Прогнозирование белковых мишеней и валидация низкомолекулярного соединения
Summary
Эксперимент, используемый здесь, показывает метод молекулярного докинга в сочетании с анализом клеточного теплового сдвига для прогнозирования и проверки взаимодействия между малыми молекулами и белковыми мишенями.
Abstract
Белки имеют фундаментальное значение для физиологии человека, а их мишени имеют решающее значение в исследованиях и разработке лекарств. Идентификация и валидация важнейших белковых мишеней стали неотъемлемой частью разработки лекарств. Молекулярный докинг — это вычислительный инструмент, широко используемый для исследования связывания белка с лигандом, особенно в контексте взаимодействия лекарств и белков-мишеней. Для экспериментальной проверки связывания и доступа к связыванию лекарственного препарата и его мишени непосредственно используется метод анализа клеточного теплового сдвига (CETSA). Это исследование было направлено на интеграцию молекулярного докинга с CETSA для прогнозирования и проверки взаимодействий между лекарствами и жизненно важными белковыми мишенями. В частности, мы предсказали взаимодействие между ксантатином и белком Keap1, а также способ его связывания с помощью молекулярного докингового анализа с последующей проверкой взаимодействия с помощью анализа CETSA. Наши результаты показали, что ксантатин может устанавливать водородные связи со специфическими аминокислотными остатками белка Keap1 и снижать термостабильность белка Keap1, что указывает на то, что ксантатин может напрямую взаимодействовать с белком Keap1.
Introduction
Белки являются очень важными макромолекулами в живых организмах и обладают разнообразным спектром уникальных функций в клетках, таких как состав мембраны, формирование цитоскелета, активность ферментов, транспорт, клеточная сигнализация и участие как во внутриклеточных, так и во внеклеточныхмеханизмах. Белки проявляют свои биологические функции в основном через специфические взаимодействия с различными молекулами, включая другие белки, нуклеиновые кислоты, низкомолекулярные лиганды и ионы металлов 1,4. Лиганды — это небольшие молекулярные соединения, которые специфически связываются с белками в организме. Взаимодействие между белками и лигандами происходит в определенных участках белка, называемых сайтами связывания, также известными как карманы связывания5. В исследованиях медицинской химии основное внимание уделяется выявлению ключевых белков, которые явно связаны с заболеваниями, которые служат мишенями для лекарств6. Таким образом, получение глубокого понимания сайтов связывания между белками и лигандами имеет первостепенное значение для содействия открытию, разработке и исследованию лекарств 7,8.
Молекулярный докинг является широко используемым вычислительным инструментом для изучения связывания белка с лигандом, который использует трехмерные структуры белков и лигандов для изучения их первичных способов связывания и сродства при образовании стабильных комплексов 9,10,11. Применение технологии молекулярного докинга зародилось в 1970-х годах. Основываясь на принципе спаривания замка и ключа и используя алгоритмы программного обеспечения молекулярного докинга, можно определить взаимодействие между соединениями и молекулярными мишенями, анализируя результаты докинга. Этот подход позволяет предсказывать активные сайты связывания как для соединения, так и для молекулы-мишени. Следовательно, это облегчает идентификацию оптимальной конформации связывания (здесь называемой моделью связывания) для лиганд-рецепторных взаимодействий, что имеет решающее значение для понимания механики этих молекулярных взаимодействий 12,13,14,15. Хотя молекулярный докинг обеспечивает ценные компьютерные предсказания лиганд-рецепторных взаимодействий, важно отметить, что это предварительные результаты. Следовательно, для подтверждения этих взаимодействий необходима дальнейшая экспериментальная проверка.
Анализ клеточного теплового сдвига (CETSA), первоначально предложенный исследовательской группой Pär Nordlund в 2013 году, служит методом проверки взаимодействий белков между лекарствами и мишенями. Этот метод специально проверяет термическую стабильность белков-мишеней, индуцированных связыванием лекарственного средства, обеспечивая практический подход к подтверждению молекулярных взаимодействий 16,17,18. Этот подход основан на фундаментальном принципе, согласно которому связывание лиганда инициирует тепловой сдвиг внутри белков-мишеней, и применимо к широкому спектру биологических образцов, включая клеточные лизаты, интактные живые клетки и ткани19,20. CETSA поддерживает прямое поражение малых молекул в интактных клетках, обнаруживая термодинамическую стабилизацию белков из-за связывания лигандов и связывая наблюдаемый фенотипический ответ с целевым соединением21,22. Среди различных методологий, заимствованных из CETSA, классический подход считается Western Blot-CETSA (WB-CETSA). После подготовки образца с использованием метода CETSA используется вестерн-блоттинг для обнаружения изменений в термической стабильности целевого белка. Это позволяет точно определять лекарственно-белковые взаимодействия в клеточных системах 17,23.
