Vorhersage und Validierung von Proteinzielen für niedermolekulare Verbindungen
Summary
Das hier verwendete Experiment zeigt eine Methode des molekularen Andockens in Kombination mit einem zellulären thermischen Shift-Assay, um die Interaktion zwischen kleinen Molekülen und Proteinzielen vorherzusagen und zu validieren.
Abstract
Proteine sind für die menschliche Physiologie von grundlegender Bedeutung, wobei ihre Ziele für die Forschung und Arzneimittelentwicklung von entscheidender Bedeutung sind. Die Identifizierung und Validierung wichtiger Proteinziele ist zu einem integralen Bestandteil der Arzneimittelentwicklung geworden. Molekulares Docking ist ein computergestütztes Werkzeug, das häufig zur Untersuchung der Protein-Liganden-Bindung eingesetzt wird, insbesondere im Zusammenhang mit Wechselwirkungen zwischen Wirkstoffen und Proteinzielen. Für die experimentelle Verifizierung der Bindung und um direkt auf die Bindung des Wirkstoffs und seines Ziels zuzugreifen, wird die Methode des Cellular Thermal Shift Assay (CETSA) verwendet. Diese Studie zielte darauf ab, molekulares Docking mit CETSA zu integrieren, um Wechselwirkungen zwischen Medikamenten und lebenswichtigen Proteinzielen vorherzusagen und zu validieren. Konkret haben wir die Interaktion zwischen Xanthatin und dem Keap1-Protein sowie dessen Bindungsmodus durch molekulare Docking-Analyse vorhergesagt, gefolgt von der Verifizierung der Interaktion mit dem CETSA-Assay. Unsere Ergebnisse zeigten, dass Xanthatin Wasserstoffbrückenbindungen mit spezifischen Aminosäureresten des Keap1-Proteins aufbauen und die Thermostabilität des Keap1-Proteins verringern kann, was darauf hindeutet, dass Xanthatin direkt mit dem Keap1-Protein interagieren kann.
Introduction
Proteine sind äußerst wichtige Makromoleküle in lebenden Organismen und besitzen eine Vielzahl einzigartiger Funktionen innerhalb von Zellen, wie z. B. die Membranzusammensetzung, die Bildung des Zytoskeletts, die Enzymaktivität, den Transport, die Zellsignalisierung und die Beteiligung an intrazellulären und extrazellulären Mechanismen 1,2,3. Proteine manifestieren ihre biologischen Funktionen in erster Linie durch spezifische Wechselwirkungen mit einer Vielzahl von Molekülen, einschließlich anderer Proteine, Nukleinsäuren, niedermolekularer Liganden und Metallionen 1,4. Liganden sind kleine molekulare Verbindungen, die spezifisch an Proteine in einem Organismus binden. Die Wechselwirkung zwischen Proteinen und Liganden findet an bestimmten Stellen des Proteins statt, den sogenannten Bindungsstellen, die auch als Bindungstaschen bekannt sind5. In der medizinisch-chemischen Forschung liegt der Fokus auf der Identifizierung von Schlüsselproteinen, die eindeutig mit Krankheiten in Verbindung gebracht werden und als Angriffspunkte für Medikamente dienen6. Daher ist ein tiefes Verständnis der Bindungsstellen zwischen Proteinen und Liganden von größter Bedeutung, um die Entdeckung, das Design und die Forschung von Arzneimitteln zu fördern 7,8.
Molekulares Docking ist ein weit verbreitetes Computerwerkzeug zur Untersuchung der Protein-Liganden-Bindung, das die dreidimensionalen Strukturen von Proteinen und Liganden nutzt, um ihre primären Bindungsmodi und Affinitäten bei der Bildung stabiler Komplexe zu untersuchen 9,10,11. Die Anwendung der molekularen Docking-Technologie hat ihren Ursprung in den 1970er Jahren. Basierend auf dem Prinzip der Schloss-Schlüssel-Paarung und unter Verwendung der Algorithmen der molekularen Docking-Software kann die Wechselwirkung zwischen Verbindungen und molekularen Zielen durch die Analyse der Docking-Ergebnisse bestimmt werden. Dieser Ansatz ermöglicht die Vorhersage aktiver Bindungsstellen sowohl für die Verbindung als auch für das Zielmolekül. Folglich erleichtert es die Identifizierung einer optimalen Bindungskonformation (hier als Bindungsmodell bezeichnet) für Liganden-Rezeptor-Wechselwirkungen, was für das Verständnis der Mechanik dieser molekularen Bindungen entscheidend ist 12,13,14,15. Während das molekulare Docking wertvolle computergestützte Vorhersagen von Liganden-Rezeptor-Wechselwirkungen liefert, ist es wichtig zu beachten, dass es sich hierbei um vorläufige Ergebnisse handelt. Daher ist eine weitere experimentelle Überprüfung unerlässlich, um diese Wechselwirkungen zu bestätigen.
