Summary

Sanntids in vitro migrasjonsanalyse for primære murine CD8+ T-celler

Published: May 24, 2024
doi:

Summary

Denne protokollen gir en metode for primær murine T-celleisolering og time-lapse-mikroskopi av T-cellemigrasjon under spesifikke miljøforhold med kvantitativ analyse.

Abstract

Den adaptive immunresponsen er avhengig av en T-celles evne til å migrere gjennom blod, lymfe og vev som respons på patogener og fremmedlegemer. T-cellemigrasjon er en kompleks prosess som krever koordinering av mange signalinnganger fra miljøet og lokale immunceller, inkludert kjemokiner, kjemokinreseptorer og adhesjonsmolekyler. Videre påvirkes T-cellemotiliteten av dynamiske omkringliggende miljøsignaler, som kan endre aktiveringstilstand, transkripsjonslandskap, adhesjonsmolekyluttrykk og mer. In vivo gjør kompleksiteten til disse tilsynelatende sammenflettede faktorene det vanskelig å skille individuelle signaler som bidrar til T-cellemigrasjon. Denne protokollen gir en rekke metoder fra T-celleisolering til datastøttet analyse for å vurdere T-cellemigrasjon i sanntid under svært spesifikke miljøforhold. Disse forholdene kan bidra til å belyse mekanismer som regulerer migrasjon, forbedre vår forståelse av T-cellekinetikk og gi sterke mekanistiske bevis som er vanskelig å oppnå gjennom dyreforsøk. En dypere forståelse av de molekylære interaksjonene som påvirker cellemigrasjon er viktig for å utvikle forbedrede terapier.

Introduction

T-celler er de viktigste effektorene av den adaptive, antigenspesifikke immunresponsen. På populasjonsnivå er T-celler heterogene, sammensatt av cellulære undergrupper med distinkte spesialiserte funksjoner. Viktigere er at CD8+ T-celler er de viktigste cytolytiske effektorene til immunsystemet, som direkte eliminerer infiserte eller dysfunksjonelle celler1.

Modne CD8+ T-celler ligger i vev og sirkulerer gjennom blod og lymfatikk på jakt etter antigener. Under infeksjon blir T-celler presentert med antigener i blod eller vev og drenerer raskt til milten eller nærmeste drenerende lymfeknute for å starte en produktiv immunrespons. I begge tilfeller blir T-celler aktivert, gjennomgår klonal ekspansjon og forlater lymfesystemet for å komme inn i blodet, hvis de ikke allerede er der. Under denne prosessen gir intracellulær signalering nedregulering av lymfatiske målsøkingsreseptorer og oppregulering av en rekke integrin- og kjemokinreseptorer som er essensielle for vevsspesifikk migrasjon2. Til syvende og sist er den rettede migrasjonen av T-celler til infeksjonssteder drevet av konvergerende miljøsignaler som inkluderer integrin- og kjemokinsignalering.

Kjemokiner kan grovt kategoriseres i to hovedklasser: (1) homeostatiske signaler, som er essensielle for differensiering, overlevelse og basalfunksjon, og (2) inflammatoriske signaler, som CXCL9, CXCL10 og CCL3, som er nødvendige for kjemotaxis. Generelt skaper kjemokiner en signalgradient som driver retningsbestemt migrasjon, kjent som kjemotaksi, i tillegg til å aktivere integrinuttrykk1. Kjemotaksi er finregulert og svært følsom, med T-celler som er i stand til å reagere på små endringer i gradient som kan føre dem mot en bestemt retning eller plassering.

I tillegg til disse T-cellerelaterte faktorene, påvirkes migrasjonen også av den ekstracellulære matrisens (ECM) sammensetning og tetthet. ECM består av et tett nettverk av proteiner, inkludert kollagen og proteoglykaner, som gir stillaset for klebende integrinreseptorer på T-celler. Integriner er en mangfoldig familie av transmembrane proteiner, hver med høyt spesialiserte bindingsdomener og nedstrøms signaleffekter. Dynamisk ekspresjon av integrinreseptorer på overflaten av en T-celle muliggjør rask tilpasning til deres skiftende omgivelser3. Viktigere er at integriner forbinder ECM og intracellulære cytoskjelettaktinnettverk som jobber sammen for å generere drivkraften som kreves for T-cellebevegelse.

