Voorspelling en validatie van eiwitdoelen van een verbinding met kleine moleculen
Summary
Het experiment dat hier wordt gebruikt, toont een methode van moleculaire docking in combinatie met cellulaire thermische verschuivingstest om de interactie tussen kleine moleculen en eiwitdoelen te voorspellen en te valideren.
Abstract
Eiwitten zijn van fundamenteel belang voor de menselijke fysiologie, waarbij hun doelwitten cruciaal zijn in onderzoek en de ontwikkeling van geneesmiddelen. De identificatie en validatie van cruciale eiwitdoelen is een integraal onderdeel geworden van de ontwikkeling van geneesmiddelen. Moleculaire docking is een computationeel hulpmiddel dat veel wordt gebruikt om eiwit-ligandbinding te onderzoeken, vooral in de context van geneesmiddel- en eiwitdoelinteracties. Voor de experimentele verificatie van de binding en om rechtstreeks toegang te krijgen tot de binding van het geneesmiddel en zijn doelwit, wordt de cellulaire thermische verschuivingstest (CETSA) -methode gebruikt. Deze studie had tot doel moleculaire docking te integreren met CETSA om interacties tussen geneesmiddelen en vitale eiwitdoelen te voorspellen en te valideren. In het bijzonder hebben we de interactie tussen xanthatine en Keap1-eiwit voorspeld, evenals de bindingsmodus door middel van moleculaire docking-analyse, gevolgd door verificatie van de interactie met behulp van de CETSA-test. Onze resultaten toonden aan dat xanthatine waterstofbruggen kon aangaan met specifieke aminozuurresiduen van het Keap1-eiwit en de thermostabiliteit van het Keap1-eiwit kon verminderen, wat aangeeft dat xanthatine direct zou kunnen interageren met het Keap1-eiwit.
Introduction
Eiwitten zijn zeer belangrijke macromoleculen in levende organismen en bezitten een breed scala aan unieke functies in cellen, zoals membraansamenstelling, vorming van cytoskeletten, enzymactiviteit, transport, celsignalering en betrokkenheid bij zowel intracellulaire als extracellulaire mechanismen 1,2,3. Eiwitten manifesteren hun biologische functies voornamelijk door specifieke interacties met een verscheidenheid aan moleculen, waaronder andere eiwitten, nucleïnezuren, liganden van kleine moleculen en metaalionen 1,4. Liganden zijn kleine moleculaire verbindingen die specifiek binden aan eiwitten in een organisme. De interactie tussen eiwitten en liganden vindt plaats op specifieke plaatsen op het eiwit, de bindingsplaatsen genoemd, ook wel bekend als de bindingspockets5. In medicinaal-chemisch onderzoek ligt de focus op het identificeren van sleuteleiwitten die duidelijk geassocieerd zijn met ziekten, die dienen als doelwit voor geneesmiddelen6. Daarom is het verkrijgen van een diepgaand begrip van de bindingsplaatsen tussen eiwitten en liganden van het grootste belang bij het bevorderen van de ontdekking, het ontwerp en het onderzoek van geneesmiddelen 7,8.
Moleculaire docking is een veelgebruikt computationeel hulpmiddel voor het bestuderen van eiwit-ligandbinding, waarbij de driedimensionale structuren van eiwitten en liganden worden gebruikt om hun primaire bindingsmodi en affiniteiten te verkennen bij het vormen van stabiele complexen 9,10,11. De toepassing van moleculaire dockingtechnologie is ontstaan in de jaren 1970. Op basis van het principe van slot- en sleutelkoppeling en met behulp van de algoritmen van moleculaire dockingsoftware, kan men de interactie tussen verbindingen en moleculaire doelen bepalen door dockingresultaten te analyseren. Deze aanpak maakt het mogelijk om actieve bindingsplaatsen te voorspellen voor zowel de verbinding als het doelmolecuul. Bijgevolg vergemakkelijkt het de identificatie van een optimale bindingsconformatie (hier het bindingsmodel genoemd) voor ligand-receptorinteracties, wat cruciaal is voor het begrijpen van de mechanica van deze moleculaire engagementen 12,13,14,15. Hoewel moleculaire docking waardevolle computergebaseerde voorspellingen van ligand-receptorinteracties oplevert, is het belangrijk op te merken dat dit voorlopige bevindingen zijn. Bijgevolg is verdere experimentele verificatie essentieel om deze interacties te bevestigen.
