Denne protokollen gir en metode for primær murine T-celleisolering og time-lapse-mikroskopi av T-cellemigrasjon under spesifikke miljøforhold med kvantitativ analyse.
Den adaptive immunresponsen er avhengig av en T-celles evne til å migrere gjennom blod, lymfe og vev som respons på patogener og fremmedlegemer. T-cellemigrasjon er en kompleks prosess som krever koordinering av mange signalinnganger fra miljøet og lokale immunceller, inkludert kjemokiner, kjemokinreseptorer og adhesjonsmolekyler. Videre påvirkes T-cellemotiliteten av dynamiske omkringliggende miljøsignaler, som kan endre aktiveringstilstand, transkripsjonslandskap, adhesjonsmolekyluttrykk og mer. In vivo gjør kompleksiteten til disse tilsynelatende sammenflettede faktorene det vanskelig å skille individuelle signaler som bidrar til T-cellemigrasjon. Denne protokollen gir en rekke metoder fra T-celleisolering til datastøttet analyse for å vurdere T-cellemigrasjon i sanntid under svært spesifikke miljøforhold. Disse forholdene kan bidra til å belyse mekanismer som regulerer migrasjon, forbedre vår forståelse av T-cellekinetikk og gi sterke mekanistiske bevis som er vanskelig å oppnå gjennom dyreforsøk. En dypere forståelse av de molekylære interaksjonene som påvirker cellemigrasjon er viktig for å utvikle forbedrede terapier.
T-celler er de viktigste effektorene av den adaptive, antigenspesifikke immunresponsen. På populasjonsnivå er T-celler heterogene, sammensatt av cellulære undergrupper med distinkte spesialiserte funksjoner. Viktigere er at CD8+ T-celler er de viktigste cytolytiske effektorene til immunsystemet, som direkte eliminerer infiserte eller dysfunksjonelle celler1.
Modne CD8+ T-celler ligger i vev og sirkulerer gjennom blod og lymfatikk på jakt etter antigener. Under infeksjon blir T-celler presentert med antigener i blod eller vev og drenerer raskt til milten eller nærmeste drenerende lymfeknute for å starte en produktiv immunrespons. I begge tilfeller blir T-celler aktivert, gjennomgår klonal ekspansjon og forlater lymfesystemet for å komme inn i blodet, hvis de ikke allerede er der. Under denne prosessen gir intracellulær signalering nedregulering av lymfatiske målsøkingsreseptorer og oppregulering av en rekke integrin- og kjemokinreseptorer som er essensielle for vevsspesifikk migrasjon2. Til syvende og sist er den rettede migrasjonen av T-celler til infeksjonssteder drevet av konvergerende miljøsignaler som inkluderer integrin- og kjemokinsignalering.
Kjemokiner kan grovt kategoriseres i to hovedklasser: (1) homeostatiske signaler, som er essensielle for differensiering, overlevelse og basalfunksjon, og (2) inflammatoriske signaler, som CXCL9, CXCL10 og CCL3, som er nødvendige for kjemotaxis. Generelt skaper kjemokiner en signalgradient som driver retningsbestemt migrasjon, kjent som kjemotaksi, i tillegg til å aktivere integrinuttrykk1. Kjemotaksi er finregulert og svært følsom, med T-celler som er i stand til å reagere på små endringer i gradient som kan føre dem mot en bestemt retning eller plassering.
I tillegg til disse T-cellerelaterte faktorene, påvirkes migrasjonen også av den ekstracellulære matrisens (ECM) sammensetning og tetthet. ECM består av et tett nettverk av proteiner, inkludert kollagen og proteoglykaner, som gir stillaset for klebende integrinreseptorer på T-celler. Integriner er en mangfoldig familie av transmembrane proteiner, hver med høyt spesialiserte bindingsdomener og nedstrøms signaleffekter. Dynamisk ekspresjon av integrinreseptorer på overflaten av en T-celle muliggjør rask tilpasning til deres skiftende omgivelser3. Viktigere er at integriner forbinder ECM og intracellulære cytoskjelettaktinnettverk som jobber sammen for å generere drivkraften som kreves for T-cellebevegelse.
Oppsummert varierer migrasjonsmønstre basert på immuncellefenotypen eller miljøsignaler. Disse komplekse biologiske prosessene er tett regulert av ekspresjonen av cytokiner, kjemokiner og integriner på overflaten av T-cellen, omkringliggende celler og det lokale, infiserte vevet. In vivo kan disse migrasjonsmekanismene være komplekse og kan være et resultat av flere additive signaler4. På grunn av denne kompleksiteten kan det være umulig å etablere en årsakssammenheng mellom tilsynelatende sammenlåste variabler. For å overvinne dette er det flere in vitro-tilnærminger for å studere spesifikke aspekter ved T-cellemigrasjon, for eksempel respons på spesifikke kjemokinsignaler og interaksjonen mellom T-celleintegriner og ECM-bindende proteiner. Denne protokollen tar for seg metoder for å isolere og aktivere murine CD8+ T-celler, med in vitro-migrasjonsanalyser i todimensjonalt rom og beregningsanalyseverktøy for å analysere spesifisert T-cellemigrasjon. Disse metodene er fordelaktige for brukeren fordi de ikke krever sofistikerte materialer eller enheter, som med noen andre cellemigrasjonsanalyser beskrevet i litteraturen. Cellemigrasjonsdata generert med disse metodene kan gi bevis på immunresponser på en forenklet måte som muliggjør videre, informert undersøkelse in vivo.
