Previsione e validazione del bersaglio proteico di un composto a piccola molecola
Summary
L’esperimento qui utilizzato mostra un metodo di docking molecolare combinato con il saggio di spostamento termico cellulare per prevedere e convalidare l’interazione tra piccole molecole e bersagli proteici.
Abstract
Le proteine sono fondamentali per la fisiologia umana, con i loro bersagli cruciali nella ricerca e nello sviluppo di farmaci. L’identificazione e la convalida di bersagli proteici cruciali sono diventate parte integrante dello sviluppo di farmaci. Il docking molecolare è uno strumento computazionale ampiamente utilizzato per studiare il legame proteina-ligando, specialmente nel contesto delle interazioni farmaco-bersaglio proteico. Per la verifica sperimentale del legame e per accedere direttamente al legame del farmaco e del suo bersaglio, viene utilizzato il metodo del saggio di spostamento termico cellulare (CETSA). Questo studio mirava a integrare il docking molecolare con CETSA per prevedere e convalidare le interazioni tra farmaci e bersagli proteici vitali. In particolare, abbiamo previsto l’interazione tra xantilina e proteina Keap1 e la sua modalità di legame attraverso l’analisi di docking molecolare, seguita dalla verifica dell’interazione utilizzando il saggio CETSA. I nostri risultati hanno dimostrato che la xantilina potrebbe stabilire legami idrogeno con specifici residui amminoacidici della proteina Keap1 e ridurre la termostabilità della proteina Keap1, indicando che la xantilina potrebbe interagire direttamente con la proteina Keap1.
Introduction
Le proteine sono macromolecole molto importanti negli organismi viventi e possiedono una vasta gamma di funzioni uniche all’interno delle cellule, come la composizione della membrana, la formazione del citoscheletro, l’attività enzimatica, il trasporto, la segnalazione cellulare e il coinvolgimento nei meccanismi intracellulari ed extracellulari 1,2,3. Le proteine manifestano le loro funzioni biologiche principalmente attraverso interazioni specifiche con una varietà di molecole, tra cui altre proteine, acidi nucleici, ligandi di piccole molecole e ioni metallici 1,4. I ligandi sono piccoli composti molecolari che si legano specificamente alle proteine di un organismo. L’interazione tra proteine e ligandi avviene in siti specifici sulla proteina, chiamati siti di legame, noti anche come tasche di legame5. Nella ricerca in chimica farmaceutica, l’attenzione si concentra sull’identificazione di proteine chiave che sono chiaramente associate a malattie, che fungono da bersagli per i farmaci6. Pertanto, acquisire una profonda comprensione dei siti di legame tra proteine e ligandi è della massima importanza per promuovere la scoperta, la progettazione e la ricerca di farmaci 7,8.
Il docking molecolare è uno strumento computazionale ampiamente utilizzato per lo studio del legame proteina-ligando, che impiega le strutture tridimensionali di proteine e ligandi per esplorare le loro modalità e affinità di legame primarie durante la formazione di complessi stabili 9,10,11. L’applicazione della tecnologia di docking molecolare è nata negli anni ‘1970. Sulla base del principio di accoppiamento di serratura e chiave e utilizzando gli algoritmi del software di docking molecolare, è possibile determinare l’interazione tra composti e bersagli molecolari analizzando i risultati dell’attracco. Questo approccio consente la previsione dei siti di legame attivi sia per il composto che per la molecola bersaglio. Di conseguenza, facilita l’identificazione di una conformazione di legame ottimale (qui chiamata modello di legame) per le interazioni ligando-recettore, che è cruciale per comprendere la meccanica di questi impegni molecolari 12,13,14,15. Mentre il docking molecolare fornisce preziose previsioni basate su computer delle interazioni ligando-recettore, è importante notare che si tratta di risultati preliminari. Di conseguenza, un’ulteriore verifica sperimentale è essenziale per confermare queste interazioni.
Il saggio di spostamento termico cellulare (CETSA), inizialmente proposto dal team di ricerca di Pär Nordlund nel 2013, funge da metodo per convalidare le interazioni farmaco-proteina bersaglio. Questa tecnica testa specificamente la stabilità termica delle proteine bersaglio indotta dal legame farmacologico, fornendo un approccio pratico per confermare le interazioni molecolari 16,17,18. Questo approccio si basa sul principio fondamentale che il legame del ligando avvia uno spostamento termico all’interno delle proteine bersaglio ed è applicabile a un’ampia gamma di campioni biologici, inclusi lisati cellulari, cellule viventi intatte e tessuti 19,20. CETSA supporta l’impegno diretto del bersaglio di piccole molecole in cellule intatte rilevando la stabilizzazione termodinamica delle proteine dovuta al legame del ligando e collegando la risposta fenotipica osservata al composto bersaglio21,22. Tra le varie metodologie derivate dal CETSA, il Western Blot-CETSA (WB-CETSA) è considerato un approccio classico. Dopo la preparazione del campione con il metodo CETSA, viene utilizzata l’analisi western blot per rilevare alterazioni nella stabilità termica della proteina bersaglio. Ciò consente la determinazione precisa delle interazioni farmaco-proteina all’interno dei sistemi cellulari17,23.
