Proteinmålforudsigelse og validering af småmolekyleforbindelse
Summary
Eksperimentet, der anvendes her, viser en metode til molekylær docking kombineret med cellulær termisk skiftanalyse for at forudsige og validere interaktionen mellem små molekyler og proteinmål.
Abstract
Proteiner er grundlæggende for menneskets fysiologi, og deres mål er afgørende for forskning og lægemiddeludvikling. Identifikation og validering af afgørende proteinmål er blevet en integreret del af lægemiddeludviklingen. Molekylær docking er et beregningsværktøj, der i vid udstrækning anvendes til at undersøge protein-ligandbinding, især i forbindelse med lægemiddel- og proteinmålinteraktioner. Til eksperimentel verifikation af bindingen og for at få direkte adgang til bindingen af lægemidlet og dets mål anvendes metoden cellulær termisk forskydningsanalyse (CETSA). Denne undersøgelse havde til formål at integrere molekylær docking med CETSA for at forudsige og validere interaktioner mellem lægemidler og vitale proteinmål. Specifikt forudsagde vi interaktionen mellem xanthatin og Keap1-protein såvel som dets bindingstilstand gennem molekylær dockinganalyse efterfulgt af verifikation af interaktionen ved hjælp af CETSA-assayet. Vores resultater viste, at xanthatin kunne etablere hydrogenbindinger med specifikke aminosyrerester af Keap1-protein og reducere termostabiliteten af Keap1-proteinet, hvilket indikerer, at xanthatin direkte kunne interagere med Keap1-proteinet.
Introduction
Proteiner er meget vigtige makromolekyler i levende organismer og besidder en bred vifte af unikke funktioner i celler, såsom membransammensætning, cytoskeletdannelse, enzymaktivitet, transport, cellesignalering og involvering i både intracellulære og ekstracellulære mekanismer 1,2,3. Proteiner manifesterer deres biologiske funktioner primært gennem specifikke interaktioner med en række molekyler, herunder andre proteiner, nukleinsyrer, små molekyleligander og metalioner 1,4. Ligander er små molekylære forbindelser, der specifikt binder til proteiner i en organisme. Interaktionen mellem proteiner og ligander forekommer på bestemte steder på proteinet, kaldet bindingsstederne, også kendt som bindingslommerne5. I medicinalkemisk forskning ligger fokus på at identificere nøgleproteiner, der klart er forbundet med sygdomme, som tjener som mål for lægemidler6. Derfor er det yderst vigtigt at få en dyb forståelse af bindingsstederne mellem proteiner og ligander for at fremme lægemiddelopdagelse, design og forskning 7,8.
Molekylær docking er et meget anvendt beregningsværktøj til undersøgelse af protein-ligandbinding, der anvender de tredimensionelle strukturer af proteiner og ligander til at udforske deres primære bindingstilstande og affiniteter, når de danner stabile komplekser 9,10,11. Anvendelsen af molekylær dockingteknologi stammer fra 1970’erne. Baseret på låse- og nøgleparringsprincippet og ved hjælp af algoritmerne i molekylær dockingsoftware kan man bestemme interaktionen mellem forbindelser og molekylære mål ved at analysere dockingresultater. Denne fremgangsmåde muliggør forudsigelse af aktive bindingssteder for både forbindelsen og målmolekylet. Derfor letter det identifikationen af en optimal bindingskonformation (her kaldet bindingsmodellen) for ligand-receptorinteraktioner, hvilket er afgørende for at forstå mekanikken i disse molekylære engagementer 12,13,14,15. Mens molekylær docking giver værdifulde computerbaserede forudsigelser af ligandreceptorinteraktioner, er det vigtigt at bemærke, at disse er foreløbige resultater. Derfor er yderligere eksperimentel verifikation afgørende for at bekræfte disse interaktioner.
