek. For et standard 1H NMR-spektrum, velg zg-pulssekvensen fra den tilgjengelige listen.NOTAT: Når det gjelder prøver med økt vanninnhold, kan det være nødvendig å bruke vanndempingsordninger for å øke signal-til-støy-forholdet. Bruk av pulssekvenser som zgesgp, som eksitasjonsskulpturerende moduler som gir utmerket undertrykkelse, men kontrollerer fasen til de gjenværende signalene, er ønskelig. Se produsentens NMR-veiledning for ytterligere informasjon om typer vanndempingsordninger og deres viktigste egenskaper. Sett NMR sample inn i sonden ved å aktivere sample løfteluft. Bruk kommandoen ej, plasser prøven på toppen av magneten, og deaktiver prøveløftet ved å bruke ij-kommandoen.NOTAT: For å injisere sample inn i magneten ved hjelp av en autosampler, bruk kommandoen sx etterfulgt av posisjonsnummeret, n, som tilsvarer posisjonen til NMR-røret i autosamplerbrettet. Lås på løsemiddelsignalet ved å skrive inn kommandolåsen og deretter velge riktig løsemiddel fra menyen. Når sample er satt inn i sonden, fullfør innstillings- og matchingsprosessen ved å bruke den automatiske modulen atma eller den manuelle modulen atmm. Start den automatiske shimmingen gjennom topshim gui-kommandoen. Dette åpner et grafisk grensesnitt der mellomleggsdimensjon 1D velges og startes.MERK: For å minimere shimming-ustabiliteter på grunn av subtile felt- eller temperaturvariasjoner, kan autoshim aktiveres for eksperimentopptaket. Dette kan gjøres ved å gå til BSMS-kontrollvinduet og klikke på autoshim. Omgjøringen til et grønt høydepunkt indikerer at autoshim er aktivert. Vær oppmerksom på at når du bruker autoshim, må potensielle problemer med prøveustabilitet være ubemerket. Derfor anbefales det å være forsiktig når autoshim brukes. Bestem 1H 90° puls. Dette kan utføres automatisk gjennom pulsekalkommandoen . Endre ulike parametere i AcquPars-vinduet. For et vanlig 1H NMR-spektrum, sett antall skanninger (NS) til 32, og ønsket spektralvindu (SW) til ca. 12 sider per minutt.NOTAT: zgesgp-pulssekvensen inkluderer en modul for løsemiddelundertrykkelse for å eliminere det gjenværende HDO-signalet, som skal sentreres i midten av spekteret. For dette formålet må O1 defineres nøyaktig i AcquPars. Still inn mottakerforsterkningen for å unngå overløp med den automatiske kommandoen rga. Skaff deg nå standard 1H NMR-spekteret ved å bruke zg-kommandoen. Når anskaffelsen er fullført, behandler du spekteret gjennom efp-kommandoen. Bruk grunnlinje- og fasekorreksjonene ved hjelp av TopSpin-menylinjen.MERK: 1time NMR-signaler som stammer fra glykanen og proteinet observeres (figur 1). Den detaljerte analysen av det ervervede NMR-spekteret anbefales for gjennomføring av STD NMR-eksperimentet, som skissert i avsnitt 1.1.14. Lag et nytt datasett og last opp STD NMR-pulssekvensen som skal brukes på samme måte som beskrevet for 1H NMR-eksperimentet i avsnitt 1.1.4. I Bruker-instrumenter er forskjellige pulssekvenser tilgjengelige i pulsprogramkatalogen, alle kalt stddiffXXX. Den enkleste (stddiff) inkluderer ikke noe vannundertrykkelsesskjema eller proteinundertrykkelsesfilter.For prøver med betydelig H2O-innhold, velg enten stddiffgp19- eller stddiffesgp-sekvensene, som inkluderer en watergate eller eksitasjonsskulpturmodul. Når det gjelder et spektrum med intense protein-NMR-signaler som bakgrunn, velg stddiffXXX.3-sekvensene. I hvert tilfelle optimaliserer du de tilsvarende spesifikke parametrene for hver vannslokkingsmodul (dvs. d19 i watergate-ordninger). Definer av- og på-resonansfrekvensene for STD NMR-eksperimentet. Finn frekvenslisten i AcquPars-parametrene til ased-vinduet