Summary

Predição de Alvos de Proteínas e Validação de Compostos de Moléculas Pequenas

Published: February 23, 2024
doi:

Summary

O experimento usado aqui mostra um método de docking molecular combinado com ensaio de deslocamento térmico celular para prever e validar a interação entre pequenas moléculas e alvos proteicos.

Abstract

As proteínas são fundamentais para a fisiologia humana, sendo seus alvos cruciais na pesquisa e no desenvolvimento de medicamentos. A identificação e validação de alvos proteicos cruciais tornaram-se parte integrante do desenvolvimento de medicamentos. O docking molecular é uma ferramenta computacional amplamente utilizada para investigar a ligação proteína-ligante, especialmente no contexto de interações entre drogas e proteínas-alvo. Para a verificação experimental da ligação e para acessar a ligação do medicamento e seu alvo diretamente, é utilizado o método de ensaio de deslocamento térmico celular (CETSA). Este estudo teve como objetivo integrar o docking molecular com o CETSA para prever e validar interações entre drogas e alvos de proteínas vitais. Especificamente, previmos a interação entre xanthatina e a proteína Keap1, bem como seu modo de ligação por meio de análise de docking molecular, seguida de verificação da interação usando o ensaio CETSA. Nossos resultados demonstraram que a xanthatina pode estabelecer ligações de hidrogênio com resíduos de aminoácidos específicos da proteína Keap1 e reduzir a termoestabilidade da proteína Keap1, indicando que a xanthatina pode interagir diretamente com a proteína Keap1.

Introduction

As proteínas são macromoléculas altamente importantes nos organismos vivos e possuem uma gama diversificada de funções únicas dentro das células, como composição da membrana, formação do citoesqueleto, atividade enzimática, transporte, sinalização celular e envolvimento em mecanismos intracelulares e extracelulares 1,2,3. As proteínas manifestam suas funções biológicas principalmente por meio de interações específicas com uma variedade de moléculas, incluindo outras proteínas, ácidos nucléicos, ligantes de moléculas pequenas e íons metálicos 1,4. Os ligantes são pequenos compostos moleculares que se ligam especificamente às proteínas de um organismo. A interação entre proteínas e ligantes ocorre em locais específicos da proteína, chamados de locais de ligação, também conhecidos como bolsas de ligação5. Na pesquisa em química medicinal, o foco está na identificação de proteínas-chave que estão claramente associadas a doenças, que servem como alvos para drogas6. Portanto, obter uma compreensão profunda dos locais de ligação entre proteínas e ligantes é de extrema importância na promoção da descoberta, design e pesquisa de medicamentos 7,8.

O docking molecular é uma ferramenta computacional amplamente utilizada para estudar a ligação proteína-ligante, que emprega as estruturas tridimensionais de proteínas e ligantes para explorar seus modos de ligação primários e afinidades ao formar complexos estáveis 9,10,11. A aplicação da tecnologia de docking molecular originou-se na década de 1970. Com base no princípio de emparelhamento de fechadura e chave e utilizando os algoritmos do software de acoplamento molecular, pode-se determinar a interação entre compostos e alvos moleculares analisando os resultados do encaixe. Essa abordagem permite a previsão de locais de ligação ativos para o composto e a molécula alvo. Consequentemente, facilita a identificação de uma conformação de ligação ideal (aqui chamada de modelo de ligação) para interações ligante-receptor, o que é crucial para a compreensão da mecânica desses engajamentos moleculares 12,13,14,15. Embora o docking molecular forneça previsões valiosas baseadas em computador das interações ligante-receptor, é importante observar que essas são descobertas preliminares. Consequentemente, uma verificação experimental adicional é essencial para confirmar essas interações.

