Küçük moleküllü bileşiğin protein hedef tahmini ve validasyonu
Summary
Burada kullanılan deney, küçük moleküller ve protein hedefleri arasındaki etkileşimi tahmin etmek ve doğrulamak için hücresel termal kayma testi ile birleştirilmiş bir moleküler yerleştirme yöntemini göstermektedir.
Abstract
Proteinler insan fizyolojisi için temeldir ve hedefleri araştırma ve ilaç geliştirmede çok önemlidir. Önemli protein hedeflerinin tanımlanması ve doğrulanması, ilaç geliştirmenin ayrılmaz bir parçası haline gelmiştir. Moleküler yerleştirme, özellikle ilaç ve protein hedef etkileşimleri bağlamında, protein-ligand bağlanmasını araştırmak için yaygın olarak kullanılan bir hesaplama aracıdır. Bağlanmanın deneysel olarak doğrulanması ve ilacın ve hedefinin bağlanmasına doğrudan erişmek için hücresel termal kayma testi (CETSA) yöntemi kullanılır. Bu çalışma, ilaçlar ve hayati protein hedefleri arasındaki etkileşimleri tahmin etmek ve doğrulamak için moleküler yerleştirmeyi CETSA ile entegre etmeyi amaçladı. Spesifik olarak, ksantatin ve Keap1 proteini arasındaki etkileşimi ve moleküler yerleştirme analizi yoluyla bağlanma modunu tahmin ettik ve ardından CETSA tahlili kullanılarak etkileşimin doğrulanmasını izledik. Sonuçlarımız, ksantatinin Keap1 proteininin spesifik amino asit kalıntıları ile hidrojen bağları kurabildiğini ve Keap1 proteininin termostabilitesini azaltabildiğini gösterdi, bu da ksantatinin Keap1 proteini ile doğrudan etkileşime girebileceğini gösterdi.
Introduction
Proteinler, canlı organizmalarda son derece önemli makromoleküllerdir ve hücreler içinde zar bileşimi, hücre iskeleti oluşumu, enzim aktivitesi, taşıma, hücre sinyalizasyonu ve hem hücre içi hem de hücre dışı mekanizmalarda yer alma gibi çok çeşitli benzersiz işlevlere sahiptir 1,2,3. Proteinler biyolojik işlevlerini esas olarak diğer proteinler, nükleik asitler, küçük moleküllü ligandlar vemetal iyonları 1,4 dahil olmak üzere çeşitli moleküllerle spesifik etkileşimler yoluyla gösterirler. Ligandlar, bir organizmadaki proteinlere spesifik olarak bağlanan küçük moleküler bileşiklerdir. Proteinler ve ligandlar arasındaki etkileşim, bağlanma cepleri5 olarak da bilinen bağlanma bölgeleri adı verilen protein üzerindeki belirli bölgelerde meydana gelir. Tıbbi kimya araştırmalarında odak noktası, ilaçlar için hedef olarak hizmet eden hastalıklarla açıkça ilişkili olan anahtar proteinlerin belirlenmesinde yatmaktadır6. Bu nedenle, proteinler ve ligandlar arasındaki bağlanma bölgelerinin derinlemesine anlaşılması, ilaç keşfi, tasarımı ve araştırmasının teşvik edilmesinde son derece önemlidir 7,8.
Moleküler yerleştirme, kararlı kompleksler oluştururken birincil bağlanma modlarını ve afinitelerini keşfetmek için proteinlerin ve ligandların üç boyutlu yapılarını kullanan, protein-ligand bağlanmasını incelemek için yaygın olarak kullanılan bir hesaplama aracıdır 9,10,11. Moleküler yerleştirme teknolojisinin uygulanması 1970’lerde ortaya çıkmıştır. Kilit ve anahtar eşleştirme ilkesine dayalı olarak ve moleküler yerleştirme yazılımının algoritmalarını kullanarak, yerleştirme sonuçlarını analiz ederek bileşikler ve moleküler hedefler arasındaki etkileşim belirlenebilir. Bu yaklaşım, hem bileşik hem de hedef molekül için aktif bağlanma bölgelerinin tahmin edilmesini sağlar. Sonuç olarak, bu moleküler etkileşimlerinmekaniğini anlamak için çok önemli olan ligand-reseptör etkileşimleri için optimal bir bağlanma konformasyonunun (burada bağlanma modeli olarak adlandırılır) tanımlanmasını kolaylaştırır 12,13,14,15. Moleküler yerleştirme, ligand-reseptör etkileşimlerinin değerli bilgisayar tabanlı tahminlerini sağlarken, bunların ön bulgular olduğuna dikkat etmek önemlidir. Sonuç olarak, bu etkileşimleri doğrulamak için daha fazla deneysel doğrulama şarttır.
