低分子化合物のタンパク質標的予測と検証
Summary
ここで使用した実験は、低分子とタンパク質標的の間の相互作用を予測および検証するために、細胞の熱シフトアッセイと組み合わせた分子ドッキングの方法を示しています。
Abstract
タンパク質は人間の生理学の基礎であり、その標的は研究や医薬品開発において非常に重要です。重要なタンパク質標的の同定と検証は、医薬品開発に不可欠なものとなっています。分子ドッキングは、特に薬物とタンパク質の標的相互作用の文脈で、タンパク質-リガンド結合を研究するために広く利用されている計算ツールです。結合の実験的検証、および薬物とその標的の結合に直接アクセスするために、細胞熱シフトアッセイ(CETSA)法が使用されます。この研究は、分子ドッキングをCETSAと統合して、薬物と重要なタンパク質標的との間の相互作用を予測および検証することを目的としていました。具体的には、分子ドッキング解析により、キサンタチンとKeap1タンパク質の相互作用とその結合様式を予測し、CETSAアッセイを用いて相互作用を検証しました。その結果、キサンタチンがKeap1タンパク質の特定のアミノ酸残基と水素結合を確立でき、Keap1タンパク質の熱安定性を低下させることが示され、キサンタチンがKeap1タンパク質と直接相互作用できることが示されました。
Introduction
タンパク質は生体において非常に重要な高分子であり、膜組成、細胞骨格形成、酵素活性、輸送、細胞シグナル伝達、細胞内および細胞外メカニズムへの関与など、細胞内で多様な固有の機能を持っています1,2,3。タンパク質は、主に他のタンパク質、核酸、低分子配位子、金属イオンなど、さまざまな分子との特異的な相互作用を通じて生物学的機能を示します1,4。リガンドは、生物のタンパク質に特異的に結合する低分子化合物です。タンパク質とリガンドの間の相互作用は、結合部位と呼ばれるタンパク質の特定の部位で発生し、結合ポケット5としても知られています。医薬品化学の研究では、医薬品の標的となる疾患と明らかに関連している重要なタンパク質を特定することに焦点が当てられています6。したがって、タンパク質とリガンドの間の結合部位を深く理解することは、創薬、設計、および研究を促進する上で最も重要である7,8。
分子ドッキングは、タンパク質-リガンド結合を研究するために広く使用されている計算ツールであり、タンパク質とリガンドの三次元構造を使用して、安定した複合体を形成する際の主要な結合モードと親和性を調べます9,10,11。分子ドッキング技術の応用は1970年代に始まりました。ロックとキーのペアリング原理に基づき、分子ドッキングソフトウェアのアルゴリズムを利用して、ドッキング結果を解析することで、化合物と分子標的との相互作用を判定することができます。このアプローチにより、化合物と標的分子の両方の活性結合部位を予測できます。その結果、リガンド-受容体相互作用の最適な結合構造(ここでは結合モデルと呼ばれる)の同定が容易になり、これはこれらの分子結合のメカニズムを理解するために重要である12,13,14,15。分子ドッキングは、リガンドと受容体の相互作用の貴重なコンピューターベースの予測を提供しますが、これらは予備的な発見であることに注意することが重要です。したがって、これらの相互作用を確認するためには、さらなる実験的検証が不可欠です。
細胞熱シフトアッセイ(CETSA)は、2013年にPär Nordlundの研究チームによって最初に提案され、薬物と標的タンパク質の相互作用を検証するための方法として機能します。この技術は、薬物結合によって誘導される標的タンパク質の熱安定性を特異的に試験し、分子相互作用を確認するための実用的なアプローチを提供する16,17,18。このアプローチは、リガンド結合が標的タンパク質内の熱シフトを開始するという基本原理に基づいており、細胞溶解物、無傷の生細胞、および組織19,20を含む幅広い生物学的サンプルに適用できます。CETSAは、リガンド結合によるタンパク質の熱力学的安定化を検出し、観察された表現型応答を標的化合物に結び付けることにより、無傷の細胞における低分子の直接的な標的関与をサポートします21,22。CETSAから派生したさまざまな方法論の中で、ウェスタンブロット-CESA(WB-CETSA)は古典的なアプローチと見なされています。CETSA法を用いたサンプル前処理に続いて、ウェスタンブロット分析を利用して、標的タンパク質の熱安定性の変化を検出します。これにより、細胞系内の薬物-タンパク質相互作用の正確な決定が可能になります17,23。
キサンタチンは、植物から単離された生理活性化合物です キサンチウムL.は、鼻副鼻腔炎や関節炎などの病気を治療するために伝統的な漢方薬で使用されてきた抗炎症などの特性を持っています24,25。ケルチ様ECH関連タンパク質1(Keap1)は、Cullin3ベースのCullin-RING E3ユビキチンリガーゼマルチサブユニットタンパク質複合体の構成要素であり、細胞内酸化還元状態を調節することによって炎症反応の強度と持続時間に影響を与える細胞内酸化還元恒常性の重要な調節因子である26。本研究では、まず分子ドッキングを利用してキサンタチン(低分子)とKeap1タンパク質の相互作用を調べ、それらの結合様式を予測することを目指しました。その後、CETSA法を採用して、キサンタチンがKeap1タンパク質の熱安定性に与える影響を評価することにより、この相互作用を検証しました。
Protocol
Representative Results
Discussion
疾患標的の同定と医薬品の発見および開発は密接に関連しています27。特定の標的を正確に標的とすることにより、特定の疾患をより効果的に治療すると同時に、薬物に関連する副作用を最小限に抑えるための薬剤候補を開発することができます28,29。最も一般的に使用される標的はタンパク質標的である30。し?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、中国国家自然科学基金会(82004031)と四川省科学技術プログラム(2022NSFSC1303)の支援を受けました。成都中医薬大学漢方薬学革新研究所のJiayi Sun氏には、ウェスタンブロットの支援に心から感謝いたします。
Materials
| 0.45 μm Polyvinylidene fluoride membrane | Millipore | PR05509 | |
| Anhydrous ethanol | Chron chemicals | 64-17-5 | |
| Bovine serum albumin | BioFroxx | 4240GR100 | |
| Broad-spectrum protease inhibitor mixtures | Boster Biological Technology Co., Ltd | AR1193 | |
| DMSO | Boster Biological Technology Co., Ltd | PYG0040 | |