O ensaio de deslocamento térmico celular (CETSA), inicialmente proposto pela equipe de pesquisa de Pär Nordlund em 2013, serve como um método para validar as interações entre drogas e proteínas-alvo. Esta técnica testa especificamente a estabilidade térmica das proteínas-alvo induzidas pela ligação de drogas, fornecendo uma abordagem prática para confirmar interações moleculares 16,17,18. Essa abordagem é baseada no princípio fundamental de que a ligação ao ligante inicia uma mudança térmica dentro das proteínas-alvo e é aplicável a uma ampla gama de amostras biológicas, incluindo lisados celulares, células vivas intactas e tecidos19,20. O CETSA apóia o envolvimento direto do alvo de pequenas moléculas em células intactas, detectando a estabilização termodinâmica de proteínas devido à ligação do ligante e ligando a resposta fenotípica observada ao composto alvo21,22. Dentre as várias metodologias derivadas do CETSA, o Western Blot-CETSA (WB-CETSA) é considerado uma abordagem clássica. Após a preparação da amostra usando o método CETSA, a análise de western blot é utilizada para detectar alterações na estabilidade térmica da proteína alvo. Isso permite a determinação precisa das interações fármaco-proteína dentro dos sistemas celulares17,23.

A xanthatina é um composto bioativo isolado da planta Xanthium L. com propriedades como anti-inflamatória, que tem sido utilizada na medicina tradicional chinesa para tratar doenças como sinusite nasal e artrite24,25. A proteína 1 associada a ECH semelhante a kelch (Keap1) é um componente do complexo proteico de múltiplas subunidades Cullin-RING E3 ubiquitina ligase baseado em Cullin3 e um importante regulador da homeostase redox intracelular, que influencia a intensidade e a duração da resposta inflamatória modulando o estado redox intracelular26. Neste estudo, primeiro utilizamos o docking molecular para investigar a interação entre xanthatin (pequena molécula) e proteína Keap1, com o objetivo de prever seu modo de ligação. Posteriormente, empregamos o método CETSA para validar essa interação, avaliando o impacto da xanthatina na estabilidade térmica da proteína Keap1.

Protocol

1. Baixando as estruturas de xanthatin e Keap1 Abra o banco de dados PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/), insira xanthatin (molécula pequena), pressione Pesquisar e clique em O primeiro resultado. Clique em Download e clique em Salvar em Estrutura 2D para salvar o composto no formato .sdf. Baixe a estrutura cristalina da proteína.Abra o banco de dados UniProt (https://www.uniprot.org/), insira Keap1 …

Representative Results

A análise de docking molecular previu a interação entre xanthatin e proteína Keap1. A Figura 2 demonstra a formação de ligações de hidrogênio entre a xanateína e os resíduos de aminoácidos Gly-367 e Val-606 da proteína Keap1, com um comprimento de ligação de hidrogênio de 2,17 Å para Gly-367 e 2,13 Å para Val-606. Além disso, a pontuação de encaixe calculada de -5,69 kcal / mol significa uma boa afinidade de ligação entre a xanthatina e a proteína Keap1. <p class=…

Discussion

A identificação de alvos de doenças e a descoberta e desenvolvimento de medicamentos estão intimamente interligadas27. Ao visar precisamente alvos específicos, os candidatos a medicamentos podem ser desenvolvidos para tratar doenças específicas de forma mais eficaz, minimizando simultaneamente os efeitos colaterais associados aos medicamentos28,29. Os alvos mais comumente usados são alvos de proteínas30. No…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82004031) e pelo Programa de Ciência e Tecnologia de Sichuan (2022NSFSC1303). Expressamos nossa grande gratidão a Jiayi Sun no Instituto Inovador de Medicina Chinesa e Farmácia, Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Chengdu, pela assistência com western blot.