De cellulaire thermische verschuivingstest (CETSA), oorspronkelijk voorgesteld door het onderzoeksteam van Pär Nordlund in 2013, dient als een methode voor het valideren van geneesmiddel-doelwit-eiwitinteracties. Deze techniek test specifiek de thermische stabiliteit van doeleiwitten die worden geïnduceerd door geneesmiddelbinding, en biedt een praktische benadering voor het bevestigen van moleculaire interacties 16,17,18. Deze benadering is gebaseerd op het fundamentele principe dat ligandbinding een thermische verschuiving binnen doeleiwitten initieert en is van toepassing op een breed scala aan biologische monsters, waaronder cellysaten, intacte levende cellen en weefsels19,20. CETSA ondersteunt directe doelbetrokkenheid van kleine moleculen in intacte cellen door thermodynamische stabilisatie van eiwitten als gevolg van ligandbinding te detecteren en de waargenomen fenotypische respons te koppelen aan de doelverbinding21,22. Van de verschillende methodologieën die van CETSA zijn afgeleid, wordt Western Blot-CETSA (WB-CETSA) beschouwd als een klassieke benadering. Na monstervoorbereiding met behulp van de CETSA-methode wordt western blot-analyse gebruikt om veranderingen in de thermische stabiliteit van het doeleiwit te detecteren. Dit maakt de nauwkeurige bepaling van geneesmiddel-eiwitinteracties binnen cellulaire systemen mogelijk17,23.
Xanthatin is een bioactieve stof geïsoleerd uit de plant Xanthium L. met eigenschappen zoals ontstekingsremmend, die in de traditionele Chinese geneeskunde wordt gebruikt om ziekten zoals neusbijholteontsteking en artritis te behandelen24,25. Het kelch-achtige ECH-geassocieerde eiwit 1 (Keap1) is een onderdeel van het op Cullin3 gebaseerde Cullin-RING E3 ubiquitineligase multi-subunit eiwitcomplex en een belangrijke regulator van intracellulaire redoxhomeostase, die de intensiteit en duur van de ontstekingsreactie beïnvloedt door de intracellulaire redoxtoestand te moduleren26. In deze studie gebruikten we eerst moleculaire docking om de interactie tussen xanthatine (klein molecuul) en Keap1-eiwit te onderzoeken, met als doel hun bindingsmodus te voorspellen. Vervolgens hebben we de CETSA-methode gebruikt om deze interactie te valideren door de impact van xanthatine op de thermische stabiliteit van het Keap1-eiwit te beoordelen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De identificatie van ziektedoelwitten en de ontdekking en ontwikkeling van geneesmiddelen zijn nauw met elkaar verbonden27. Door zich precies op specifieke doelen te richten, kunnen kandidaat-geneesmiddelen worden ontwikkeld om bepaalde ziekten effectiever te behandelen en tegelijkertijd de bijwerkingen van de geneesmiddelen te minimaliseren28,29. De meest gebruikte targets zijn eiwittargets30. De identificatie van …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (82004031) en het Sichuan Science and Technology Program (2022NSFSC1303). We spreken onze grote waardering uit voor Jiayi Sun van het Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, voor de hulp bij western blot.
