التنبؤ بالبروتين المستهدف والتحقق من صحة مركب الجزيئات الصغيرة
Summary
تظهر التجربة المستخدمة هنا طريقة الالتحام الجزيئي جنبا إلى جنب مع مقايسة التحول الحراري الخلوي للتنبؤ والتحقق من التفاعل بين الجزيئات الصغيرة وأهداف البروتين.
Abstract
البروتينات أساسية لعلم وظائف الأعضاء البشرية ، مع أهدافها الحاسمة في البحث وتطوير الأدوية. أصبح تحديد أهداف البروتين الحاسمة والتحقق من صحتها جزءا لا يتجزأ من تطوير الأدوية. الالتحام الجزيئي هو أداة حسابية تستخدم على نطاق واسع للتحقيق في ارتباط البروتين ، خاصة في سياق التفاعلات المستهدفة للدواء والبروتين. للتحقق التجريبي من الربط والوصول إلى ربط الدواء وهدفه مباشرة ، يتم استخدام طريقة مقايسة التحول الحراري الخلوي (CETSA). تهدف هذه الدراسة إلى دمج الالتحام الجزيئي مع CETSA للتنبؤ والتفاعلات بين الأدوية وأهداف البروتين الحيوية والتحقق من صحتها. على وجه التحديد ، توقعنا التفاعل بين بروتين الزانثاتين و Keap1 بالإضافة إلى وضع الربط من خلال تحليل الالتحام الجزيئي ، متبوعا بالتحقق من التفاعل باستخدام مقايسة CETSA. أظهرت نتائجنا أن الزانثاتين يمكن أن ينشئ روابط هيدروجينية مع بقايا أحماض أمينية محددة من بروتين Keap1 ويقلل من الثبات الحراري لبروتين Keap1 ، مما يشير إلى أن الزانثاتين يمكن أن يتفاعل مباشرة مع بروتين Keap1.
Introduction
البروتينات هي جزيئات كبيرة الأهمية في الكائنات الحية وتمتلك مجموعة متنوعة من الوظائف الفريدة داخل الخلايا ، مثل تكوين الغشاء ، وتكوين الهيكل الخلوي ، ونشاط الإنزيم ، والنقل ، وإشارات الخلية ، والمشاركة في كل من الآليات داخل الخلايا وخارجها1،2،3. تظهر البروتينات وظائفها البيولوجية في المقام الأول من خلال تفاعلات محددة مع مجموعة متنوعة من الجزيئات ، بما في ذلك البروتينات الأخرى والأحماض النووية وروابط الجزيئات الصغيرة وأيونات المعادن 1,4. الروابط هي مركبات جزيئية صغيرة ترتبط تحديدا بالبروتينات في الكائن الحي. يحدث التفاعل بين البروتينات والروابط في مواقع محددة على البروتين ، تسمى مواقع الربط ، والمعروفة أيضا باسم جيوب الربط5. في أبحاث الكيمياء الطبية ، يكمن التركيز في تحديد البروتينات الرئيسية المرتبطة بوضوح بالأمراض ، والتي تعمل كأهداف للعقاقير6. لذلك ، فإن اكتساب فهم عميق لمواقع الارتباط بين البروتينات والروابط له أهمية قصوى في تعزيز اكتشاف الأدوية وتصميمها والبحثعنها 7,8.
الالتحام الجزيئي هو أداة حسابية مستخدمة على نطاق واسع لدراسة ارتباط البروتين ، والذي يستخدم الهياكل ثلاثية الأبعاد للبروتينات والروابط لاستكشاف أنماط الارتباط الأولية والصلات عند تكوين معقدات مستقرة9،10،11. تطبيق تكنولوجيا الالتحام الجزيئي نشأت في سبعينيات القرن العشرين. استنادا إلى مبدأ القفل والاقتران بالمفاتيح واستخدام خوارزميات برامج الإرساء الجزيئي ، يمكن للمرء تحديد التفاعل بين المركبات والأهداف الجزيئية من خلال تحليل نتائج الإرساء. يتيح هذا النهج التنبؤ بمواقع الارتباط النشطة لكل من المركب والجزيء المستهدف. وبالتالي ، فإنه يسهل تحديد شكل الربط الأمثل (يسمى هنا نموذج الربط) لتفاعلات مستقبلات الرباط ، وهو أمر بالغ الأهمية لفهم آليات هذه الارتباطات الجزيئية12،13،14،15. بينما يوفر الالتحام الجزيئي تنبؤات قيمة قائمة على الكمبيوتر لتفاعلات مستقبلات الرباط ، من المهم ملاحظة أن هذه نتائج أولية. وبالتالي ، فإن المزيد من التحقق التجريبي ضروري لتأكيد هذه التفاعلات.