Oppsummert varierer migrasjonsmønstre basert på immuncellefenotypen eller miljøsignaler. Disse komplekse biologiske prosessene er tett regulert av ekspresjonen av cytokiner, kjemokiner og integriner på overflaten av T-cellen, omkringliggende celler og det lokale, infiserte vevet. In vivo kan disse migrasjonsmekanismene være komplekse og kan være et resultat av flere additive signaler4. På grunn av denne kompleksiteten kan det være umulig å etablere en årsakssammenheng mellom tilsynelatende sammenlåste variabler. For å overvinne dette er det flere in vitro-tilnærminger for å studere spesifikke aspekter ved T-cellemigrasjon, for eksempel respons på spesifikke kjemokinsignaler og interaksjonen mellom T-celleintegriner og ECM-bindende proteiner. Denne protokollen tar for seg metoder for å isolere og aktivere murine CD8+ T-celler, med in vitro-migrasjonsanalyser i todimensjonalt rom og beregningsanalyseverktøy for å analysere spesifisert T-cellemigrasjon. Disse metodene er fordelaktige for brukeren fordi de ikke krever sofistikerte materialer eller enheter, som med noen andre cellemigrasjonsanalyser beskrevet i litteraturen. Cellemigrasjonsdata generert med disse metodene kan gi bevis på immunresponser på en forenklet måte som muliggjør videre, informert undersøkelse in vivo.

Protocol

Dyreprotokollene ble godkjent av University Committee on Animal Resources ved University of Rochester. Musene i denne studien ble holdt i det patogenfrie rommet til University of Rochester dyreanlegg. Hann/hunn C57BL/6 mus, i alderen 6-12 uker (15-30 g), ble brukt i denne studien. Musevevsisolering kan utføres på en benkeplate med hansker for å dekke hendene og en ansiktsmaske for å dekke nese og munn, eller inne i et biosikkerhetsskap. All cellekultur og platepreparering må utføres i et biosikkerhetsskap. Reagense…

Representative Results

Bekreftelse av T-celleaktivering kan oppnås ved flowcytometri, på jakt etter økt ekspresjon av CD69 og CD44, som er kanoniske markører for aktivering i murine T-celler6. I tillegg kan renheten til T-cellepopulasjonen bestemmes ved flowcytometri for CD3+ CD8+ T-celler. Denne metoden gir >90 % CD8+ T-cellepopulasjon. T-cellemigrasjon kan vurderes med programvareassisterte cellesporingsprogrammer som er både reproduserbare og justerbar…

Discussion

Å forstå den biologiske effekten av konvergerende signaler in vivo er utfordrende og ikke lett å tolke. Protokollene som presenteres her gir en rimelig metode for å forstå T-cellemigrasjon under høyt definerte og biologisk relevante forhold. Disse forholdene kan spesifiseres basert på etterforskerens skjønn, og protokollene kan modifiseres for å passe behovene til ulike T-cellepopulasjoner, aktiveringsstatus og cellefenotype. Videre kan mange ligander og reseptorer avhøres gjennom disse definerte antis…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi takker tidligere og nåværende medlemmer av Kim Lab som har bidratt til utviklingen av disse protokollene over tid. Representative data ble muliggjort av P01 AI102851/AI/NIAID NIH HHS/USA OG P01 HL018208/HL/NHLBI NIH HHS/USA. Denne publikasjonen ble delvis muliggjort av tilskudd nummer T32 GM135134 fra Institutional Ruth L. Kirschstein National Research Service Award.

