Prédiction et validation de cibles protéiques de composés à petites molécules
Summary
L’expérience utilisée ici montre une méthode d’amarrage moléculaire combinée à un test de décalage thermique cellulaire pour prédire et valider l’interaction entre les petites molécules et les cibles protéiques.
Abstract
Les protéines sont fondamentales pour la physiologie humaine, leurs cibles étant cruciales dans la recherche et le développement de médicaments. L’identification et la validation de cibles protéiques cruciales font désormais partie intégrante du développement de médicaments. L’amarrage moléculaire est un outil informatique largement utilisé pour étudier la liaison protéine-ligand, en particulier dans le contexte des interactions médicamenteuses et protéiques cibles. Pour la vérification expérimentale de la liaison et pour accéder directement à la liaison du médicament et de sa cible, la méthode CETSA (Cellular Thermal Shift Astesty) est utilisée. Cette étude visait à intégrer l’amarrage moléculaire à CETSA pour prédire et valider les interactions entre les médicaments et les cibles protéiques vitales. Plus précisément, nous avons prédit l’interaction entre la xanthatine et la protéine Keap1 ainsi que son mode de liaison par analyse d’amarrage moléculaire, suivie d’une vérification de l’interaction à l’aide du test CETSA. Nos résultats ont démontré que la xanthatine pouvait établir des liaisons hydrogène avec des résidus d’acides aminés spécifiques de la protéine Keap1 et réduire la thermostabilité de la protéine Keap1, indiquant que la xanthatine pouvait interagir directement avec la protéine Keap1.
Introduction
Les protéines sont des macromolécules très importantes dans les organismes vivants et possèdent une gamme variée de fonctions uniques au sein des cellules, telles que la composition membranaire, la formation du cytosquelette, l’activité enzymatique, le transport, la signalisation cellulaire et l’implication dans les mécanismes intracellulaires et extracellulaires 1,2,3. Les protéines manifestent leurs fonctions biologiques principalement par des interactions spécifiques avec une variété de molécules, y compris d’autres protéines, des acides nucléiques, des ligands de petites molécules et des ions métalliques 1,4. Les ligands sont de petits composés moléculaires qui se lient spécifiquement aux protéines d’un organisme. L’interaction entre les protéines et les ligands se produit à des sites spécifiques de la protéine, appelés sites de liaison, également connus sous le nom de poches de liaison5. Dans la recherche en chimie médicinale, l’accent est mis sur l’identification de protéines clés qui sont clairement associées à des maladies, qui servent de cibles pour les médicaments6. Par conséquent, il est de la plus haute importance d’acquérir une compréhension approfondie des sites de liaison entre les protéines et les ligands pour promouvoir la découverte, la conception et la recherche de médicaments 7,8.
L’amarrage moléculaire est un outil de calcul largement utilisé pour étudier la liaison protéine-ligand, qui utilise les structures tridimensionnelles des protéines et des ligands pour explorer leurs modes de liaison primaires et leurs affinités lors de la formation de complexes stables 9,10,11. L’application de la technologie d’amarrage moléculaire a vu le jour dans les années 1970. Sur la base du principe de l’appariement serrure et clé et en utilisant les algorithmes des logiciels d’amarrage moléculaire, on peut déterminer l’interaction entre les composés et les cibles moléculaires en analysant les résultats d’amarrage. Cette approche permet de prédire les sites de liaison actifs à la fois pour le composé et la molécule cible. Par conséquent, il facilite l’identification d’une conformation de liaison optimale (appelée ici modèle de liaison) pour les interactions ligand-récepteur, ce qui est crucial pour comprendre la mécanique de ces engagements moléculaires 12,13,14,15. Bien que l’amarrage moléculaire fournisse de précieuses prédictions informatiques des interactions ligand-récepteur, il est important de noter qu’il s’agit de résultats préliminaires. Par conséquent, une vérification expérimentale supplémentaire est essentielle pour confirmer ces interactions.
Le test de décalage thermique cellulaire (CETSA), initialement proposé par l’équipe de recherche de Pär Nordlund en 2013, sert de méthode pour valider les interactions médicament-protéine cible. Cette technique teste spécifiquement la stabilité thermique des protéines cibles induite par la liaison aux médicaments, fournissant une approche pratique pour confirmer les interactions moléculaires 16,17,18. Cette approche est basée sur le principe fondamental selon lequel la liaison des ligands initie un changement thermique au sein des protéines cibles et s’applique à un large éventail d’échantillons biologiques, y compris les lysats cellulaires, les cellules vivantes intactes et les tissus19,20. CETSA soutient l’engagement direct de petites molécules cibles dans des cellules intactes en détectant la stabilisation thermodynamique des protéines due à la liaison des ligands et en liant la réponse phénotypique observée au composé cible21,22. Parmi les différentes méthodologies dérivées de CETSA, le Western Blot-CETSA (WB-CETSA) est considéré comme une approche classique. Après la préparation de l’échantillon à l’aide de la méthode CETSA, l’analyse par transfert Western est utilisée pour détecter les altérations de la stabilité thermique de la protéine cible. Cela permet de déterminer avec précision les interactions médicament-protéine au sein des systèmes cellulaires17,23.