Der Cellular Thermal Shift Assay (CETSA), der ursprünglich 2013 vom Forschungsteam um Pär Nordlund vorgeschlagen wurde, dient als Methode zur Validierung von Wechselwirkungen zwischen Wirkstoffen und Zielproteinen. Diese Technik testet speziell die thermische Stabilität von Zielproteinen, die durch Wirkstoffbindung induziert werden, und bietet einen praktischen Ansatz zur Bestätigung molekularer Wechselwirkungen 16,17,18. Dieser Ansatz basiert auf dem Grundprinzip, dass die Ligandenbindung eine thermische Verschiebung innerhalb der Zielproteine auslöst, und ist auf ein breites Spektrum biologischer Proben anwendbar, einschließlich Zelllysaten, intakter lebender Zellen und Gewebe19,20. CETSA unterstützt die direkte Zielaktivierung kleiner Moleküle in intakten Zellen, indem es die thermodynamische Stabilisierung von Proteinen aufgrund der Ligandenbindung nachweist und die beobachtete phänotypische Reaktion mit der Zielsubstanz verknüpft21,22. Unter den verschiedenen Methoden, die sich aus CETSA ableiten, gilt Western Blot-CETSA (WB-CETSA) als klassischer Ansatz. Nach der Probenvorbereitung mit der CETSA-Methode wird die Western-Blot-Analyse eingesetzt, um Veränderungen in der thermischen Stabilität des Zielproteins nachzuweisen. Dies ermöglicht die präzise Bestimmung von Arzneimittel-Protein-Wechselwirkungen innerhalb zellulärer Systeme17,23.
Xanthatin ist eine bioaktive Verbindung, die aus der Pflanze Xanthium L. mit Eigenschaften wie entzündungshemmend isoliert wird und in der traditionellen chinesischen Medizin zur Behandlung von Krankheiten wie Nasennebenhöhlenentzündung und Arthritis eingesetzt wird24,25. Das Kelch-like ECH-assoziierte Protein 1 (Keap1) ist Bestandteil des Cullin3-basierten Cullin-RING E3-Ubiquitin-Ligase-Multi-Subunit-Proteinkomplexes und ein wichtiger Regulator der intrazellulären Redox-Homöostase, der die Intensität und Dauer der Entzündungsreaktion beeinflusst, indem er den intrazellulären Redoxzustandmoduliert 26. In dieser Studie haben wir zunächst molekulares Docking verwendet, um die Interaktion zwischen Xanthatin (kleines Molekül) und dem Keap1-Protein zu untersuchen, um ihren Bindungsmodus vorherzusagen. Anschließend verwendeten wir die CETSA-Methode, um diese Interaktion zu validieren, indem wir den Einfluss von Xanthatin auf die thermische Stabilität des Keap1-Proteins untersuchten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Identifizierung von Krankheitszielen sowie die Entdeckung und Entwicklung von Medikamenten sind eng miteinander verknüpft27. Durch die präzise Ausrichtung auf spezifische Ziele können Wirkstoffkandidaten entwickelt werden, um bestimmte Krankheiten effektiver zu behandeln und gleichzeitig die mit den Medikamenten verbundenen Nebenwirkungen zu minimieren 28,29. Die am häufigsten verwendeten Ziele sind Proteinziele30…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (82004031) und dem Sichuan Science and Technology Program (2022NSFSC1303) unterstützt. Wir danken Jiayi Sun vom Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy der Chengdu University of Traditional Chinese Medicine für die Unterstützung bei Western Blot.
Materials
| 0.45 μm Polyvinylidene fluoride membrane | Millipore | PR05509 | |
| Anhydrous ethanol | Chron chemicals | 64-17-5 | |
| Bovine serum albumin | BioFroxx | 4240GR100 | |
| Broad-spectrum protease inhibitor mixtures | Boster Biological Technology Co., Ltd | AR1193 | |
| DMSO | Boster Biological Technology Co., Ltd | PYG0040 | |
| Enhanced chemiluminescence reagent | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | P0018S | |
| GAPDH antibody | ProteinTech Group Co., Ltd | 10494-1-AP | |
| Gel Imaging Instrument | E-BLOT | Touch Imager Pro | |
| Gradient PCR instrument | Biometra TADVANCED | Biometra Tadvanced 96SG | |
| High-speed freezing centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-30R | |
| Horseradish peroxidase-conjugated affiniPure goat antibody | ProteinTech Group Co., Ltd | SA00001-2 | |
| Isopropyl alcohol | Chron chemicals | 67-63-0 | |
| Keap1 antibody | Zen BioScience Co., Ltd | R26935 | |
| Metal bath | Analytik Jena | TSC | |
| Methanol | Chron chemicals | 67-56-1 | |
| Ncmblot rapid transfer buffer (20×) | NCM Biotech Co., Ltd | WB4600 | |
| Omni-Easy OneStep PAGE gel fast preparation kie | Epizyme Biotech Co., Ltd | PG212 | |
| Phosphate buffer saline | Boster Biological Technology Co., Ltd | PYG0021 | |
| Prestained Color Protein Marker | Biosharp | BL741A | |
| Protein Blotting Electrophoresis System | Bio-Rad | MiniPROTEANÒTetra Cell | |
| RAW264.7 cell | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | C7505 | |
| RAW264.7 cell-specific medium | Procell Life Science&Technology Co., Ltd | CM-0597 | |
| SDS-PAGE protein loading buffer | Boster Biological Technology Co., Ltd | AR1112-10 | |
| SDS-PAGE running buffer powder | Servicebio | G2018 | |
| Tris buffered saline powder | Servicebio | G0001 | |
| Tween 20 | BioFroxx | 1247ML100 | |
| Water bath | Memmert | WNE10 | |
| Water purifier | Millipore | Milli- IQ 7005 | |
| Xanthatin | ChemConst Biotechnology Co., Ltd | CONST210706 |
References
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