Å forstå den biologiske effekten av konvergerende signaler in vivo er utfordrende og ikke lett å tolke. Protokollene som presenteres her gir en rimelig metode for å forstå T-cellemigrasjon under høyt definerte og biologisk relevante forhold. Disse forholdene kan spesifiseres basert på etterforskerens skjønn, og protokollene kan modifiseres for å passe behovene til ulike T-cellepopulasjoner, aktiveringsstatus og cellefenotype. Videre kan mange ligander og reseptorer avhøres gjennom disse definerte antis…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker tidligere og nåværende medlemmer av Kim Lab som har bidratt til utviklingen av disse protokollene over tid. Representative data ble muliggjort av P01 AI102851/AI/NIAID NIH HHS/USA OG P01 HL018208/HL/NHLBI NIH HHS/USA. Denne publikasjonen ble delvis muliggjort av tilskudd nummer T32 GM135134 fra Institutional Ruth L. Kirschstein National Research Service Award.
10 cm dish | Corning | 353003 | or equivalent |
15 mL conical tube | ThermoFisher | 339650 | or equivalent |
1x DPBS | Gibco | 14190144 | without calcium and without magnesium |
6 well plate non-TC treated | Corning | 3736 | or equivalent |
70 µm cell strainer | FisherScientific | 352350 | or equivalent |
ACK lysing buffer | ThermoFisher | A1049201 | or equivalent |
Allegra 6KR centrifuge | ThermoScientific | sorvall 16R with tx400 3655 rotor and bucket | or equivalent |
Beta mercaptoethanol | Sigma | M3148 | or equivalent |
CellTrace Violet | ThermoFisher | C34571 | Or equivalent |
Centrifuge | ThermoScientific | Sorvall ST 16R | or equivalent |
Collagen (IV) | Corning | 354233 | or equivalent |
DeltaT culture dish .17 mm thick glass clear | Bioptechs | 04200417C | |
Dynabeads Sheep anti-Rat IgG | Invitrogen | 11035 | |
DynaMag 15 Magnet | ThermoFisher Scientific | 12301D | or equivalent |
Easy sep mouse T cell isolation kit | Stem Cell | 19851 | |
FBS | SigmaAldrich | F2442-500ML | or equivalent |
Fibronectin | SigmaAldrich | 10838039001 | or equivalent |
Fiji | http://fiji.sc/ | weblink | |
Filter cubes | Nikon or Olympus | ||
GK1.5 | ATCC | TIB-207 | |
HEPES | ThermoFisher | 15630080 | or equivalent |
HQ CCD camera | CoolSNAP | or equivalent | |
ImageJ | http://imagej.nih.gov/ij/h | weblink | |
ImageJ automatic tracking plug in | http://imagej.net/TrackMate | weblink | |
ImageJ manual tracking plug in | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.html | weblink | |
L-15 | Various | See Materials | Medium Recipe: Leibovitz’s L-15 medium without phenol red (Gibco) supplemented with 1-5 g/L glucose |
Liebovitz's L-15 medium, no phenol red | ThermoFisher | 21083027 | |
Luer Lok disposable syringe | Fisher Scientific | 14-955-459 | or equivalent |
Lymphocyte separation medium | Corning | 25-072-CI | or equivalent |
M5/114 | ATCC | TIB-120 | |
MEM Non-Essential Amino Acids | ThermoFisher | 11140050 | or equivalent |
Microscope heating system | Okolab | okolab.com | Custom designs available |
Millicell EZ slide | Millipore | C86024 | |
Mojosort mouse CD8+ Naïve T cell isolation kit | Biolegend | 480043 | |
Mouse E-cadherin | R&D systems | 8875-EC-050 | or equivalent |
Mouse surgical dissection kit | Fisher Scientific | 13-820-096 | or equivalent |
NIS elements | Nikon | Software | |
non-TC 24wp | Corning | 353047 | or equivalent |
Penicillin-streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | or equivalent |
Protein A | ThermoFisher Scientific | or equivalent | |
R9 | Various | See Materials | Medium Recipe: RPMI 1640x supplemented with 10 % FBS, 1 % antibiotic-antimycotic (Gibco), 20 mM HEPES buffer (Gibco), 1 % MEM Non-Essential Amino Acids (Gibco), 50 μM β-mercaptoethanol (Sigma-Aldrich) |
Recombinant mouse ICAM-1 Fc chimera | R&D systems | 796-IC-050 | or equivalent |
Recombinant Mouse IL2 | Biolegend | 575410 | or equivalent |
RPMI 1640x | ThermoFisher | 11875093 | or equivalent |
T pins | Fisher Scientific | S99385 | or equivalent |
TE2000-U microscope | Nikon | or equivalent | |
Various recombinant mouse chemokine | R&D systems | or equivalent | |
VCAM-1 Fc chimera | R&D systems | 643-VM-050 | or equivalent |
Volocity | PerkinElmer | Software |