under FQ2LIST-oppføringen. De definerte on-resonans- og off-resonansfrekvensene i Hertz må skrives manuelt inn i listen og lagres under et nytt navn. Denne nye listen vil bli brukt i STD-NMR-eksperimentet.Velg on-resonansfrekvensen ved et spektralt område uten glykansignaler, vanligvis rundt δ(1H) 0 eller 6,6 ppm, for typiske glykaner (figur 1). Still inn off-resonansfrekvensen til et område som ikke viser noen ligand eller proteinproton. Den kan trygt stilles inn på +18000 eller -18000 Hz. Definer den formede pulsen som skal brukes under metningstiden i AcquPars-parametrene til det definerte vinduet.MERK: Det er mange muligheter. Gauss- eller Eburp-formene kan trygt brukes, med en 90° bredde på den selektive pulsen på 50 ms. Angi de tilsvarende parameterne i AcquPars-delen.Still inn pulslengden 1H 90°. Still inn effektverdien for den formede pulsen (estimert gjennom formverktøyet). Still inn den totale metningstiden. Verdier mellom 1 s og 4 s kan brukes regelmessig. Sett avslapningsforsinkelsen til 3 s. Sett antall skanninger (NS) til et multiplum av 8. Vanligvis er den satt til 256, 512 eller 1024 for å få riktig signal-til-støy-forhold i sett på 2 ved hver frekvens. Angi antall dummy-skanninger (DS) til 8. Angi antall poeng i F2 til 16k, 32k eller 64k.NOTAT: Et økt antall punkter i F2 vil resultere i forbedret oppløsning og signal-til-støy-forhold. Av den grunn er det sterkt tilrådelig å bruke minimum 16k datapunkter. Angi antall poeng i F1. Dette er antall frekvenser som skal brukes, i dette tilfellet 2 (on-resonans og off-resonans).NOTAT: Ved konvensjon refererer F2 til den direkte dimensjonen, dimensjonen langs hvilken det frie induksjonshenfallet (FID) samples direkte, mens F1 betegner den indirekte dimensjonen. Still inn mottakerforsterkningen (RG) for å unngå overløp med den automatiske kommandoen rga. Beregn tidspunktet for det totale eksperimentet ved hjelp av kommandoen expt. Send eksperimentet til henting via zg-kommandoen. Kontroller alltid at eksperimentet kjører som det skal etter noen minutter. BehandlingNOTAT: Et pseudo-2D-spektrum oppnås etter bruk av protokollen beskrevet ovenfor. Antall rader tilsvarer antall brukte frekvenser, vanligvis to: på-resonans og av-resonans.Behandle fid-en for det første eksperimentet.Gjør Fourier-transformasjonen av fid-tallet 1 (gjennom efp-kommandoen) og velg destinasjonen for de behandlede spektrene (velg procno-nummer). Alternativt kan du bruke rser 1-kommandoen for å lese den første fid. Juster deretter linjeutvidelsesfaktoren gjennom lb-kommando (vanligvis 3-5 Hz), og fasen. For å fase manuelt, klikk på Prosess-fanen og juster deretter faseundermenyen . Utfør null- og førsteordens korreksjoner ved å klikke og dra på den tilsvarende knappen. Lagre faseresultatene. I tillegg utfører du grunnlinjekorreksjon gjennom kommandoen abs. Les fid-en for det andre eksperimentet, og gjør Fourier-transformasjonen (gjennom efp-kommandoen) med samme linjeutvidelsesfaktor. Juster fasen med samme faseparametere og grunnlinjekorreksjon og lagre det behandlede spekteret med en annen kode. Les de to behandlede spektrene med multippelfunksjonen (kommando: .md) og trekk dem fra (off-resonance – on-resonance) ved hjelp av knappen som er tilgjengelig i multippelvisualiseringen (Δ). Det nye spekteret er STD NMR-spekteret, som lagres med en annen kode. Lag en overlagring av STD NMR-spekteret med off-resonansspekteret.