يعمل اختبار التحول الحراري الخلوي (CETSA) ، الذي اقترحه في البداية فريق بحث Pär Nordlund في عام 2013 ، كطريقة للتحقق من صحة تفاعلات البروتين المستهدف للدواء. تختبر هذه التقنية على وجه التحديد الاستقرار الحراري للبروتينات المستهدفة الناتجة عن ربط الدواء ، مما يوفر نهجا عمليا لتأكيد التفاعلات الجزيئية16،17،18. يعتمد هذا النهج على المبدأ الأساسي القائل بأن ربط الليجند يبدأ تحولا حراريا داخل البروتينات المستهدفة وينطبق على مجموعة واسعة من العينات البيولوجية ، بما في ذلك محللات الخلايا والخلايا الحية السليمة والأنسجة19,20. يدعم CETSA المشاركة المستهدفة المباشرة للجزيئات الصغيرة في الخلايا السليمة عن طريق الكشف عن الاستقرار الديناميكي الحراري للبروتينات بسبب ارتباط الرباط وربط الاستجابة المظهرية المرصودة بالمركب المستهدف21,22. من بين المنهجيات المختلفة المستمدة من CETSA ، يعتبر Western Blot-CETSA (WB-CETSA) نهجا كلاسيكيا. بعد تحضير العينة باستخدام طريقة CETSA ، يتم استخدام تحليل اللطخة الغربية للكشف عن التغيرات في الاستقرار الحراري للبروتين المستهدف. هذا يسمح بالتحديد الدقيق لتفاعلات البروتين الدوائي داخل الأنظمة الخلوية 17,23.
Xanthatin هو مركب نشط بيولوجيا معزول من نبات Xanthium L. مع خصائص مثل المضادة للالتهابات ، والتي تم استخدامها في الطب الصيني التقليدي لعلاج أمراض مثل التهاب الجيوب الأنفية والتهاب المفاصل24,25. البروتين 1 المرتبط ب ech الشبيه ب kelch (Keap1) هو أحد مكونات مركب البروتين متعدد الوحدات متعدد الوحدات Cullin-RING E3 ubiquitin ligase القائم على Cullin3 ومنظم مهم لتوازن الأكسدة والاختزال داخل الخلايا ، والذي يؤثر على شدة ومدة الاستجابة الالتهابية عن طريق تعديل حالة الأكسدة والاختزال داخل الخلايا26. في هذه الدراسة ، استخدمنا أولا الالتحام الجزيئي للتحقيق في التفاعل بين الزانثاتين (جزيء صغير) وبروتين Keap1 ، بهدف التنبؤ بوضع الارتباط الخاص بهما. بعد ذلك ، استخدمنا طريقة CETSA للتحقق من صحة هذا التفاعل من خلال تقييم تأثير الزانثاتين على الاستقرار الحراري لبروتين Keap1.
Protocol
Representative Results
Discussion
يرتبط تحديد أهداف المرض واكتشاف الأدوية وتطويرها ارتباطا وثيقا27. من خلال استهداف أهداف محددة بدقة ، يمكن تطوير الأدوية المرشحة لعلاج أمراض معينة بشكل أكثر فعالية مع تقليل الآثار الجانبية المرتبطة بالأدوية28,29 في نفس الوقت. الأهداف الأكثر استخ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82004031) وبرنامج سيتشوان للعلوم والتكنولوجيا (2022NSFSC1303). نعرب عن تقديرنا الكبير لجيايي صن في المعهد المبتكر للطب الصيني والصيدلة ، جامعة تشنغدو للطب الصيني التقليدي ، للمساعدة في اللطخة الغربية.