La xantitina è un composto bioattivo isolato dalla pianta Xanthium L. con proprietà antinfiammatorie, che è stato utilizzato nella medicina tradizionale cinese per trattare malattie come la sinusite nasale e l’artrite24,25. La proteina 1 associata a ECH (Keap1) è un componente del complesso proteico multi-subunità ubiquitina ligasi Cullin-RING E3 basato su Cullin3 e un importante regolatore dell’omeostasi redox intracellulare, che influenza l’intensità e la durata della risposta infiammatoria modulando lo stato redox intracellulare26. In questo studio, abbiamo prima utilizzato il docking molecolare per studiare l’interazione tra xantilina (piccola molecola) e proteina Keap1, con l’obiettivo di prevedere la loro modalità di legame. Successivamente, abbiamo utilizzato il metodo CETSA per convalidare questa interazione valutando l’impatto della xantilina sulla stabilità termica della proteina Keap1.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’identificazione dei bersagli della malattia e la scoperta e lo sviluppo di farmaci sono strettamente interconnessi27. Mirando con precisione a bersagli specifici, è possibile sviluppare farmaci candidati per trattare particolari malattie in modo più efficace, riducendo al minimo gli effetti collaterali associati ai farmaci28,29. I bersagli più comunemente usati sono i bersagli proteici30. Tuttavia, l’identifica…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dalla National Natural Science Foundation of China (82004031) e dal Sichuan Science and Technology Program (2022NSFSC1303). Esprimiamo il nostro grande apprezzamento a Jiayi Sun dell’Istituto Innovativo di Medicina e Farmacia Cinese, Università di Medicina Tradizionale Cinese di Chengdu, per l’assistenza con il western blot.
Materials
| 0.45 μm Polyvinylidene fluoride membrane | Millipore | PR05509 | |
| Anhydrous ethanol | Chron chemicals | 64-17-5 | |
| Bovine serum albumin | BioFroxx | 4240GR100 | |
| Broad-spectrum protease inhibitor mixtures | Boster Biological Technology Co., Ltd | AR1193 | |
| DMSO | Boster Biological Technology Co., Ltd | PYG0040 | |
| Enhanced chemiluminescence reagent | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | P0018S | |
| GAPDH antibody | ProteinTech Group Co., Ltd | 10494-1-AP | |
| Gel Imaging Instrument | E-BLOT | Touch Imager Pro | |
| Gradient PCR instrument | Biometra TADVANCED | Biometra Tadvanced 96SG | |
| High-speed freezing centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-30R | |
| Horseradish peroxidase-conjugated affiniPure goat antibody | ProteinTech Group Co., Ltd | SA00001-2 | |
| Isopropyl alcohol | Chron chemicals | 67-63-0 | |
| Keap1 antibody | Zen BioScience Co., Ltd | R26935 | |
| Metal bath | Analytik Jena | TSC | |
| Methanol | Chron chemicals | 67-56-1 | |
| Ncmblot rapid transfer buffer (20×) | NCM Biotech Co., Ltd | WB4600 | |
| Omni-Easy OneStep PAGE gel fast preparation kie | Epizyme Biotech Co., Ltd | PG212 | |
| Phosphate buffer saline | Boster Biological Technology Co., Ltd | PYG0021 | |
| Prestained Color Protein Marker | Biosharp | BL741A | |
| Protein Blotting Electrophoresis System | Bio-Rad | MiniPROTEANÒTetra Cell | |
| RAW264.7 cell | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | C7505 | |
| RAW264.7 cell-specific medium | Procell Life Science&Technology Co., Ltd | CM-0597 | |
| SDS-PAGE protein loading buffer | Boster Biological Technology Co., Ltd | AR1112-10 | |
| SDS-PAGE running buffer powder | Servicebio | G2018 | |
| Tris buffered saline powder | Servicebio | G0001 | |
| Tween 20 | BioFroxx | 1247ML100 | |
| Water bath | Memmert | WNE10 | |
| Water purifier | Millipore | Milli- IQ 7005 | |
| Xanthatin | ChemConst Biotechnology Co., Ltd | CONST210706 |
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