Åpne off-resonansspekteret (fid 1) og skriv inn .md-kommandoen for å åpne vinduet for flere skjermer. Last deretter opp STD-spekteret. Sammenlign frekvensene og intensitetene (vises automatisk øverst til høyre) til signalene i STD NMR-spekteret. Dette gir ønsket informasjon om de protonene som er nær proteinet og deres relative nærhet. Jo høyere relativ intensitet, jo nærmere proteinet er de (figur 2). Mål intensitetene (integralene) i off-resonanseksperimentet ved hjelp av den tilsvarende programvaren. I TopSpin går du til Analyser > Integrer. Definer områdene og skriv integralene i en fil (I0). Mål intensitetene (integralene) i STD NMR-eksperimentet ved å bruke de samme parameterne og skriv dem i en fil (ISTD). Beregn STD-verdien for hvert protonsignal ved å bruke følgende ligning:STD = (ISTD)/I0.NOTAT: MERK: Bruk av signalintegrasjon for beregning av STD-verdier krever at protonsignaler er tilstrekkelig atskilt. Når signaloverlapping oppstår, for eksempel med oligosakkarider, kan STD-verdier bestemmes ved å vurdere signalintensitetsforholdet mellom STD- og off-resonansspektrene. Beregn den relative kjønnssykdommen i prosent. For å gjøre dette, gi en 100% verdi til protonet som viser den maksimale forskjellen mellom intensitetene i off-resonans og STD NMR-spekteret. Beregn de relative STD-intensitetene for de andre protonene tilsvarende.NOTAT: Riktig analyse av STD-data, spesielt for å bestemme ligandbindingsepitop, krever fullstendig tildeling av 1H-signaler av liganden. Derfor anbefales det sterkt at denne oppgaven fullføres før anskaffelsen av STD-spektrene. 2. 1 H-15N HSQC-eksperimenter MERK: Følgende linjer beskriver bruken av 1 H-15N HSQC-eksperimenter for å overvåke endringene i de kjemiske skiftene til 1H og 15N NMR-resonansene til reseptoren (lektin) som respons på tilstedeværelsen av økende mengder av liganden (oligosakkarid)19. Chemical Shift Perturbation (CSP)-analysen basert på de ekstraherte dataene er svært verdifull for identifisering av bindingspartnere, men også for å kartlegge proteinbindingsgrensesnittet og bestemme bindingsaffiniteter. For en dypere forståelse av design og anskaffelse av NMR-eksperimenter, se den tilsvarende produsentens håndbok som følger med NMR-instrumentet. Anskaffelse og bearbeidingForbered prøven med lektinet av interesse. Sørg for at reseptoren er fullstendig 15N-merket i hver aminosyrerest, både i ryggraden og sidekjedene. Vanligvis, for å oppdage de vannutskiftbare HN-krysstoppene i spekteret, bruk en 90:10-blanding av H2O: D2O for å tilberede den bufrede løsningen. De nødvendige lektinkonsentrasjonene varierer mellom 0,05 og 0,2 mM, avhengig av tilgjengeligheten av den 15N-merkede reseptoren og det nødvendige signal-til-støy-forholdet.MERK: Proteinet skal være stabilt gjennom hele forsøkstiden uten synlig generering av bunnfall i NMR-røret. Videre skal den være ren og løselig i den valgte bufferen. Den fullstendige 1H og 15N-tildelingen av HSQC-krysstoppene burde vært utført tidligere slik at hver krysstopp i HSQC-spekteret identifiseres med en etikett som tilsvarer den spesifikke aminosyreresten. Fra dette preparatet, overfør et totalt volum på 0,6 ml til et 5 mm NMR-rør. Still inn NMR-instrumentet på ønsket temperatur. Se trinn 1.1.3 og følg de samme operasjonene. Opprett et nytt datasett. Se trinn 1.1.4 og gjenta operasjonene. Sett NMR-prøven inn i sonden som beskrevet i trinn 1.1.5. Lås på løsemiddelsignalet. For å starte låseprosedyren, bruk kommandoen lås og velg riktig løsemiddel fra menyen. Låsesignalet kan spores i låsevinduet. Still inn låseforsterkningen slik at låsesignalet er synlig i låsevinduet. Fullfør innstillings- og matchingsprosessen automatisk (gjennom kommandoen atma) eller manuelt ( atmm-kommandoen åpner ATM-kontrollvinduet for å justere vinglekurven). Still