Det cellulære termiske skiftassay (CETSA), der oprindeligt blev foreslået af Pär Nordlunds forskergruppe i 2013, fungerer som en metode til validering af lægemiddelmålproteininteraktioner. Denne teknik tester specifikt den termiske stabilitet af målproteiner induceret af lægemiddelbinding, hvilket giver en praktisk tilgang til bekræftelse af molekylære interaktioner 16,17,18. Denne tilgang er baseret på det grundlæggende princip, at ligandbinding initierer et termisk skift inden for målproteiner og kan anvendes på en bred vifte af biologiske prøver, herunder cellelysater, intakte levende celler og væv19,20. CETSA understøtter direkte målengagement af små molekyler i intakte celler ved at detektere termodynamisk stabilisering af proteiner på grund af ligandbinding og forbinde det observerede fænotypiske respons med målforbindelsen21,22. Blandt de forskellige metoder, der stammer fra CETSA, betragtes Western Blot-CETSA (WB-CETSA) som en klassisk tilgang. Efter prøveforberedelse ved hjælp af CETSA-metoden anvendes western blot-analyse til at detektere ændringer i målproteinets termiske stabilitet. Dette muliggør præcis bestemmelse af lægemiddel-proteininteraktioner inden for cellulære systemer17,23.
Xanthatin er en bioaktiv forbindelse isoleret fra planten Xanthium L. med egenskaber som antiinflammatorisk, som er blevet brugt i traditionel kinesisk medicin til behandling af sygdomme som nasal bihulebetændelse og arthritis24,25. Det kelch-lignende ECH-associerede protein 1 (Keap1) er en komponent i det Cullin3-baserede Cullin-RING E3 ubiquitin ligase multi-subunit proteinkompleks og en vigtig regulator af intracellulær redoxhomeostase, som påvirker intensiteten og varigheden af det inflammatoriske respons ved at modulere den intracellulære redoxtilstand26. I denne undersøgelse brugte vi først molekylær docking til at undersøge interaktionen mellem xanthatin (lille molekyle) og Keap1-protein med det formål at forudsige deres bindingstilstand. Efterfølgende anvendte vi CETSA-metoden til at validere denne interaktion ved at vurdere virkningen af xanthatin på Keap1-proteinets termiske stabilitet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Identificering af sygdomsmål og opdagelse og udvikling af lægemidler er tæt forbundne27. Ved præcist at målrette specifikke mål kan lægemiddelkandidater udvikles til at behandle bestemte sygdomme mere effektivt og samtidig minimere bivirkningerne forbundet med lægemidlerne28,29. De mest almindeligt anvendte mål er proteinmål30. Identifikationen af særlige proteinmål udgør imidlertid en enorm udfordring …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (82004031) og Sichuan Science and Technology Program (2022NSFSC1303). Vi udtrykker vores store påskønnelse til Jiayi Sun på Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, for hjælpen med western blot.
Materials
| 0.45 μm Polyvinylidene fluoride membrane | Millipore | PR05509 | |
| Anhydrous ethanol | Chron chemicals | 64-17-5 | |
| Bovine serum albumin | BioFroxx | 4240GR100 | |
| Broad-spectrum protease inhibitor mixtures | Boster Biological Technology Co., Ltd | AR1193 | |
| DMSO | Boster Biological Technology Co., Ltd | PYG0040 | |
| Enhanced chemiluminescence reagent | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | P0018S | |
| GAPDH antibody | ProteinTech Group Co., Ltd | 10494-1-AP | |
| Gel Imaging Instrument | E-BLOT | Touch Imager Pro | |
| Gradient PCR instrument | Biometra TADVANCED | Biometra Tadvanced 96SG | |
| High-speed freezing centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-30R | |