Materials
| 0.45 μm Polyvinylidene fluoride membrane | Millipore | PR05509 | |
| Anhydrous ethanol | Chron chemicals | 64-17-5 | |
| Bovine serum albumin | BioFroxx | 4240GR100 | |
| Broad-spectrum protease inhibitor mixtures | Boster Biological Technology Co., Ltd | AR1193 | |
| DMSO | Boster Biological Technology Co., Ltd | PYG0040 | |
| Enhanced chemiluminescence reagent | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | P0018S | |
| GAPDH antibody | ProteinTech Group Co., Ltd | 10494-1-AP | |
| Gel Imaging Instrument | E-BLOT | Touch Imager Pro | |
| Gradient PCR instrument | Biometra TADVANCED | Biometra Tadvanced 96SG | |
| High-speed freezing centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-30R | |
| Horseradish peroxidase-conjugated affiniPure goat antibody | ProteinTech Group Co., Ltd | SA00001-2 | |
| Isopropyl alcohol | Chron chemicals | 67-63-0 | |
| Keap1 antibody | Zen BioScience Co., Ltd | R26935 | |
| Metal bath | Analytik Jena | TSC | |
| Methanol | Chron chemicals | 67-56-1 | |
| Ncmblot rapid transfer buffer (20×) | NCM Biotech Co., Ltd | WB4600 | |
| Omni-Easy OneStep PAGE gel fast preparation kie | Epizyme Biotech Co., Ltd | PG212 | |
| Phosphate buffer saline | Boster Biological Technology Co., Ltd | PYG0021 | |
| Prestained Color Protein Marker | Biosharp | BL741A | |
| Protein Blotting Electrophoresis System | Bio-Rad | MiniPROTEANÒTetra Cell | |
| RAW264.7 cell | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | C7505 | |
| RAW264.7 cell-specific medium | Procell Life Science&Technology Co., Ltd | CM-0597 | |
| SDS-PAGE protein loading buffer | Boster Biological Technology Co., Ltd | AR1112-10 | |
| SDS-PAGE running buffer powder | Servicebio | G2018 | |
| Tris buffered saline powder | Servicebio | G0001 | |
| Tween 20 | BioFroxx | 1247ML100 | |
| Water bath | Memmert | WNE10 | |
| Water purifier | Millipore | Milli- IQ 7005 | |
| Xanthatin | ChemConst Biotechnology Co., Ltd | CONST210706 |
References
- Soleymani, F., Paquet, E., Viktor, H., Michalowski, W., Spinello, D. Protein-protein interaction prediction with deep learning: A comprehensive review. Computat Struct Biotechnol J. 20, 5316-5341 (2022).
- Du, X., et al. Insights into protein-ligand interactions: mechanisms, models, and methods. Int J Mol Sci. 17 (2), 144 (2016).
- Wu, Q., Peng, Z., Zhang, Y., Yang, J. COACH-D: improved protein-ligand binding sites prediction with refined ligand-binding poses through molecular docking. Nucleic Acids Res. 46, W438-W442 (2018).
- Zhang, F., et al. PROBselect: accurate prediction of protein-binding residues from proteins sequences via dynamic predictor selection. Bioinfo. 36, i735-i744 (2020).
- Kandel, J., Tayara, H., Chong, K. T. PUResNet: prediction of protein-ligand binding sites using deep residual neural network. J Cheminfo. 13 (1), 65 (2021).
- Dhakal, A., Mckay, C., Tanner, J. J., Cheng, J. Artificial intelligence in the prediction of protein-ligand interactions: recent advances and future directions. Brief Bioinform. 23 (1), 476 (2022).
- Hatty, C. R., Banati, R. B. Protein-ligand and membrane-ligand interactions in pharmacology: the case of the translocator protein (TSPO). Pharmacol Res. 100, 58-63 (2015).
- Chaires, J. B. Calorimetry and thermodynamics in drug design. Ann Rev Biophys. 37, 135-151 (2008).
- Huang, S. Y., Zou, X. Advances and challenges in protein-ligand docking. Int J Mo Sci. 11 (8), 3016-3034 (2010).
- Li, J., Fu, A., Zhang, L. An overview of scoring functions used for protein-ligand interactions in molecular docking. Interdiscip Sci. 11 (2), 320-328 (2019).
- Crampon, K., Giorkallos, A., Deldossi, M., Baud, S., Steffenel, L. A. Machine-learning methods for ligand-protein molecular docking. Drug Discov Today. 27 (1), 151-164 (2022).
- Pinzi, L., Rastelli, G. Molecular docking: Shifting paradigms in drug discovery. Int J Mol Sci. 20 (18), 4331 (2019).
- Abdolmaleki, A., Ghasemi, F., Ghasemi, J. B. Computer-aided drug design to explore cyclodextrin therapeutics and biomedical applications. Chem Biol Drug Des. 89 (2), 257-268 (2017).