inn de optimale avstandsskivene ved å bruke TopShim-verktøyet. Bruk kommandoen topshim gui. Se instruksjoner i trinn 1.1.8. Bestem pulslengden1 H 90° (som beskrevet i trinn 1.1.9) og offsetfrekvensen (kommandoen o1calib vil kjøre en interaktiv O1-kalibreringsrutine og hente offsetfrekvensen). Denne senere parameteren er ekstremt viktig når eksperimenter med løsemiddelundertrykkelsesordninger brukes. Opprett et nytt datasett som beskrevet i avsnitt 1.1.4. For å redusere eller eliminere interferensen fra H2O-signalet, bruk pulssekvensen zgesgp. Sett opp eksperimentet ved å endre ulike parametere i AcquPars-vinduet.Introduser 1H 90° pulslengde og forskyvning (o1) som tidligere bestemt, og sett antall skanninger (NS) til 32 og spektralvinduet (SW) til rundt 12 ppm. Bestem effektnivået til den formede pulsen ved hjelp av formverktøyet som er tilgjengelig i Topspin-menylinjen. Still inn mottakerforsterkningen med den automatiske kommandoen rga. Skaff deg eksperimentet ved å bruke zg-kommandoen og behandle den resulterende FID-en for å oppnå 1H NMR-spekteret. Opprett et nytt datasett som skal brukes til å anskaffe 1 H-15N HSQC NMR-eksperimentet. I kategorien AcquPars velger du pulsprogrammet hsqcetfpf3gp som er tilgjengelig i pulsprogramkatalogen. Konfigurer eksperimentet. Last inn standardformene, kreftene og tidene ved å bruke kommandoen getprosol. Oppdater deretter verdiene for pulslengden på 1H 90° og forskyvning. Definer følgende parametere.Sett avslapningsforsinkelsen på 1-5 s. Sett antall skanninger til et multiplum av 4. Vanligvis er den satt til 8, 16, 32 eller 64 for å få riktig signal-til-støy-forhold. Angi antall dummy-skanninger til 128. Angi antall poeng i F2 til 1k, 2k eller 4k. Still inn antall punkter i F1: antall t1-trinn som skal brukes. Avhengig av spektralvinduet er dette mellom 128 og 256. Juster midten av spektralvinduet i 15N-dimensjonen til δ 117 ppm og sett opp den tilsvarende spektralbredden til 36 ppm. Disse verdiene må optimaliseres for hvert enkelt system. Still inn mottakerforsterkningen for å unngå overløp (ved å bruke rga-kommandoen ) Beregn tidspunktet for det totale eksperimentet. En typisk eksperimentell tid er omtrent 1 time. Skriv inn zg for å sende eksperimentet til anskaffelse.MERK: Kontroller alltid at eksperimentet kjører som det skal etter noen minutter. Behandle FID ved å bruke kommandoen xfb. Utfør grunnlinjekorreksjonen ved å bruke kommandoen abs2 og fasekorreksjoner i kategorien Prosess. For å fase manuelt, klikk på undermenyen for justering av fase og velg deretter flere krysstopper av 2D-spektrene. Etterpå bruker du sekvensielt null- og førsteordens korreksjoner på både rader og kolonner ved å klikke og dra på den tilsvarende knappen. Lagre faseresultatene. Lagre det resulterende 2D-spekteret. Forbered en sterkt konsentrert stamløsning av liganden. Typiske verdier er 50-100 mM. Fra den høykonsentrerte stamløsningen av glykanen, overfør det tilsvarende volumet (noen få mikroliter) til NMR-røret som inneholder reseptoren for å få ønsket protein: ligandmolarforhold og registrer spektrene.MERK: Dette trinnet starter titreringsserien, hvor liganden titreres inn i proteinprøven. Passende protein-til-ligand-forhold må bestemmes for hvert enkelt tilfelle. Hvis bindingsaffiniteten er helt ukjent, anbefales det å bruke substøkiometriske mengder av liganden i startpunktene. Utfør trinn 2.1.1 til 2.1.19 for den nypreparerte prøven. Gjenta trinn 2.1.21 og 2.1.22 for prøver med økende protein-til-ligand-forhold.MERK: Nøyaktig tilpasning av titreringsseriedataene krever innhenting av flere 1 H-15N-HSQC-eksperimenter, som