Materials

0.45 μm Polyvinylidene fluoride membrane Millipore PR05509
Anhydrous ethanol Chron chemicals 64-17-5
Bovine serum albumin BioFroxx 4240GR100
Broad-spectrum protease inhibitor mixtures Boster Biological Technology Co., Ltd AR1193
DMSO Boster Biological Technology Co., Ltd PYG0040
Enhanced chemiluminescence reagent Beyotime Biotechnology Co., Ltd P0018S
GAPDH antibody ProteinTech Group Co., Ltd 10494-1-AP
Gel Imaging Instrument E-BLOT Touch Imager Pro
Gradient PCR instrument Biometra TADVANCED Biometra Tadvanced 96SG
High-speed freezing centrifuge Beckman Coulter Allegra X-30R
Horseradish peroxidase-conjugated affiniPure goat antibody ProteinTech Group Co., Ltd SA00001-2
Isopropyl alcohol  Chron chemicals 67-63-0
Keap1 antibody Zen BioScience Co., Ltd R26935
Metal bath Analytik Jena TSC
Methanol Chron chemicals 67-56-1
Ncmblot rapid transfer buffer (20×) NCM Biotech Co., Ltd WB4600
Omni-Easy OneStep PAGE gel fast preparation kie Epizyme Biotech Co., Ltd PG212
Phosphate buffer saline Boster Biological Technology Co., Ltd PYG0021
Prestained Color Protein Marker Biosharp  BL741A
Protein Blotting Electrophoresis System Bio-Rad MiniPROTEANÒTetra Cell
RAW264.7 cell Beyotime Biotechnology Co., Ltd C7505
RAW264.7 cell-specific medium Procell Life Science&Technology Co., Ltd CM-0597
SDS-PAGE protein loading buffer Boster Biological Technology Co., Ltd AR1112-10
SDS-PAGE running buffer powder Servicebio G2018
Tris buffered saline powder Servicebio G0001
Tween 20 BioFroxx 1247ML100
Water bath Memmert WNE10
Water purifier Millipore Milli- IQ 7005
Xanthatin ChemConst Biotechnology Co., Ltd CONST210706