İlk olarak 2013 yılında Pär Nordlund’un araştırma ekibi tarafından önerilen hücresel termal kayma testi (CETSA), ilaç-hedef protein etkileşimlerini doğrulamak için bir yöntem olarak hizmet eder. Bu teknik, ilaç bağlanması ile indüklenen hedef proteinlerin termal stabilitesini spesifik olarak test eder ve moleküler etkileşimleri doğrulamak için pratik bir yaklaşım sağlar 16,17,18. Bu yaklaşım, ligand bağlanmasının hedef proteinler içinde bir termal kayma başlattığı ve hücre lizatları, bozulmamış canlı hücreler ve dokular dahil olmak üzere çok çeşitli biyolojik numunelere uygulanabilir olduğu temel ilkesine dayanmaktadır19,20. CETSA, ligand bağlanması nedeniyle proteinlerin termodinamik stabilizasyonunu tespit ederek ve gözlemlenen fenotipik yanıtı hedef bileşiğebağlayarak bozulmamış hücrelerde küçük moleküllerin doğrudan hedef etkileşimini destekler 21,22. CETSA’dan türetilen çeşitli metodolojiler arasında, Western Blot-CETSA (WB-CETSA) klasik bir yaklaşım olarak kabul edilir. CETSA yöntemi kullanılarak numune hazırlandıktan sonra, hedef proteinin termal stabilitesindeki değişiklikleri tespit etmek için western blot analizi kullanılır. Bu, hücresel sistemler içindeki ilaç-protein etkileşimlerinin kesin olarak belirlenmesine izin verir17,23.
Ksantatin, geleneksel Çin tıbbında nazal sinüzit ve artrit gibi hastalıkları tedavi etmek için kullanılan anti-inflamatuar gibi özelliklere sahip Xanthium L. bitkisinden izole edilen biyoaktif bir bileşiktir24,25. Kelch benzeri ECH ile ilişkili protein 1 (Keap1), Cullin3 bazlı Cullin-RING E3 ubikitin ligaz çok alt birimli protein kompleksinin bir bileşenidir ve hücre içi redoks durumunu modüle ederek inflamatuar yanıtın yoğunluğunu ve süresini etkileyen hücre içi redoks homeostazının önemli bir düzenleyicisidir26. Bu çalışmada, ilk olarak, bağlanma modlarını tahmin etmeyi amaçlayan, ksantatin (küçük moleküllü) ve Keap1 proteini arasındaki etkileşimi araştırmak için moleküler yerleştirme kullandık. Daha sonra, ksantatinin Keap1 proteininin termal stabilitesi üzerindeki etkisini değerlendirerek bu etkileşimi doğrulamak için CETSA yöntemini kullandık.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hastalık hedeflerinin belirlenmesi ve ilaçların keşfi ve geliştirilmesi birbiriyle yakından bağlantılıdır27. Spesifik hedefleri tam olarak hedefleyerek, ilaçlarla ilişkili yan etkileri en aza indirirken aynı zamanda belirli hastalıkları daha etkili bir şekilde tedavi etmek için ilaç adayları geliştirilebilir28,29. En sık kullanılan hedefler protein hedefleridir30. Bununla birlikte, özel protei…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (82004031) ve Sichuan Bilim ve Teknoloji Programı (2022NSFSC1303) tarafından desteklenmiştir. Chengdu Geleneksel Çin Tıbbı Üniversitesi, Yenilikçi Çin Tıbbı ve Eczacılık Enstitüsü’nden Jiayi Sun’a batı lekesine yardım ettiği için büyük takdirimizi sunuyoruz.