Ксантатин — это биологически активное соединение, выделенное из растения Xanthium L. с такими противовоспалительными свойствами, которое используется в традиционной китайской медицине для лечения таких заболеваний, как синусит носа и артрит. Келх-подобный ECH-ассоциированный белок 1 (Keap1) является компонентом мультисубъединичного белкового комплекса убиквитинлигазы E3 на основе Cullin3 и важным регулятором внутриклеточного окислительно-восстановительного гомеостаза, который влияет на интенсивность и продолжительность воспалительной реакции путем модуляции внутриклеточного окислительно-восстановительного состояния26. В этом исследовании мы впервые использовали молекулярный докинг для изучения взаимодействия между ксантатином (малой молекулой) и белком Keap1 с целью прогнозирования их способа связывания. Впоследствии мы использовали метод CETSA для подтверждения этого взаимодействия, оценив влияние ксантатина на термическую стабильность белка Keap1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Идентификация мишеней болезней и открытие и разработка лекарств тесно взаимосвязаны27. Точно нацеливаясь на конкретные мишени, можно разработать лекарственные препараты-кандидаты для более эффективного лечения конкретных заболеваний, одновременно минимизируя побочные …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (82004031) и Сычуаньской научно-технической программой (2022NSFSC1303). Выражаем огромную благодарность Цзяи Сунь из Инновационного института китайской медицины и фармации Университета традиционной китайской медицины Чэнду за помощь в проведении вестерн-блоттинга.
Materials
| 0.45 μm Polyvinylidene fluoride membrane | Millipore | PR05509 | |
| Anhydrous ethanol | Chron chemicals | 64-17-5 | |
| Bovine serum albumin | BioFroxx | 4240GR100 | |
| Broad-spectrum protease inhibitor mixtures | Boster Biological Technology Co., Ltd | AR1193 | |
| DMSO | Boster Biological Technology Co., Ltd | PYG0040 | |
| Enhanced chemiluminescence reagent | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | P0018S | |
| GAPDH antibody | ProteinTech Group Co., Ltd | 10494-1-AP | |
| Gel Imaging Instrument | E-BLOT | Touch Imager Pro | |
| Gradient PCR instrument | Biometra TADVANCED | Biometra Tadvanced 96SG | |
| High-speed freezing centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-30R | |
| Horseradish peroxidase-conjugated affiniPure goat antibody | ProteinTech Group Co., Ltd | SA00001-2 | |
| Isopropyl alcohol | Chron chemicals | 67-63-0 | |
| Keap1 antibody | Zen BioScience Co., Ltd | R26935 | |
| Metal bath | Analytik Jena | TSC | |
| Methanol | Chron chemicals | 67-56-1 | |
| Ncmblot rapid transfer buffer (20×) | NCM Biotech Co., Ltd | WB4600 | |
| Omni-Easy OneStep PAGE gel fast preparation kie | Epizyme Biotech Co., Ltd | PG212 | |
| Phosphate buffer saline | Boster Biological Technology Co., Ltd | PYG0021 | |
| Prestained Color Protein Marker | Biosharp | BL741A | |
| Protein Blotting Electrophoresis System | Bio-Rad | MiniPROTEANÒTetra Cell | |
| RAW264.7 cell | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | C7505 | |
| RAW264.7 cell-specific medium | Procell Life Science&Technology Co., Ltd | CM-0597 | |
| SDS-PAGE protein loading buffer | Boster Biological Technology Co., Ltd | AR1112-10 | |
| SDS-PAGE running buffer powder | Servicebio | G2018 | |
| Tris buffered saline powder | Servicebio | G0001 | |
| Tween 20 | BioFroxx | 1247ML100 | |
| Water bath | Memmert | WNE10 | |
| Water purifier | Millipore | Milli- IQ 7005 | |
| Xanthatin | ChemConst Biotechnology Co., Ltd | CONST210706 |
References
- Soleymani, F., Paquet, E., Viktor, H., Michalowski, W., Spinello, D. Protein-protein interaction prediction with deep learning: A comprehensive review. Computat Struct Biotechnol J. 20, 5316-5341 (2022).
- Du, X., et al. Insights into protein-ligand interactions: mechanisms, models, and methods. Int J Mol Sci. 17 (2), 144 (2016).
- Wu, Q., Peng, Z., Zhang, Y., Yang, J. COACH-D: improved protein-ligand binding sites prediction with refined ligand-binding poses through molecular docking. Nucleic Acids Res. 46, W438-W442 (2018).
- Zhang, F., et al. PROBselect: accurate prediction of protein-binding residues from proteins sequences via dynamic predictor selection. Bioinfo. 36, i735-i744 (2020).
- Kandel, J., Tayara, H., Chong, K. T. PUResNet: prediction of protein-ligand binding sites using deep residual neural network. J Cheminfo. 13 (1), 65 (2021).
- Dhakal, A., Mckay, C., Tanner, J. J., Cheng, J. Artificial intelligence in the prediction of protein-ligand interactions: recent advances and future directions. Brief Bioinform. 23 (1), 476 (2022).
- Hatty, C. R., Banati, R. B. Protein-ligand and membrane-ligand interactions in pharmacology: the case of the translocator protein (TSPO). Pharmacol Res. 100, 58-63 (2015).
- Chaires, J. B. Calorimetry and thermodynamics in drug design. Ann Rev Biophys. 37, 135-151 (2008).