dekker et bredt spekter av protein-til-ligand-forhold, inkludert de som trengs for å oppnå proteinmetning. AnalyseVisualiser det behandlede 2D HSQC-spekteret for apo-artene ved hjelp av riktig programvare: TopSpin, MestReNova og CCPNMR er alle egnede programmer for håndtering av NMR-data.MERK: Dette er fingeravtrykkspekteret til proteinet. De observerte 1H og 15N kjemiske skiftene avhenger av det tilsvarende kjemiske miljøet til hver aminosyre, som sterkt avhenger av 3D-strukturen til proteinet. Dette spekteret kalles proteinfingeravtrykkspekteret. Et godt spredt 2D 1 H-15N HSQC-spektrum der alle krysstoppene viser jevne intensiteter tyder sterkt på tilstedeværelsen av et godt foldet protein19. Generer listen over 1H og 15N frekvenser for alle krysstoppene. Bruk av tilleggsprogramvare, for eksempel CCPNMR-programmet20, kan hjelpe i prosessen. Legg spekteret for det første eller andre titreringspunktet på det for apo-proteinet.For å gjøre det, åpne 2D-spekteret som tilsvarer apo-tilstanden, klikk på fanen Flere visninger og legg deretter til det andre 2D-spekteret. Den visuelle inspeksjonen av begge spektrene gir informasjon om eksistensen av interaksjon mellom liganden og proteinet.MERK: Fra proteinets perspektiv gir eksistensen av binding endringer i det kjemiske miljøet til aminosyrene som er direkte involvert i gjenkjennelseshendelsen, med de samtidige kjemiske skiftforstyrrelsene (CSP). Gjenta trinn 2.2.2 og 2.2.3 for hvert titreringspunkt, og generer lister over 1H- og 15N-frekvensene for alle krysstoppene i de forskjellige spektrene, tilsvarende forskjellige protein-ligand molare forhold.NOTAT: De kjemiske forskyvningene ved hvert titreringspunkt kan måles uten at det er nødvendig å utføre noen ny krysstopptildeling. Når det gjelder raskt utvekslingsregime, ofte observert i lektin:glykan-interaksjoner, kan man ganske enkelt følge den progressive bevegelsen av topper gjennom titreringen. Sjekk at det for det siste titreringspunktet i utgangspunktet ikke er noen kjemiske forskyvningsforstyrrelser i forhold til det forrige tillegget. Dette faktum er en indikasjon på at proteinbindingsstedet har blitt mettet med liganden, som er i høyt overskudd. Beregn maksimale kjemiske forskyvningsforstyrrelser (maxCSP) ved å bruke ligningen nedenfor:ΔH og ΔδN er de kjemiske skiftforskjellene i 1H og 15N frekvensene mellom henholdsvis apo-tilstanden og det siste titreringspunktet. Plott de maksimale kjemiske forskyvningsforstyrrelsene (maxCSP) i den vertikale y-aksen til et 2D-plott versus den tilsvarende aminosyreresten (i den horisontale x-aksen). Gjør en visuell inspeksjon av aminosyrerestene som viser maksimal CSP mellom proteinets bundne og apo-tilstander. Det er høyst sannsynlig at de tilhører bindingsstedet eller er naboer til det. Hvis 3D-strukturen til proteinet er tilgjengelig, åpner du den tilsvarende PDB-en med riktig programvare som PyMOL eller BIOVIA Discovery studio. Disse molekylære visualiseringsprogrammene er mye brukt i strukturbiologiske applikasjoner. Velg restene som viser den høyeste maxCSP (over det dobbelte av standardavviket) med en bestemt farge for å lokalisere det antatte bindingsstedet. I tilfelle av et raskt utvekslingsregime, estimer dissosiasjonskonstanten (KD) fra en ikke-lineær minste kvadraters tilpasning av den observerte CSP for 1 H-15N HSQC-krysstopper på hvert punkt (Δδobs) versus den spesielle proteinkonsentrasjonen [P] og ligand [L] på det punktet:NOTAT: Denne ligningen kan brukes på de krysstoppene som viser klare isolerte signaler. De oppnådde verdiene er gjennomsnittet for å gi estimeringen av KD.