Materials
| 0.45 μm Polyvinylidene fluoride membrane | Millipore | PR05509 | |
| Anhydrous ethanol | Chron chemicals | 64-17-5 | |
| Bovine serum albumin | BioFroxx | 4240GR100 | |
| Broad-spectrum protease inhibitor mixtures | Boster Biological Technology Co., Ltd | AR1193 | |
| DMSO | Boster Biological Technology Co., Ltd | PYG0040 | |
| Enhanced chemiluminescence reagent | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | P0018S | |
| GAPDH antibody | ProteinTech Group Co., Ltd | 10494-1-AP | |
| Gel Imaging Instrument | E-BLOT | Touch Imager Pro | |
| Gradient PCR instrument | Biometra TADVANCED | Biometra Tadvanced 96SG | |
| High-speed freezing centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-30R | |
| Horseradish peroxidase-conjugated affiniPure goat antibody | ProteinTech Group Co., Ltd | SA00001-2 | |
| Isopropyl alcohol | Chron chemicals | 67-63-0 | |
| Keap1 antibody | Zen BioScience Co., Ltd | R26935 | |
| Metal bath | Analytik Jena | TSC | |
| Methanol | Chron chemicals | 67-56-1 | |
| Ncmblot rapid transfer buffer (20×) | NCM Biotech Co., Ltd | WB4600 | |
| Omni-Easy OneStep PAGE gel fast preparation kie | Epizyme Biotech Co., Ltd | PG212 | |
| Phosphate buffer saline | Boster Biological Technology Co., Ltd | PYG0021 | |
| Prestained Color Protein Marker | Biosharp | BL741A | |
| Protein Blotting Electrophoresis System | Bio-Rad | MiniPROTEANÒTetra Cell | |
| RAW264.7 cell | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | C7505 | |
| RAW264.7 cell-specific medium | Procell Life Science&Technology Co., Ltd | CM-0597 | |
| SDS-PAGE protein loading buffer | Boster Biological Technology Co., Ltd | AR1112-10 | |
| SDS-PAGE running buffer powder | Servicebio | G2018 | |
| Tris buffered saline powder | Servicebio | G0001 | |
| Tween 20 | BioFroxx | 1247ML100 | |
| Water bath | Memmert | WNE10 | |
| Water purifier | Millipore | Milli- IQ 7005 | |
| Xanthatin | ChemConst Biotechnology Co., Ltd | CONST210706 |
References
- Soleymani, F., Paquet, E., Viktor, H., Michalowski, W., Spinello, D. Protein-protein interaction prediction with deep learning: A comprehensive review. Computat Struct Biotechnol J. 20, 5316-5341 (2022).
- Du, X., et al. Insights into protein-ligand interactions: mechanisms, models, and methods. Int J Mol Sci. 17 (2), 144 (2016).
- Wu, Q., Peng, Z., Zhang, Y., Yang, J. COACH-D: improved protein-ligand binding sites prediction with refined ligand-binding poses through molecular docking. Nucleic Acids Res. 46, W438-W442 (2018).
- Zhang, F., et al. PROBselect: accurate prediction of protein-binding residues from proteins sequences via dynamic predictor selection. Bioinfo. 36, i735-i744 (2020).
- Kandel, J., Tayara, H., Chong, K. T. PUResNet: prediction of protein-ligand binding sites using deep residual neural network. J Cheminfo. 13 (1), 65 (2021).
- Dhakal, A., Mckay, C., Tanner, J. J., Cheng, J. Artificial intelligence in the prediction of protein-ligand interactions: recent advances and future directions. Brief Bioinform. 23 (1), 476 (2022).
- Hatty, C. R., Banati, R. B. Protein-ligand and membrane-ligand interactions in pharmacology: the case of the translocator protein (TSPO). Pharmacol Res. 100, 58-63 (2015).
- Chaires, J. B. Calorimetry and thermodynamics in drug design. Ann Rev Biophys. 37, 135-151 (2008).
- Huang, S. Y., Zou, X. Advances and challenges in protein-ligand docking. Int J Mo Sci. 11 (8), 3016-3034 (2010).
- Li, J., Fu, A., Zhang, L. An overview of scoring functions used for protein-ligand interactions in molecular docking. Interdiscip Sci. 11 (2), 320-328 (2019).
- Crampon, K., Giorkallos, A., Deldossi, M., Baud, S., Steffenel, L. A. Machine-learning methods for ligand-protein molecular docking. Drug Discov Today. 27 (1), 151-164 (2022).
- Pinzi, L., Rastelli, G. Molecular docking: Shifting paradigms in drug discovery. Int J Mol Sci. 20 (18), 4331 (2019).