Materials
| 0.45 μm Polyvinylidene fluoride membrane | Millipore | PR05509 | |
| Anhydrous ethanol | Chron chemicals | 64-17-5 | |
| Bovine serum albumin | BioFroxx | 4240GR100 | |
| Broad-spectrum protease inhibitor mixtures | Boster Biological Technology Co., Ltd | AR1193 | |
| DMSO | Boster Biological Technology Co., Ltd | PYG0040 | |
| Enhanced chemiluminescence reagent | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | P0018S | |
| GAPDH antibody | ProteinTech Group Co., Ltd | 10494-1-AP | |
| Gel Imaging Instrument | E-BLOT | Touch Imager Pro | |
| Gradient PCR instrument | Biometra TADVANCED | Biometra Tadvanced 96SG | |
| High-speed freezing centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-30R | |
| Horseradish peroxidase-conjugated affiniPure goat antibody | ProteinTech Group Co., Ltd | SA00001-2 | |
| Isopropyl alcohol | Chron chemicals | 67-63-0 | |
| Keap1 antibody | Zen BioScience Co., Ltd | R26935 | |
| Metal bath | Analytik Jena | TSC | |
| Methanol | Chron chemicals | 67-56-1 | |
| Ncmblot rapid transfer buffer (20×) | NCM Biotech Co., Ltd | WB4600 | |
| Omni-Easy OneStep PAGE gel fast preparation kie | Epizyme Biotech Co., Ltd | PG212 | |
| Phosphate buffer saline | Boster Biological Technology Co., Ltd | PYG0021 | |
| Prestained Color Protein Marker | Biosharp | BL741A | |
| Protein Blotting Electrophoresis System | Bio-Rad | MiniPROTEANÒTetra Cell | |
| RAW264.7 cell | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | C7505 | |
| RAW264.7 cell-specific medium | Procell Life Science&Technology Co., Ltd | CM-0597 | |
| SDS-PAGE protein loading buffer | Boster Biological Technology Co., Ltd | AR1112-10 | |
| SDS-PAGE running buffer powder | Servicebio | G2018 | |
| Tris buffered saline powder | Servicebio | G0001 | |
| Tween 20 | BioFroxx | 1247ML100 | |
| Water bath | Memmert | WNE10 | |
| Water purifier | Millipore | Milli- IQ 7005 | |
| Xanthatin | ChemConst Biotechnology Co., Ltd | CONST210706 |
References
- Soleymani, F., Paquet, E., Viktor, H., Michalowski, W., Spinello, D. Protein-protein interaction prediction with deep learning: A comprehensive review. Computat Struct Biotechnol J. 20, 5316-5341 (2022).
- Du, X., et al. Insights into protein-ligand interactions: mechanisms, models, and methods. Int J Mol Sci. 17 (2), 144 (2016).
- Wu, Q., Peng, Z., Zhang, Y., Yang, J. COACH-D: improved protein-ligand binding sites prediction with refined ligand-binding poses through molecular docking. Nucleic Acids Res. 46, W438-W442 (2018).
- Zhang, F., et al. PROBselect: accurate prediction of protein-binding residues from proteins sequences via dynamic predictor selection. Bioinfo. 36, i735-i744 (2020).
- Kandel, J., Tayara, H., Chong, K. T. PUResNet: prediction of protein-ligand binding sites using deep residual neural network. J Cheminfo. 13 (1), 65 (2021).
- Dhakal, A., Mckay, C., Tanner, J. J., Cheng, J. Artificial intelligence in the prediction of protein-ligand interactions: recent advances and future directions. Brief Bioinform. 23 (1), 476 (2022).
- Hatty, C. R., Banati, R. B. Protein-ligand and membrane-ligand interactions in pharmacology: the case of the translocator protein (TSPO). Pharmacol Res. 100, 58-63 (2015).
- Chaires, J. B. Calorimetry and thermodynamics in drug design. Ann Rev Biophys. 37, 135-151 (2008).
- Huang, S. Y., Zou, X. Advances and challenges in protein-ligand docking. Int J Mo Sci. 11 (8), 3016-3034 (2010).
- Li, J., Fu, A., Zhang, L. An overview of scoring functions used for protein-ligand interactions in molecular docking. Interdiscip Sci. 11 (2), 320-328 (2019).
- Crampon, K., Giorkallos, A., Deldossi, M., Baud, S., Steffenel, L. A. Machine-learning methods for ligand-protein molecular docking. Drug Discov Today. 27 (1), 151-164 (2022).
- Pinzi, L., Rastelli, G. Molecular docking: Shifting paradigms in drug discovery. Int J Mol Sci. 20 (18), 4331 (2019).