La xanthatine est un composé bioactif isolé de la plante Xanthium L. avec des propriétés telles que l’anti-inflammatoire, qui a été utilisé dans la médecine traditionnelle chinoise pour traiter des maladies comme la sinusite nasale et l’arthrite24,25. La protéine 1 associée à l’ECH (Keap1) est un composant du complexe protéique multi-sous-unitaire ubiquitine ligase Cullin-RING E3 basé sur Cullin3 et un régulateur important de l’homéostasie redox intracellulaire, qui influence l’intensité et la durée de la réponse inflammatoire en modulant l’état redox intracellulaire26. Dans cette étude, nous avons d’abord utilisé l’amarrage moléculaire pour étudier l’interaction entre la xanthatine (petite molécule) et la protéine Keap1, dans le but de prédire leur mode de liaison. Par la suite, nous avons utilisé la méthode CETSA pour valider cette interaction en évaluant l’impact de la xanthatine sur la stabilité thermique de la protéine Keap1.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’identification de cibles pathologiques et la découverte et la mise au point de médicaments sont étroitement liées27. En ciblant précisément des cibles spécifiques, des candidats-médicaments peuvent être développés pour traiter plus efficacement des maladies particulières tout en minimisant les effets secondaires associés aux médicaments28,29. Les cibles les plus couramment utilisées sont les cibles protéiques<sup class=…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (82004031) et le Sichuan Science and Technology Program (2022NSFSC1303). Nous exprimons notre grande gratitude à Jiayi Sun de l’Institut innovant de médecine et de pharmacie chinoises de l’Université de médecine traditionnelle chinoise de Chengdu, pour son aide avec le western blot.
Materials
| 0.45 μm Polyvinylidene fluoride membrane | Millipore | PR05509 | |
| Anhydrous ethanol | Chron chemicals | 64-17-5 | |
| Bovine serum albumin | BioFroxx | 4240GR100 | |
| Broad-spectrum protease inhibitor mixtures | Boster Biological Technology Co., Ltd | AR1193 | |
| DMSO | Boster Biological Technology Co., Ltd | PYG0040 | |
| Enhanced chemiluminescence reagent | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | P0018S | |
| GAPDH antibody | ProteinTech Group Co., Ltd | 10494-1-AP | |
| Gel Imaging Instrument | E-BLOT | Touch Imager Pro | |
| Gradient PCR instrument | Biometra TADVANCED | Biometra Tadvanced 96SG | |
| High-speed freezing centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-30R | |
| Horseradish peroxidase-conjugated affiniPure goat antibody | ProteinTech Group Co., Ltd | SA00001-2 | |
| Isopropyl alcohol | Chron chemicals | 67-63-0 | |
| Keap1 antibody | Zen BioScience Co., Ltd | R26935 | |
| Metal bath | Analytik Jena | TSC | |
| Methanol | Chron chemicals | 67-56-1 | |
| Ncmblot rapid transfer buffer (20×) | NCM Biotech Co., Ltd | WB4600 | |
| Omni-Easy OneStep PAGE gel fast preparation kie | Epizyme Biotech Co., Ltd | PG212 | |
| Phosphate buffer saline | Boster Biological Technology Co., Ltd | PYG0021 | |
| Prestained Color Protein Marker | Biosharp | BL741A | |
| Protein Blotting Electrophoresis System | Bio-Rad | MiniPROTEANÒTetra Cell | |
| RAW264.7 cell | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | C7505 | |
| RAW264.7 cell-specific medium | Procell Life Science&Technology Co., Ltd | CM-0597 | |
| SDS-PAGE protein loading buffer | Boster Biological Technology Co., Ltd | AR1112-10 | |
| SDS-PAGE running buffer powder | Servicebio | G2018 | |
| Tris buffered saline powder | Servicebio | G0001 | |
| Tween 20 | BioFroxx | 1247ML100 | |
| Water bath | Memmert | WNE10 | |
| Water purifier | Millipore | Milli- IQ 7005 | |
| Xanthatin | ChemConst Biotechnology Co., Ltd | CONST210706 |
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