Materials

10 cm dish Corning 353003 or equivalent
15 mL conical tube ThermoFisher 339650 or equivalent
1x DPBS Gibco 14190144 without calcium and without magnesium
6 well plate non-TC treated Corning 3736 or equivalent
70 µm cell strainer FisherScientific 352350 or equivalent
ACK lysing buffer ThermoFisher A1049201 or equivalent
Allegra 6KR centrifuge ThermoScientific sorvall 16R with tx400 3655 rotor and bucket or equivalent
Beta mercaptoethanol Sigma M3148 or equivalent
CellTrace Violet ThermoFisher C34571 Or equivalent
Centrifuge ThermoScientific Sorvall ST 16R or equivalent
Collagen (IV) Corning 354233 or equivalent
DeltaT culture dish .17 mm thick glass clear Bioptechs 04200417C
Dynabeads Sheep anti-Rat IgG Invitrogen 11035
DynaMag 15 Magnet ThermoFisher Scientific 12301D or equivalent
Easy sep mouse T cell isolation kit Stem Cell 19851
FBS SigmaAldrich F2442-500ML or equivalent
Fibronectin SigmaAldrich 10838039001 or equivalent
Fiji http://fiji.sc/ weblink
Filter cubes Nikon or Olympus
GK1.5 ATCC TIB-207
HEPES ThermoFisher 15630080 or equivalent
HQ CCD camera CoolSNAP or equivalent
ImageJ http://imagej.nih.gov/ij/h weblink
ImageJ automatic tracking plug in http://imagej.net/TrackMate weblink
ImageJ manual tracking plug in https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.html weblink
L-15 Various See Materials Medium Recipe: Leibovitz’s L-15 medium without phenol red (Gibco) supplemented with 1-5 g/L glucose
Liebovitz's L-15 medium, no phenol red ThermoFisher 21083027
Luer Lok disposable syringe Fisher Scientific 14-955-459 or equivalent
Lymphocyte separation medium Corning 25-072-CI or equivalent
M5/114 ATCC TIB-120
MEM Non-Essential Amino Acids ThermoFisher 11140050 or equivalent
Microscope heating system Okolab okolab.com Custom designs available
Millicell EZ slide Millipore C86024
Mojosort mouse CD8+ Naïve T cell isolation kit Biolegend 480043
Mouse E-cadherin R&D systems 8875-EC-050 or equivalent
Mouse surgical dissection kit Fisher Scientific 13-820-096 or equivalent
NIS elements Nikon Software
non-TC 24wp Corning 353047 or equivalent
Penicillin-streptomycin ThermoFisher 15140122 or equivalent
Protein A ThermoFisher Scientific or equivalent
R9 Various See Materials Medium Recipe: RPMI 1640x supplemented with 10 % FBS, 1 % antibiotic-antimycotic (Gibco), 20 mM HEPES buffer (Gibco), 1 % MEM Non-Essential Amino Acids (Gibco), 50 μM β-mercaptoethanol (Sigma-Aldrich)
Recombinant mouse ICAM-1 Fc chimera R&D systems 796-IC-050 or equivalent
Recombinant Mouse IL2 Biolegend 575410 or equivalent
RPMI 1640x ThermoFisher 11875093 or equivalent
T pins Fisher Scientific S99385 or equivalent
TE2000-U microscope Nikon or equivalent
Various recombinant mouse chemokine R&D systems or equivalent
VCAM-1 Fc chimera R&D systems 643-VM-050 or equivalent
Volocity PerkinElmer Software