| Enhanced chemiluminescence reagent | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | P0018S | |
| GAPDH antibody | ProteinTech Group Co., Ltd | 10494-1-AP | |
| Gel Imaging Instrument | E-BLOT | Touch Imager Pro | |
| Gradient PCR instrument | Biometra TADVANCED | Biometra Tadvanced 96SG | |
| High-speed freezing centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-30R | |
| Horseradish peroxidase-conjugated affiniPure goat antibody | ProteinTech Group Co., Ltd | SA00001-2 | |
| Isopropyl alcohol | Chron chemicals | 67-63-0 | |
| Keap1 antibody | Zen BioScience Co., Ltd | R26935 | |
| Metal bath | Analytik Jena | TSC | |
| Methanol | Chron chemicals | 67-56-1 | |
| Ncmblot rapid transfer buffer (20×) | NCM Biotech Co., Ltd | WB4600 | |
| Omni-Easy OneStep PAGE gel fast preparation kie | Epizyme Biotech Co., Ltd | PG212 | |
| Phosphate buffer saline | Boster Biological Technology Co., Ltd | PYG0021 | |
| Prestained Color Protein Marker | Biosharp | BL741A | |
| Protein Blotting Electrophoresis System | Bio-Rad | MiniPROTEANÒTetra Cell | |
| RAW264.7 cell | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | C7505 | |
| RAW264.7 cell-specific medium | Procell Life Science&Technology Co., Ltd | CM-0597 | |
| SDS-PAGE protein loading buffer | Boster Biological Technology Co., Ltd | AR1112-10 | |
| SDS-PAGE running buffer powder | Servicebio | G2018 | |
| Tris buffered saline powder | Servicebio | G0001 | |
| Tween 20 | BioFroxx | 1247ML100 | |
| Water bath | Memmert | WNE10 | |
| Water purifier | Millipore | Milli- IQ 7005 | |
| Xanthatin | ChemConst Biotechnology Co., Ltd | CONST210706 |
References
- Soleymani, F., Paquet, E., Viktor, H., Michalowski, W., Spinello, D. Protein-protein interaction prediction with deep learning: A comprehensive review. Computat Struct Biotechnol J. 20, 5316-5341 (2022).
- Du, X., et al. Insights into protein-ligand interactions: mechanisms, models, and methods. Int J Mol Sci. 17 (2), 144 (2016).
- Wu, Q., Peng, Z., Zhang, Y., Yang, J. COACH-D: improved protein-ligand binding sites prediction with refined ligand-binding poses through molecular docking. Nucleic Acids Res. 46, W438-W442 (2018).
- Zhang, F., et al. PROBselect: accurate prediction of protein-binding residues from proteins sequences via dynamic predictor selection. Bioinfo. 36, i735-i744 (2020).
- Kandel, J., Tayara, H., Chong, K. T. PUResNet: prediction of protein-ligand binding sites using deep residual neural network. J Cheminfo. 13 (1), 65 (2021).
- Dhakal, A., Mckay, C., Tanner, J. J., Cheng, J. Artificial intelligence in the prediction of protein-ligand interactions: recent advances and future directions. Brief Bioinform. 23 (1), 476 (2022).
- Hatty, C. R., Banati, R. B. Protein-ligand and membrane-ligand interactions in pharmacology: the case of the translocator protein (TSPO). Pharmacol Res. 100, 58-63 (2015).
- Chaires, J. B. Calorimetry and thermodynamics in drug design. Ann Rev Biophys. 37, 135-151 (2008).
- Huang, S. Y., Zou, X. Advances and challenges in protein-ligand docking. Int J Mo Sci. 11 (8), 3016-3034 (2010).