References

  1. Soleymani, F., Paquet, E., Viktor, H., Michalowski, W., Spinello, D. Protein-protein interaction prediction with deep learning: A comprehensive review. Computat Struct Biotechnol J. 20, 5316-5341 (2022).
  2. Du, X., et al. Insights into protein-ligand interactions: mechanisms, models, and methods. Int J Mol Sci. 17 (2), 144 (2016).
  3. Wu, Q., Peng, Z., Zhang, Y., Yang, J. COACH-D: improved protein-ligand binding sites prediction with refined ligand-binding poses through molecular docking. Nucleic Acids Res. 46, W438-W442 (2018).
  4. Zhang, F., et al. PROBselect: accurate prediction of protein-binding residues from proteins sequences via dynamic predictor selection. Bioinfo. 36, i735-i744 (2020).
  5. Kandel, J., Tayara, H., Chong, K. T. PUResNet: prediction of protein-ligand binding sites using deep residual neural network. J Cheminfo. 13 (1), 65 (2021).
  6. Dhakal, A., Mckay, C., Tanner, J. J., Cheng, J. Artificial intelligence in the prediction of protein-ligand interactions: recent advances and future directions. Brief Bioinform. 23 (1), 476 (2022).
  7. Hatty, C. R., Banati, R. B. Protein-ligand and membrane-ligand interactions in pharmacology: the case of the translocator protein (TSPO). Pharmacol Res. 100, 58-63 (2015).
  8. Chaires, J. B. Calorimetry and thermodynamics in drug design. Ann Rev Biophys. 37, 135-151 (2008).
  9. Huang, S. Y., Zou, X. Advances and challenges in protein-ligand docking. Int J Mo Sci. 11 (8), 3016-3034 (2010).
  10. Li, J., Fu, A., Zhang, L. An overview of scoring functions used for protein-ligand interactions in molecular docking. Interdiscip Sci. 11 (2), 320-328 (2019).
  11. Crampon, K., Giorkallos, A., Deldossi, M., Baud, S., Steffenel, L. A. Machine-learning methods for ligand-protein molecular docking. Drug Discov Today. 27 (1), 151-164 (2022).
  12. Pinzi, L., Rastelli, G. Molecular docking: Shifting paradigms in drug discovery. Int J Mol Sci. 20 (18), 4331 (2019).
  13. Abdolmaleki, A., Ghasemi, F., Ghasemi, J. B. Computer-aided drug design to explore cyclodextrin therapeutics and biomedical applications. Chem Biol Drug Des. 89 (2), 257-268 (2017).
  14. Chen, G., Seukep, A. J., Guo, M. Recent advances in molecular docking for the research and discovery of potential marine drugs. Mar Drugs. 18 (11), 545 (2020).
  15. Li, T., Guo, R., Zong, Q., Ling, G. Application of molecular docking in elaborating molecular mechanisms and interactions of supramolecular cyclodextrin. Carbohydr Polym. 276, 118644 (2022).
  16. Martinez Molina, D., et al. Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay. Science. 341 (6141), 84-87 (2013).
  17. Tu, Y., Tan, L., Tao, H., Li, Y., Liu, H. CETSA and thermal proteome profiling strategies for target identification and drug discovery of natural products. Phytomedicine. 116, 154862 (2023).
  18. Dai, L., et al. Horizontal cell biology: Monitoring global changes of protein interaction states with the proteome-wide cellular thermal shift assay (CETSA). Annu Rev Biochem. 88, 383-408 (2019).
  19. Lade, D. M., Nicoletti, R., Mersch, J., Agazie, Y. M. Design and synthesis of improved active-site SHP2 inhibitors with anti-breast cancer cell effects. Eur J Med Chem. 247, 115017 (2023).
  20. Jiang, X., et al. Novel chemical-structure TPOR agonist, TMEA, promotes megakaryocytes differentiation and thrombopoiesis via mTOR and ERK signalings. Phytomedicine. 110, 154637 (2023).
  21. Mateus, A., et al. Thermal proteome profiling for interrogating protein interactions. Mol Syst Biol. 16 (3), 9232 (2020).
  22. Sanchez, T. W., et al. Real-time cellular thermal shift assay to monitor target engagement. ACS Chem Biol. 17 (9), 2471-2482 (2022).
  23. Tolvanen, T. A. Current advances in CETSA. Front Mol Biosci. 9, 866764 (2022).
  24. Liu, M., et al. Xanthatin inhibits STAT3 and NF-κB signalling by covalently binding to JAK and IKK kinases. J Cell Mol Med. 23 (6), 4301-4312 (2019).
  25. Liu, Y., Chen, W., Zheng, F., Yu, H., Wei, K. Xanthatin alleviates LPS-Induced inflammatory response in RAW264.7 macrophages by Inhibiting NF-κB, MAPK and STATs activation. Molecules. 27 (14), 4603 (2022).
  26. Dinkova-Kostova, A. T., Kostov, R. V., Canning, P. Keap1, the cysteine-based mammalian intracellular sensor for electrophiles and oxidants. Arch Biochem Biophys. 617, 84-93 (2017).
  27. Tabana, Y., Babu, D., Fahlman, R., Siraki, A. G., Barakat, K. Target identification of small molecules: An overview of the current applications in drug discovery. BMC Biotechnol. 23 (1), 44 (2023).
  28. Schenone, M., Dančík, V., Wagner, B. K., Clemons, P. A. Target identification and mechanism of action in chemical biology and drug discovery. Nat Chem Biol. 9 (4), 232-240 (2013).
  29. Hughes, J. P., Rees, S., Kalindjian, S. B., Philpott, K. L. Principles of early drug discovery. Br J Pharmacol. 162 (6), 1239-1249 (2011).
  30. Chakraborty, C., et al. SARS-CoV-2 protein drug targets landscape: A potential pharmacological insight view for the new drug development. Expert Rev Clin Pharmacol. 14 (2), 225-238 (2021).
  31. Ziegler, S., Pries, V., Hedberg, C., Waldmann, H. Target identification for small bioactive molecules: Finding the needle in the haystack. Angew Chem Int Ed Engl. 52 (10), 2744-2792 (2013).
  32. Zhang, X., et al. Highly effective identification of drug targets at the proteome level by pH-dependent protein precipitation. Chem Sci. 13 (42), 12403-12418 (2022).
  33. Zhang, X., et al. A simplified thermal proteome profiling approach to screen protein targets of a ligand. Proteomics. 20, 1900372 (2020).
  34. Hou, Y., et al. Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway. Phytomedicine. 109, 154568 (2022).
  35. Wang, X., et al. Salidroside, a phenyl ethanol glycoside from Rhodiolacrenulata, orchestrates hypoxic mitochondrial dynamics homeostasis by stimulating Sirt1/p53/Drp1 signaling. J Ethnopharmacol. 293, 115278 (2022).

Play Video

Cite This Article
Luo, L., Xiong, J., Tang, Y., Chen, X., Zhang, H. Protein Target Prediction and Validation of Small Molecule Compound. J. Vis. Exp. (204), e66564, doi:10.3791/66564 (2024).

View Video