Representative Results

Her presenterer vi en protokoll for utnyttelse av 1H-STD NMR og 1 H-15N HSQC-eksperimenter for å avdekke detaljene i bindingsinteraksjonen mellom lektiner og små oligosakkarider. Resultatene oppnådd i analysen av molekylær gjenkjennelse av LacNAc av hGalectin-7 (hGal-7) er inkludert, og fungerer som et illustrerende eksempel på vellykket implementering av protokollen og effektiviteten til disse NMR-metodene for å studere de fine detaljene i den molekylære gjenkjenningsprosessen. Figur 3 viser 1H-STD NMR-spekteret for interaksjonen mellom LacNAc og hGal-7. Eksistensen av STD NMR-signaler indikerer binding (figur 3A). Dessuten dukker bare de signalene som tilhører protoner i nær kontakt med proteinet opp, noe som tillater avgrensning av bindingsepitopen (figur 3B). Figur 4 fremhever hvordan 1 H-15N HSQC-spekteret til et protein kan brukes som fingeravtrykk, og figur 5 illustrerer anvendelsen av 1 H-15N heteronukleær enkeltkvantekoherens (HSQC) titreringseksperimenter for å definere den kjemiske skiftforstyrrelsen av hGalectin-7 rygradsamidgrupper ved LacNAc-binding. Disse dataene avslører ikke bare eksistensen av interaksjon, men avgrenser også lektinets bindingsgrensesnitt. Figur 6 viser hvordan analysen av titreringsdataene muliggjør estimering av bindingsaffiniteten til LacNAc med hGalectin-7, som faller i det høye mikromolare området. Dette funnet er i samsvar med resultater oppnådd ved bruk av alternative teknikker. Figur 1: Valg av on-resonansfrekvens. 1H-NMR-spektrum av LacNAc:hGal-7 50:1-forhold i deuterert fosfatbufret saltvann ved pH 7,4 er vist. Signaler fra liganden (LacNAc) er begrenset i området mellom 2,0-5,2 ppm. Metningsfrekvensen er nøye valgt for å sikre fravær av ligandprotoner innenfor et område på 1-2 ppm, noe som tillater selektiv bestråling av proteinets protoner. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Figur 2: STD NMR-eksperimentet. Skjematisk representasjon av STD-eksperimentet: det første spekteret (off-resonans) fungerer som referanse mens i det andre (on-resonans) utføres proteinmetning. Metningen forplantes effektivt over hele proteinet og overføres til ligandprotonene i nær kontakt med proteinet. Det resulterende differansspekteret (STD-spekteret) gir bare de resonansene som har opplevd metning. Analysen av STD-eksperimentet tillater epitopkartlegging av bindingssukkeret. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Figur 3: Bindingsanalyse fra ligandens perspektiv. (A) Overlagring av off-resonansen og 1H STD-NMR-spektra for interaksjonen mellom LacNAc og hGal-7. I STD-spekteret dukker bare de signalene som tilhører protoner i nær kontakt med proteinet opp. Merknaden av 1H-resonansene til liganden rapporteres i off-resonansspekteret. (B) De relative STD-intensitetene ble fargekartlagt i den kjemiske strukturen til LacNAc. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Figur 4: 1 H-15N HSQC-spekteret til et protein representerer fingeravtrykket. (A) 1 H-15N HSQC-spektrum på 100 μM av hGal-7 i apo-form. Spekteret ble registrert ved 25 °C. Noen NH-krysstopper ble kommentert med etiketten til deres tilsvarende aminosyre. (B) Hvert NH-par viser et unikt kjemisk skifte som avhenger av det kjemiske miljøet og følgelig av 3D-strukturen til proteinet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Figur 5: Bindingsanalyse fra proteinets perspektiv. (A) Overlagring av 1 H-15N HSQC-spektra registrert for titrering av LacNAc til hGal-7-løsning er vist. Inspeksjon av spektrene, der flere krysstopper opplever kjemiske skiftendringer, indikerer tydelig interaksjon. (B) Plottet av de maksimale kjemiske forskyvningsforstyrrelsene (maxCSP) av