| Horseradish peroxidase-conjugated affiniPure goat antibody | ProteinTech Group Co., Ltd | SA00001-2 | |
| Isopropyl alcohol | Chron chemicals | 67-63-0 | |
| Keap1 antibody | Zen BioScience Co., Ltd | R26935 | |
| Metal bath | Analytik Jena | TSC | |
| Methanol | Chron chemicals | 67-56-1 | |
| Ncmblot rapid transfer buffer (20×) | NCM Biotech Co., Ltd | WB4600 | |
| Omni-Easy OneStep PAGE gel fast preparation kie | Epizyme Biotech Co., Ltd | PG212 | |
| Phosphate buffer saline | Boster Biological Technology Co., Ltd | PYG0021 | |
| Prestained Color Protein Marker | Biosharp | BL741A | |
| Protein Blotting Electrophoresis System | Bio-Rad | MiniPROTEANÒTetra Cell | |
| RAW264.7 cell | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | C7505 | |
| RAW264.7 cell-specific medium | Procell Life Science&Technology Co., Ltd | CM-0597 | |
| SDS-PAGE protein loading buffer | Boster Biological Technology Co., Ltd | AR1112-10 | |
| SDS-PAGE running buffer powder | Servicebio | G2018 | |
| Tris buffered saline powder | Servicebio | G0001 | |
| Tween 20 | BioFroxx | 1247ML100 | |
| Water bath | Memmert | WNE10 | |
| Water purifier | Millipore | Milli- IQ 7005 | |
| Xanthatin | ChemConst Biotechnology Co., Ltd | CONST210706 |
References
- Soleymani, F., Paquet, E., Viktor, H., Michalowski, W., Spinello, D. Protein-protein interaction prediction with deep learning: A comprehensive review. Computat Struct Biotechnol J. 20, 5316-5341 (2022).
- Du, X., et al. Insights into protein-ligand interactions: mechanisms, models, and methods. Int J Mol Sci. 17 (2), 144 (2016).
- Wu, Q., Peng, Z., Zhang, Y., Yang, J. COACH-D: improved protein-ligand binding sites prediction with refined ligand-binding poses through molecular docking. Nucleic Acids Res. 46, W438-W442 (2018).
- Zhang, F., et al. PROBselect: accurate prediction of protein-binding residues from proteins sequences via dynamic predictor selection. Bioinfo. 36, i735-i744 (2020).
- Kandel, J., Tayara, H., Chong, K. T. PUResNet: prediction of protein-ligand binding sites using deep residual neural network. J Cheminfo. 13 (1), 65 (2021).
- Dhakal, A., Mckay, C., Tanner, J. J., Cheng, J. Artificial intelligence in the prediction of protein-ligand interactions: recent advances and future directions. Brief Bioinform. 23 (1), 476 (2022).
- Hatty, C. R., Banati, R. B. Protein-ligand and membrane-ligand interactions in pharmacology: the case of the translocator protein (TSPO). Pharmacol Res. 100, 58-63 (2015).
- Chaires, J. B. Calorimetry and thermodynamics in drug design. Ann Rev Biophys. 37, 135-151 (2008).
- Huang, S. Y., Zou, X. Advances and challenges in protein-ligand docking. Int J Mo Sci. 11 (8), 3016-3034 (2010).
- Li, J., Fu, A., Zhang, L. An overview of scoring functions used for protein-ligand interactions in molecular docking. Interdiscip Sci. 11 (2), 320-328 (2019).
- Crampon, K., Giorkallos, A., Deldossi, M., Baud, S., Steffenel, L. A. Machine-learning methods for ligand-protein molecular docking. Drug Discov Today. 27 (1), 151-164 (2022).
- Pinzi, L., Rastelli, G. Molecular docking: Shifting paradigms in drug discovery. Int J Mol Sci. 20 (18), 4331 (2019).
- Abdolmaleki, A., Ghasemi, F., Ghasemi, J. B. Computer-aided drug design to explore cyclodextrin therapeutics and biomedical applications. Chem Biol Drug Des. 89 (2), 257-268 (2017).
- Chen, G., Seukep, A. J., Guo, M. Recent advances in molecular docking for the research and discovery of potential marine drugs. Mar Drugs. 18 (11), 545 (2020).