- Huang, S. Y., Zou, X. Advances and challenges in protein-ligand docking. Int J Mo Sci. 11 (8), 3016-3034 (2010).
- Li, J., Fu, A., Zhang, L. An overview of scoring functions used for protein-ligand interactions in molecular docking. Interdiscip Sci. 11 (2), 320-328 (2019).
- Crampon, K., Giorkallos, A., Deldossi, M., Baud, S., Steffenel, L. A. Machine-learning methods for ligand-protein molecular docking. Drug Discov Today. 27 (1), 151-164 (2022).
- Pinzi, L., Rastelli, G. Molecular docking: Shifting paradigms in drug discovery. Int J Mol Sci. 20 (18), 4331 (2019).
- Abdolmaleki, A., Ghasemi, F., Ghasemi, J. B. Computer-aided drug design to explore cyclodextrin therapeutics and biomedical applications. Chem Biol Drug Des. 89 (2), 257-268 (2017).
- Chen, G., Seukep, A. J., Guo, M. Recent advances in molecular docking for the research and discovery of potential marine drugs. Mar Drugs. 18 (11), 545 (2020).
- Li, T., Guo, R., Zong, Q., Ling, G. Application of molecular docking in elaborating molecular mechanisms and interactions of supramolecular cyclodextrin. Carbohydr Polym. 276, 118644 (2022).
- Martinez Molina, D., et al. Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay. Science. 341 (6141), 84-87 (2013).
- Tu, Y., Tan, L., Tao, H., Li, Y., Liu, H. CETSA and thermal proteome profiling strategies for target identification and drug discovery of natural products. Phytomedicine. 116, 154862 (2023).
- Dai, L., et al. Horizontal cell biology: Monitoring global changes of protein interaction states with the proteome-wide cellular thermal shift assay (CETSA). Annu Rev Biochem. 88, 383-408 (2019).
- Lade, D. M., Nicoletti, R., Mersch, J., Agazie, Y. M. Design and synthesis of improved active-site SHP2 inhibitors with anti-breast cancer cell effects. Eur J Med Chem. 247, 115017 (2023).
- Jiang, X., et al. Novel chemical-structure TPOR agonist, TMEA, promotes megakaryocytes differentiation and thrombopoiesis via mTOR and ERK signalings. Phytomedicine. 110, 154637 (2023).
- Mateus, A., et al. Thermal proteome profiling for interrogating protein interactions. Mol Syst Biol. 16 (3), 9232 (2020).
- Sanchez, T. W., et al. Real-time cellular thermal shift assay to monitor target engagement. ACS Chem Biol. 17 (9), 2471-2482 (2022).
- Tolvanen, T. A. Current advances in CETSA. Front Mol Biosci. 9, 866764 (2022).
- Liu, M., et al. Xanthatin inhibits STAT3 and NF-κB signalling by covalently binding to JAK and IKK kinases. J Cell Mol Med. 23 (6), 4301-4312 (2019).
- Liu, Y., Chen, W., Zheng, F., Yu, H., Wei, K. Xanthatin alleviates LPS-Induced inflammatory response in RAW264.7 macrophages by Inhibiting NF-κB, MAPK and STATs activation. Molecules. 27 (14), 4603 (2022).
- Dinkova-Kostova, A. T., Kostov, R. V., Canning, P. Keap1, the cysteine-based mammalian intracellular sensor for electrophiles and oxidants. Arch Biochem Biophys. 617, 84-93 (2017).
- Tabana, Y., Babu, D., Fahlman, R., Siraki, A. G., Barakat, K. Target identification of small molecules: An overview of the current applications in drug discovery. BMC Biotechnol. 23 (1), 44 (2023).
- Schenone, M., Dančík, V., Wagner, B. K., Clemons, P. A. Target identification and mechanism of action in chemical biology and drug discovery. Nat Chem Biol. 9 (4), 232-240 (2013).
- Hughes, J. P., Rees, S., Kalindjian, S. B., Philpott, K. L. Principles of early drug discovery. Br J Pharmacol. 162 (6), 1239-1249 (2011).
- Chakraborty, C., et al. SARS-CoV-2 protein drug targets landscape: A potential pharmacological insight view for the new drug development. Expert Rev Clin Pharmacol. 14 (2), 225-238 (2021).
- Ziegler, S., Pries, V., Hedberg, C., Waldmann, H. Target identification for small bioactive molecules: Finding the needle in the haystack. Angew Chem Int Ed Engl. 52 (10), 2744-2792 (2013).
- Zhang, X., et al. Highly effective identification of drug targets at the proteome level by pH-dependent protein precipitation. Chem Sci. 13 (42), 12403-12418 (2022).
- Zhang, X., et al. A simplified thermal proteome profiling approach to screen protein targets of a ligand. Proteomics. 20, 1900372 (2020).
- Hou, Y., et al. Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway. Phytomedicine. 109, 154568 (2022).
- Wang, X., et al. Salidroside, a phenyl ethanol glycoside from Rhodiolacrenulata, orchestrates hypoxic mitochondrial dynamics homeostasis by stimulating Sirt1/p53/Drp1 signaling. J Ethnopharmacol. 293, 115278 (2022).