- Li, J., Fu, A., Zhang, L. An overview of scoring functions used for protein-ligand interactions in molecular docking. Interdiscip Sci. 11 (2), 320-328 (2019).
- Crampon, K., Giorkallos, A., Deldossi, M., Baud, S., Steffenel, L. A. Machine-learning methods for ligand-protein molecular docking. Drug Discov Today. 27 (1), 151-164 (2022).
- Pinzi, L., Rastelli, G. Molecular docking: Shifting paradigms in drug discovery. Int J Mol Sci. 20 (18), 4331 (2019).
- Abdolmaleki, A., Ghasemi, F., Ghasemi, J. B. Computer-aided drug design to explore cyclodextrin therapeutics and biomedical applications. Chem Biol Drug Des. 89 (2), 257-268 (2017).
- Chen, G., Seukep, A. J., Guo, M. Recent advances in molecular docking for the research and discovery of potential marine drugs. Mar Drugs. 18 (11), 545 (2020).
- Li, T., Guo, R., Zong, Q., Ling, G. Application of molecular docking in elaborating molecular mechanisms and interactions of supramolecular cyclodextrin. Carbohydr Polym. 276, 118644 (2022).
- Martinez Molina, D., et al. Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay. Science. 341 (6141), 84-87 (2013).
- Tu, Y., Tan, L., Tao, H., Li, Y., Liu, H. CETSA and thermal proteome profiling strategies for target identification and drug discovery of natural products. Phytomedicine. 116, 154862 (2023).
- Dai, L., et al. Horizontal cell biology: Monitoring global changes of protein interaction states with the proteome-wide cellular thermal shift assay (CETSA). Annu Rev Biochem. 88, 383-408 (2019).
- Lade, D. M., Nicoletti, R., Mersch, J., Agazie, Y. M. Design and synthesis of improved active-site SHP2 inhibitors with anti-breast cancer cell effects. Eur J Med Chem. 247, 115017 (2023).
- Jiang, X., et al. Novel chemical-structure TPOR agonist, TMEA, promotes megakaryocytes differentiation and thrombopoiesis via mTOR and ERK signalings. Phytomedicine. 110, 154637 (2023).
- Mateus, A., et al. Thermal proteome profiling for interrogating protein interactions. Mol Syst Biol. 16 (3), 9232 (2020).
- Sanchez, T. W., et al. Real-time cellular thermal shift assay to monitor target engagement. ACS Chem Biol. 17 (9), 2471-2482 (2022).
- Tolvanen, T. A. Current advances in CETSA. Front Mol Biosci. 9, 866764 (2022).
- Liu, M., et al. Xanthatin inhibits STAT3 and NF-κB signalling by covalently binding to JAK and IKK kinases. J Cell Mol Med. 23 (6), 4301-4312 (2019).
- Liu, Y., Chen, W., Zheng, F., Yu, H., Wei, K. Xanthatin alleviates LPS-Induced inflammatory response in RAW264.7 macrophages by Inhibiting NF-κB, MAPK and STATs activation. Molecules. 27 (14), 4603 (2022).
- Dinkova-Kostova, A. T., Kostov, R. V., Canning, P. Keap1, the cysteine-based mammalian intracellular sensor for electrophiles and oxidants. Arch Biochem Biophys. 617, 84-93 (2017).
- Tabana, Y., Babu, D., Fahlman, R., Siraki, A. G., Barakat, K. Target identification of small molecules: An overview of the current applications in drug discovery. BMC Biotechnol. 23 (1), 44 (2023).
- Schenone, M., Dančík, V., Wagner, B. K., Clemons, P. A. Target identification and mechanism of action in chemical biology and drug discovery. Nat Chem Biol. 9 (4), 232-240 (2013).
- Hughes, J. P., Rees, S., Kalindjian, S. B., Philpott, K. L. Principles of early drug discovery. Br J Pharmacol. 162 (6), 1239-1249 (2011).
- Chakraborty, C., et al. SARS-CoV-2 protein drug targets landscape: A potential pharmacological insight view for the new drug development. Expert Rev Clin Pharmacol. 14 (2), 225-238 (2021).
- Ziegler, S., Pries, V., Hedberg, C., Waldmann, H. Target identification for small bioactive molecules: Finding the needle in the haystack. Angew Chem Int Ed Engl. 52 (10), 2744-2792 (2013).
- Zhang, X., et al. Highly effective identification of drug targets at the proteome level by pH-dependent protein precipitation. Chem Sci. 13 (42), 12403-12418 (2022).
- Zhang, X., et al. A simplified thermal proteome profiling approach to screen protein targets of a ligand. Proteomics. 20, 1900372 (2020).
- Hou, Y., et al. Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway. Phytomedicine. 109, 154568 (2022).
- Wang, X., et al. Salidroside, a phenyl ethanol glycoside from Rhodiolacrenulata, orchestrates hypoxic mitochondrial dynamics homeostasis by stimulating Sirt1/p53/Drp1 signaling. J Ethnopharmacol. 293, 115278 (2022).