- Chen, G., Seukep, A. J., Guo, M. Recent advances in molecular docking for the research and discovery of potential marine drugs. Mar Drugs. 18 (11), 545 (2020).
- Li, T., Guo, R., Zong, Q., Ling, G. Application of molecular docking in elaborating molecular mechanisms and interactions of supramolecular cyclodextrin. Carbohydr Polym. 276, 118644 (2022).
- Martinez Molina, D., et al. Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay. Science. 341 (6141), 84-87 (2013).
- Tu, Y., Tan, L., Tao, H., Li, Y., Liu, H. CETSA and thermal proteome profiling strategies for target identification and drug discovery of natural products. Phytomedicine. 116, 154862 (2023).
- Dai, L., et al. Horizontal cell biology: Monitoring global changes of protein interaction states with the proteome-wide cellular thermal shift assay (CETSA). Annu Rev Biochem. 88, 383-408 (2019).
- Lade, D. M., Nicoletti, R., Mersch, J., Agazie, Y. M. Design and synthesis of improved active-site SHP2 inhibitors with anti-breast cancer cell effects. Eur J Med Chem. 247, 115017 (2023).
- Jiang, X., et al. Novel chemical-structure TPOR agonist, TMEA, promotes megakaryocytes differentiation and thrombopoiesis via mTOR and ERK signalings. Phytomedicine. 110, 154637 (2023).
- Mateus, A., et al. Thermal proteome profiling for interrogating protein interactions. Mol Syst Biol. 16 (3), 9232 (2020).
- Sanchez, T. W., et al. Real-time cellular thermal shift assay to monitor target engagement. ACS Chem Biol. 17 (9), 2471-2482 (2022).
- Tolvanen, T. A. Current advances in CETSA. Front Mol Biosci. 9, 866764 (2022).
- Liu, M., et al. Xanthatin inhibits STAT3 and NF-κB signalling by covalently binding to JAK and IKK kinases. J Cell Mol Med. 23 (6), 4301-4312 (2019).
- Liu, Y., Chen, W., Zheng, F., Yu, H., Wei, K. Xanthatin alleviates LPS-Induced inflammatory response in RAW264.7 macrophages by Inhibiting NF-κB, MAPK and STATs activation. Molecules. 27 (14), 4603 (2022).
- Dinkova-Kostova, A. T., Kostov, R. V., Canning, P. Keap1, the cysteine-based mammalian intracellular sensor for electrophiles and oxidants. Arch Biochem Biophys. 617, 84-93 (2017).
- Tabana, Y., Babu, D., Fahlman, R., Siraki, A. G., Barakat, K. Target identification of small molecules: An overview of the current applications in drug discovery. BMC Biotechnol. 23 (1), 44 (2023).
- Schenone, M., Dančík, V., Wagner, B. K., Clemons, P. A. Target identification and mechanism of action in chemical biology and drug discovery. Nat Chem Biol. 9 (4), 232-240 (2013).
- Hughes, J. P., Rees, S., Kalindjian, S. B., Philpott, K. L. Principles of early drug discovery. Br J Pharmacol. 162 (6), 1239-1249 (2011).
- Chakraborty, C., et al. SARS-CoV-2 protein drug targets landscape: A potential pharmacological insight view for the new drug development. Expert Rev Clin Pharmacol. 14 (2), 225-238 (2021).
- Ziegler, S., Pries, V., Hedberg, C., Waldmann, H. Target identification for small bioactive molecules: Finding the needle in the haystack. Angew Chem Int Ed Engl. 52 (10), 2744-2792 (2013).
- Zhang, X., et al. Highly effective identification of drug targets at the proteome level by pH-dependent protein precipitation. Chem Sci. 13 (42), 12403-12418 (2022).
- Zhang, X., et al. A simplified thermal proteome profiling approach to screen protein targets of a ligand. Proteomics. 20, 1900372 (2020).
- Hou, Y., et al. Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway. Phytomedicine. 109, 154568 (2022).
- Wang, X., et al. Salidroside, a phenyl ethanol glycoside from Rhodiolacrenulata, orchestrates hypoxic mitochondrial dynamics homeostasis by stimulating Sirt1/p53/Drp1 signaling. J Ethnopharmacol. 293, 115278 (2022).