ryggradsamidsignalene utledet fra titreringen av LacNAc (15 ekvivalenter) med hGal-7. (C) De mest forstyrrede aminosyrene til hGal-7, ifølge CSP-analysen, er kartlagt i 5gal PDB-strukturen. I 3D-modellen refererer den røde fargen til CSP-verdi over 2σ, mens de rosa til verdier mellom 1σ og 2σ. Det fargede området representerer sannsynligvis bindingsstedet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Figur 6: KD-bestemmelse basert på 1 H-15N HSQC-titreringseksperimenter. (A) Representasjon av mønsteret til 1 H-15N HSQC-basert titrering avhengig av den kjemiske utvekslingskursen i NMR-tidsskalaen til systemet i studien (rask, middels eller langsom). Et raskt utvekslingsregime ble observert ved LacNAc/hGal-7-interaksjon. (B) Tilpasningskurve og KD-estimering oppnådd fra CSP-analysen ved varierende ligandkonsentrasjoner for modellsystemet til hGal-7 og LacNAc-disakkarid. Den estimerte KD er rapportert med tilsvarende feil som et gjennomsnitt av dataene for 20 forskjellige aminosyrer; (C) Utdrag av 1 H,15N-HSQC-spektrene som viser forskyvningen av utvalgte tverrtopper under titreringen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

Metningsoverføringsforskjell NMR (STD-NMR) har blitt den mest brukte og allsidige NMR-metoden for å studere ligand-protein-interaksjoner. Som vist ovenfor, er den avhengig av metningsoverføringsfenomenet, og det eksperimentelle oppsettet involverer anskaffelse av to endimensjonale (1D) ¹H-spektre: on-resonans¬ og ¬off-resonansspektrene. Under on-resonans-eksperimentet oppnås metning av spesifikke protoner av proteinet ved å påføre et tog med radiofrekvenspulser med lav effekt i løpet av en viss periode (metningstiden varierer vanligvis fra 1-3 s). For å unngå direkte metning av liganden, er frekvensen og lengden på metningspulsene optimalisert for selektiv bestråling av spesifikke protoner av proteinet; det vil si at de må påføres med en frekvens som er ledig for eventuelle ligandsignaler og med passende lengde (figur 1). Som en tommelfingerregel for 50 ms metningspulser, bør det holdes 1 ppm-forskjell fra metningsområdet til de nærmeste ligandsignalene. Generelt gir selektive metningspulser påført på den alifatiske regionen av proteinet økte metningseffekter. Alternativt kan aromatiske protoner (6-7 ppm) også bestråles hvis ligandmolekylet ikke inneholder noen aromatiske signaler. Dette er veldig nyttig for naturlig forekommende glykaner, da de ikke bærer aromatiske grupper. Når et bestemt område av proteinet er selektivt bestrålt, forplanter metningen seg langs proteinet via dipolar ^{1 H-1}H kryssavslapning (spinndiffusjon). Til slutt når metningen proteinprotonene på bindingsstedet, som deretter overføres til sukkerprotonene som er i nær kontakt (r < 5 Å) med reseptoren via intermolekylære ^{1 H-1}H NOE. Åpenbart reduseres intensiteten av signalene til de mettede ligandprotonene. Etter å ha mottatt metningen, på grunn av bindingskinetikken, dissosierer de forbigående bundne ligandene (rask utveksling er nødvendig) og metningsinformasjonen akkumuleres i fri tilstand. På grunn av denne prosessen presenterer NMR-on-resonansspektrene reduserte signaler (figur 2).

For tydelig å vise denne intensitetsforstyrrelsen av ¹H-kjernene i en bindende glykan, erverves et kontrollproton NMR-spektrum (off-resonans) der metningen påføres langt unna ethvert reseptor- eller karbohydratsignal (vanligvis mellom 40-100 ppm), under de samme forholdene. Det subtraherte 1D-spekteret mellom off-resonans og on-resonans viser utelukkende signalene fra ¹H-kjernene i liganden som har modifiserte intensiteter: de som var nær nok reseptorbindingsstedet til å motta magnetiseringen (figur 2).