References

  1. Sun, L., Su, Y., Jiao, A., Wang, X., Zhang, B. T cells in health and disease. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 235 (2023).
  2. Fowell, D. J., Kim, M. The spatio-temporal control of effector T cell migration. Nat Rev Immunol. 21 (9), 582-596 (2021).
  3. Tabdanov, E. D., et al. Engineering t cells to enhance 3d migration through structurally and mechanically complex tumor microenvironments. Nat Commun. 12 (1), 2815 (2021).
  4. Kameritsch, P., Renkawitz, J. Principles of leukocyte migration strategies. Trends Cell Biol. 30 (10), 818-832 (2020).
  5. Flaherty, S., Reynolds, J. M. Mouse naive CD4+ T cell isolation and in vitro differentiation into t cell subsets. J Vis Exp. (98), e52739 (2015).
  6. Sailer, C. J., et al. Pd-1(hi) CAR-T cells provide superior protection against solid tumors. Front Immunol. 14, 1187850 (2023).
  7. Lim, K., Hyun, Y. M., Lambert-Emo, K., Topham, D. J., Kim, M. Visualization of integrin mac-1 in vivo. J Immunol Methods. 426, 120-127 (2015).
  8. Lim, K., et al. Neutrophil trails guide influenza-specific CD8+ T cells in the airways. Science. 349, 4352 (2015).
  9. Lim, K., et al. In situ neutrophil efferocytosis shapes T cell immunity to influenza infection. Nat Immunol. 21 (9), 1046-1057 (2020).
  10. Reilly, E. C., et al. T(rm) integrins CD103 and CD49a differentially support adherence and motility after resolution of influenza virus infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (22), 12306-12314 (2020).
  11. Amitrano, A. M., et al. Optical control of CD8(+) T cell metabolism and effector functions. Front Immunol. 12, 666231 (2021).
  12. Xu, Y., et al. Optogenetic control of chemokine receptor signal and t-cell migration. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (17), 6371-6376 (2014).
  13. Capece, T., et al. A novel intracellular pool of IFA-1 is critical for asymmetric CD8(+) T cell activation and differentiation. J Cell Biol. 216 (11), 3817-3829 (2017).
  14. Hirai, T., Whitley, S. K., Kaplan, D. H. Migration and function of memory CD8(+) T cells in skin. J Invest Dermatol. 140 (4), 748-755 (2020).
  15. Mouchacca, P., Schmitt-Verhulst, A. M., Boyer, C. Visualization of cytolytic T cell differentiation and granule exocytosis with T cells from mice expressing active fluorescent granzyme B. PLoS One. 8 (6), e67239 (2013).
  16. Nuzzi, P. A., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A. Analysis of neutrophil chemotaxis. Methods Mol Biol. 370, 23-36 (2007).
  17. Heit, B., Tavener, S., Raharjo, E., Kubes, P. An intracellular signaling hierarchy determines direction of migration in opposing chemotactic gradients. J Cell Biol. 159 (1), 91-102 (2002).
  18. Zigmond, S. H. Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors. J Cell Biol. 75 (2), 606-616 (1977).
  19. Jowhar, D., Wright, G., Samson, P. C., Wikswo, J. P., Janetopoulos, C. Open access microfluidic device for the study of cell migration during chemotaxis. Integr Biol (Camb). 2 (11-12), 648-658 (2010).
  20. Sai, J., Walker, G., Wikswo, J., Richmond, A. The IL sequence in the LLKIL motif in CXCR2 is required for full ligand-induced activation of Erk, Akt, and chemotaxis in HL60 cells. J Biol Chem. 281 (47), 35931-35941 (2006).
  21. Choi, Y., Sunkara, V., Lee, Y., Cho, Y. K. Exhausted mature dendritic cells exhibit a slower and less persistent random motility but retain chemotaxis against ccl19. Lab Chip. 22 (2), 377-386 (2022).
  22. Harding, M. G., Zhang, K., Conly, J., Kubes, P. Neutrophil crawling in capillaries: A novel immune response to staphylococcus aureus. PLoS Pathog. 10 (10), e1004379 (2014).
  23. Rommerswinkel, N., Niggemann, B., Keil, S., Zanker, K. S., Dittmar, T. Analysis of cell migration within a three-dimensional collagen matrix. J Vis Exp. (92), e51963 (2014).
  24. Wu, P. H., Giri, A., Sun, S. X., Wirtz, D. Three-dimensional cell migration does not follow a random walk. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (11), 3949-3954 (2014).
  25. Lammermann, T., et al. Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing. Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).
  26. Overstreet, M. G., et al. Inflammation-induced interstitial migration of effector CD4(+) T cells is dependent on integrin αv. Nat Immunol. 14 (9), 949-958 (2013).

Play Video

Cite This Article
Ryan, A. T., Dahal, A., Mir, S., Kim, M., Lim, K. Real-Time In Vitro Migration Assay for Primary Murine CD8+ T Cells. J. Vis. Exp. (207), e66580, doi:10.3791/66580 (2024).

View Video