- Abdolmaleki, A., Ghasemi, F., Ghasemi, J. B. Computer-aided drug design to explore cyclodextrin therapeutics and biomedical applications. Chem Biol Drug Des. 89 (2), 257-268 (2017).
- Chen, G., Seukep, A. J., Guo, M. Recent advances in molecular docking for the research and discovery of potential marine drugs. Mar Drugs. 18 (11), 545 (2020).
- Li, T., Guo, R., Zong, Q., Ling, G. Application of molecular docking in elaborating molecular mechanisms and interactions of supramolecular cyclodextrin. Carbohydr Polym. 276, 118644 (2022).
- Martinez Molina, D., et al. Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay. Science. 341 (6141), 84-87 (2013).
- Tu, Y., Tan, L., Tao, H., Li, Y., Liu, H. CETSA and thermal proteome profiling strategies for target identification and drug discovery of natural products. Phytomedicine. 116, 154862 (2023).
- Dai, L., et al. Horizontal cell biology: Monitoring global changes of protein interaction states with the proteome-wide cellular thermal shift assay (CETSA). Annu Rev Biochem. 88, 383-408 (2019).
- Lade, D. M., Nicoletti, R., Mersch, J., Agazie, Y. M. Design and synthesis of improved active-site SHP2 inhibitors with anti-breast cancer cell effects. Eur J Med Chem. 247, 115017 (2023).
- Jiang, X., et al. Novel chemical-structure TPOR agonist, TMEA, promotes megakaryocytes differentiation and thrombopoiesis via mTOR and ERK signalings. Phytomedicine. 110, 154637 (2023).
- Mateus, A., et al. Thermal proteome profiling for interrogating protein interactions. Mol Syst Biol. 16 (3), 9232 (2020).
- Sanchez, T. W., et al. Real-time cellular thermal shift assay to monitor target engagement. ACS Chem Biol. 17 (9), 2471-2482 (2022).
- Tolvanen, T. A. Current advances in CETSA. Front Mol Biosci. 9, 866764 (2022).
- Liu, M., et al. Xanthatin inhibits STAT3 and NF-κB signalling by covalently binding to JAK and IKK kinases. J Cell Mol Med. 23 (6), 4301-4312 (2019).
- Liu, Y., Chen, W., Zheng, F., Yu, H., Wei, K. Xanthatin alleviates LPS-Induced inflammatory response in RAW264.7 macrophages by Inhibiting NF-κB, MAPK and STATs activation. Molecules. 27 (14), 4603 (2022).
- Dinkova-Kostova, A. T., Kostov, R. V., Canning, P. Keap1, the cysteine-based mammalian intracellular sensor for electrophiles and oxidants. Arch Biochem Biophys. 617, 84-93 (2017).
- Tabana, Y., Babu, D., Fahlman, R., Siraki, A. G., Barakat, K. Target identification of small molecules: An overview of the current applications in drug discovery. BMC Biotechnol. 23 (1), 44 (2023).
- Schenone, M., Dančík, V., Wagner, B. K., Clemons, P. A. Target identification and mechanism of action in chemical biology and drug discovery. Nat Chem Biol. 9 (4), 232-240 (2013).
- Hughes, J. P., Rees, S., Kalindjian, S. B., Philpott, K. L. Principles of early drug discovery. Br J Pharmacol. 162 (6), 1239-1249 (2011).
- Chakraborty, C., et al. SARS-CoV-2 protein drug targets landscape: A potential pharmacological insight view for the new drug development. Expert Rev Clin Pharmacol. 14 (2), 225-238 (2021).
- Ziegler, S., Pries, V., Hedberg, C., Waldmann, H. Target identification for small bioactive molecules: Finding the needle in the haystack. Angew Chem Int Ed Engl. 52 (10), 2744-2792 (2013).
- Zhang, X., et al. Highly effective identification of drug targets at the proteome level by pH-dependent protein precipitation. Chem Sci. 13 (42), 12403-12418 (2022).
- Zhang, X., et al. A simplified thermal proteome profiling approach to screen protein targets of a ligand. Proteomics. 20, 1900372 (2020).
- Hou, Y., et al. Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway. Phytomedicine. 109, 154568 (2022).
- Wang, X., et al. Salidroside, a phenyl ethanol glycoside from Rhodiolacrenulata, orchestrates hypoxic mitochondrial dynamics homeostasis by stimulating Sirt1/p53/Drp1 signaling. J Ethnopharmacol. 293, 115278 (2022).