Likevel får ikke alle ¹H-kjernene i det bundne karbohydratet samme mengde metning. Teoretisk sett er magnetiseringsoverføringen fra reseptoren til den bundne liganden avstandsavhengig (1/r⁶). Dette betyr at intensitetene av overført metning blant glykan ¹H-kjernene inneholder informasjon om de romlige nærhetene mellom protonene til liganden og reseptoren, og STD NMR-intensitetene er større for de protonene som er nærmere reseptoren. Følgelig tillater STD NMR-eksperimentet også å bestemme bindingsepitopen til karbohydratet (figur 2 og figur 3) siden protoner av liganden som sitter nærmere proteinoverflaten viser høyere intensiteter enn de som ikke deltar direkte i bindingen.

Eksperimentet kan brukes på systemer med svak-middels affinitet, sjelden på systemer med sterk affinitet i det lave μM- eller nM-området. Det krever faktisk at dissosiasjonsraten er rask i avslapningstidsskalaen. Ellers går metningsoverføringsinformasjonen tapt gjennom avslapning før liganden dissosierer.

På den annen side er proteinbaserte NMR-eksperimenter unike for å avdekke ligand-protein-interaksjon med aminosyrenivånøyaktighet uten å løse atomoppløsningsstrukturene. Den undersøker direkte molekylære gjenkjennelsesfenomener i løsning uten behov for kokrystallisering. CSP-analysekartlegging er eksepsjonelt kraftig for å oppdage ligander og kartlegge proteinbindingsstedet (figur 4 og figur 5). Denne metoden kan brukes på alle slektskapsområder mellom mM- og nM-området, selv for systemer der valutakursen er langsom i den kjemiske forskyvningstidsskalaen²¹.

Likevel vil denne tilnærmingen sannsynligvis ikke fungere for proteiner med molekylvekter over 30-40 kDa på grunn av avslapningsproblemer. TROSY-alternativet¹⁸ kan da brukes, og er spesielt kraftig når det kombineres med proteindeuterasjon. Videre bør proteinet være jevnt merket med ¹⁵N (og en annen prøve dobbeltmerket med ¹³C og ¹⁵N for å kunne fullføre den nødvendige ryggradsoppgaven). Derfor bør proteinekspresjonsforhold, inkludert det tilsvarende ekspresjonssystemet, optimaliseres for å kunne oppnå milligrammengder protein. Proteiner som viser en tendens til å oligomerisere eller aggregere er heller ikke egnet for denne analysen. Instrumentet som brukes her for å registrere NMR-dataene er et Bruker 800 MHz-spektrometer utstyrt med en TCI-kryoprobe. Det vil være svært utfordrende å bruke denne metodikken ved bruk av instrumenter under 600 MHz eller uten kryogen sonde.

Materials

5 mm Shigemi microtube set mat	CortecNet SAS	S30BMS-005B
Alpha-Lactose-Agarose	Sigma-Aldrich Química S.L.	7634-5ML
Ammonium chloride (15 N, 99%)	LC-0179-N-50G	Tracer Tecnologías Analíticas S.L
Ampicillin (Sodium Salt)	Melford Laboratories LTD	A40040
BIOVIA Discovery studio	BIOVIA, Dassault Systèmes
BL21(DE3) Chemically Competent Cells	Merck Life Science, S.L.U.	CMC0014-40X40UL
Centrifuge	Beckman Coulter	Allegra X-22R
D2O	Cambridge Isotope Laboratories, Inc.	DLM-4-1000
Incubator	Eppendorf	Innova 42
IPTG (Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside)	VWR International Eurolab S.L.	VW437144N
LacNAc	Elicityl	GLY008
Luria Bertani (LB) Broth	Merck Life Science, S.L.U.	3397-1KG
Matraz Erlenmeyer B N 5000 CC	VWR International Eurolab S.L.	214-1137
PBS 10x	Bio-Rad	1610780
PyMOL	PyMOL Molecular Graphics System	Version 2.0 Schrödinger
Sonicator	Sonics & Materials, Inc.	VC 505
Superconducting NMR magnet	Bruker	600 MHz AVANCE III
Superconducting NMR magnet	Bruker	800 MHz AVANCE III