- Li, T., Guo, R., Zong, Q., Ling, G. Application of molecular docking in elaborating molecular mechanisms and interactions of supramolecular cyclodextrin. Carbohydr Polym. 276, 118644 (2022).
- Martinez Molina, D., et al. Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay. Science. 341 (6141), 84-87 (2013).
- Tu, Y., Tan, L., Tao, H., Li, Y., Liu, H. CETSA and thermal proteome profiling strategies for target identification and drug discovery of natural products. Phytomedicine. 116, 154862 (2023).
- Dai, L., et al. Horizontal cell biology: Monitoring global changes of protein interaction states with the proteome-wide cellular thermal shift assay (CETSA). Annu Rev Biochem. 88, 383-408 (2019).
- Lade, D. M., Nicoletti, R., Mersch, J., Agazie, Y. M. Design and synthesis of improved active-site SHP2 inhibitors with anti-breast cancer cell effects. Eur J Med Chem. 247, 115017 (2023).
- Jiang, X., et al. Novel chemical-structure TPOR agonist, TMEA, promotes megakaryocytes differentiation and thrombopoiesis via mTOR and ERK signalings. Phytomedicine. 110, 154637 (2023).
- Mateus, A., et al. Thermal proteome profiling for interrogating protein interactions. Mol Syst Biol. 16 (3), 9232 (2020).
- Sanchez, T. W., et al. Real-time cellular thermal shift assay to monitor target engagement. ACS Chem Biol. 17 (9), 2471-2482 (2022).
- Tolvanen, T. A. Current advances in CETSA. Front Mol Biosci. 9, 866764 (2022).
- Liu, M., et al. Xanthatin inhibits STAT3 and NF-κB signalling by covalently binding to JAK and IKK kinases. J Cell Mol Med. 23 (6), 4301-4312 (2019).
- Liu, Y., Chen, W., Zheng, F., Yu, H., Wei, K. Xanthatin alleviates LPS-Induced inflammatory response in RAW264.7 macrophages by Inhibiting NF-κB, MAPK and STATs activation. Molecules. 27 (14), 4603 (2022).
- Dinkova-Kostova, A. T., Kostov, R. V., Canning, P. Keap1, the cysteine-based mammalian intracellular sensor for electrophiles and oxidants. Arch Biochem Biophys. 617, 84-93 (2017).
- Tabana, Y., Babu, D., Fahlman, R., Siraki, A. G., Barakat, K. Target identification of small molecules: An overview of the current applications in drug discovery. BMC Biotechnol. 23 (1), 44 (2023).
- Schenone, M., Dančík, V., Wagner, B. K., Clemons, P. A. Target identification and mechanism of action in chemical biology and drug discovery. Nat Chem Biol. 9 (4), 232-240 (2013).
- Hughes, J. P., Rees, S., Kalindjian, S. B., Philpott, K. L. Principles of early drug discovery. Br J Pharmacol. 162 (6), 1239-1249 (2011).
- Chakraborty, C., et al. SARS-CoV-2 protein drug targets landscape: A potential pharmacological insight view for the new drug development. Expert Rev Clin Pharmacol. 14 (2), 225-238 (2021).
- Ziegler, S., Pries, V., Hedberg, C., Waldmann, H. Target identification for small bioactive molecules: Finding the needle in the haystack. Angew Chem Int Ed Engl. 52 (10), 2744-2792 (2013).
- Zhang, X., et al. Highly effective identification of drug targets at the proteome level by pH-dependent protein precipitation. Chem Sci. 13 (42), 12403-12418 (2022).
- Zhang, X., et al. A simplified thermal proteome profiling approach to screen protein targets of a ligand. Proteomics. 20, 1900372 (2020).
- Hou, Y., et al. Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway. Phytomedicine. 109, 154568 (2022).
- Wang, X., et al. Salidroside, a phenyl ethanol glycoside from Rhodiolacrenulata, orchestrates hypoxic mitochondrial dynamics homeostasis by stimulating Sirt1/p53/Drp1 signaling. J Ethnopharmacol. 293, 115278 (2022).