- Abdolmaleki, A., Ghasemi, F., Ghasemi, J. B. Computer-aided drug design to explore cyclodextrin therapeutics and biomedical applications. Chem Biol Drug Des. 89 (2), 257-268 (2017).
- Chen, G., Seukep, A. J., Guo, M. Recent advances in molecular docking for the research and discovery of potential marine drugs. Mar Drugs. 18 (11), 545 (2020).
- Li, T., Guo, R., Zong, Q., Ling, G. Application of molecular docking in elaborating molecular mechanisms and interactions of supramolecular cyclodextrin. Carbohydr Polym. 276, 118644 (2022).
- Martinez Molina, D., et al. Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay. Science. 341 (6141), 84-87 (2013).
- Tu, Y., Tan, L., Tao, H., Li, Y., Liu, H. CETSA and thermal proteome profiling strategies for target identification and drug discovery of natural products. Phytomedicine. 116, 154862 (2023).
- Dai, L., et al. Horizontal cell biology: Monitoring global changes of protein interaction states with the proteome-wide cellular thermal shift assay (CETSA). Annu Rev Biochem. 88, 383-408 (2019).
- Lade, D. M., Nicoletti, R., Mersch, J., Agazie, Y. M. Design and synthesis of improved active-site SHP2 inhibitors with anti-breast cancer cell effects. Eur J Med Chem. 247, 115017 (2023).
- Jiang, X., et al. Novel chemical-structure TPOR agonist, TMEA, promotes megakaryocytes differentiation and thrombopoiesis via mTOR and ERK signalings. Phytomedicine. 110, 154637 (2023).
- Mateus, A., et al. Thermal proteome profiling for interrogating protein interactions. Mol Syst Biol. 16 (3), 9232 (2020).
- Sanchez, T. W., et al. Real-time cellular thermal shift assay to monitor target engagement. ACS Chem Biol. 17 (9), 2471-2482 (2022).
- Tolvanen, T. A. Current advances in CETSA. Front Mol Biosci. 9, 866764 (2022).
- Liu, M., et al. Xanthatin inhibits STAT3 and NF-κB signalling by covalently binding to JAK and IKK kinases. J Cell Mol Med. 23 (6), 4301-4312 (2019).
- Liu, Y., Chen, W., Zheng, F., Yu, H., Wei, K. Xanthatin alleviates LPS-Induced inflammatory response in RAW264.7 macrophages by Inhibiting NF-κB, MAPK and STATs activation. Molecules. 27 (14), 4603 (2022).
- Dinkova-Kostova, A. T., Kostov, R. V., Canning, P. Keap1, the cysteine-based mammalian intracellular sensor for electrophiles and oxidants. Arch Biochem Biophys. 617, 84-93 (2017).
- Tabana, Y., Babu, D., Fahlman, R., Siraki, A. G., Barakat, K. Target identification of small molecules: An overview of the current applications in drug discovery. BMC Biotechnol. 23 (1), 44 (2023).
- Schenone, M., Dančík, V., Wagner, B. K., Clemons, P. A. Target identification and mechanism of action in chemical biology and drug discovery. Nat Chem Biol. 9 (4), 232-240 (2013).
- Hughes, J. P., Rees, S., Kalindjian, S. B., Philpott, K. L. Principles of early drug discovery. Br J Pharmacol. 162 (6), 1239-1249 (2011).
- Chakraborty, C., et al. SARS-CoV-2 protein drug targets landscape: A potential pharmacological insight view for the new drug development. Expert Rev Clin Pharmacol. 14 (2), 225-238 (2021).
- Ziegler, S., Pries, V., Hedberg, C., Waldmann, H. Target identification for small bioactive molecules: Finding the needle in the haystack. Angew Chem Int Ed Engl. 52 (10), 2744-2792 (2013).
- Zhang, X., et al. Highly effective identification of drug targets at the proteome level by pH-dependent protein precipitation. Chem Sci. 13 (42), 12403-12418 (2022).
- Zhang, X., et al. A simplified thermal proteome profiling approach to screen protein targets of a ligand. Proteomics. 20, 1900372 (2020).
- Hou, Y., et al. Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway. Phytomedicine. 109, 154568 (2022).
- Wang, X., et al. Salidroside, a phenyl ethanol glycoside from Rhodiolacrenulata, orchestrates hypoxic mitochondrial dynamics homeostasis by stimulating Sirt1/p53/Drp1 signaling. J Ethnopharmacol. 293, 115278 (2022).
