Этот протокол описывает все процедуры, от культивирования мезенхимальных стволовых клеток (ADSC) человека, полученных из жировой ткани, и сбора надосадочной жидкости до экстракции внеклеточных везикул (ВВ) с помощью ультрацентрифугирования.
Мезенхимальные стволовые клетки (ADSC) человека, полученные из жировой ткани, могут способствовать регенерации и реконструкции различных тканей и органов. Недавние исследования показывают, что их регенеративная функция может быть связана с межклеточным контактом и клеточными паракринными эффектами. Паракринный эффект является важным способом взаимодействия клеток и передачи информации на короткие расстояния, в которых внеклеточные везикулы (ВВ) играют функциональную роль в качестве носителей. Существует значительный потенциал для ADSC EV в регенеративной медицине. В многочисленных исследованиях сообщалось об эффективности этих методов. В настоящее время описываются различные методы экстракции и изоляции ВВ, основанные на таких принципах, как центрифугирование, осаждение, размер молекул, аффинность и микрофлюидика. Ультрацентрифугирование считается золотым стандартом для изоляции электромобилей. Тем не менее, тщательный протокол, подчеркивающий меры предосторожности во время ультрацентрифугирования, до сих пор отсутствует. В этом исследовании представлена методология и важнейшие этапы, связанные с культивированием ADSC, сбором надосадочной жидкости и ультрацентрифугированием EV. Однако, несмотря на то, что ультрацентрифугирование является экономически эффективным и не требует дополнительной обработки, все же есть некоторые неизбежные недостатки, такие как низкая скорость восстановления и агрегация EV.
Большинство ADSC получают из жировой ткани и, как было продемонстрировано, способствуют регенерации и реконструкции различных тканей и органов, включая миокард, кости и кожу1. Недавние исследования показывают, что регенеративная функция ADSC может быть обусловлена межклеточным контактом и паракринными эффектамиклеток. Паракринный эффект является важным средством взаимодействия клеток и передачи информации на короткие расстояния, и эта функция достигается за счет внеклеточных везикул (ВВ).
ВВ представляют собой двухслойные мембранные структуры, производимые клетками, диаметром от 40 нм до 160 нм (в среднем около 100 нм). Они влияют на различные клеточные функции, такие как выработка цитокинов, пролиферация клеток, апоптоз и метаболизм 3,4. Были проведены многочисленные исследования функций ADSC EVs, включая содействие регенерации костной ткани, регенерации слизистой оболочки полости рта, выживаемость жировой ткани после трансплантации тканей и восстановление кожных ран 5,6,7,8. Огромный потенциал электромобилей ADSC в регенеративной медицине очевиден. Существуют различные методы экстракции и отделения ВВ из надосадочной жидкости, такие как методы, основанные на центрифугировании, осаждении, размере молекул, аффинности и микрофлюидике. Метод ультрацентрифугирования считается золотым стандартом для изоляции электромобилей9. Фундаментальный принцип ультрацентрифугирования для разделения EV основан на том, что частицы в образце имеют различные коэффициенты осаждения, что приводит к их осаждению и агрегации в отдельных разделительных слоях. Тем не менее, подробный протокол, подчеркивающий меры предосторожности во время ультрацентрифугирования, еще не разработан.
Таким образом, в данном исследовании объективно излагаются культура ADSC, сбор надосадочной жидкости и процедуры ультрацентрифугирования ВВ, а также ключевые моменты с логическим потоком информации и четким, формальным языком. Это дает ценный ориентир для будущих экспериментов.
В ходе формального экспериментального процесса несколько моментов имеют решающее значение для достижения наилучших экспериментальных результатов. Исходя из нашего предыдущего опыта, рекомендуется выбирать 3-6 ADSC, так как они обеспечивают наилучшее возможное состояние клеток. До P3 эр?…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была частично поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (82202473).
Acrodisc Needle Filter of Supor Membrane | Acros Organics | 4652 | 0.22 μm |
Basal Medium For Cell Culture | OriCell | BHDM-03011 | |
Fetal Bovine Serum Without EXO + Culture Supplement (For Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells) | OriCell | HUXMD-05002 | |
Inverted Microscope | OLYMPUS | Lx70-S8F2 | |
Low Speed Centrifuge | Anhui USTC Zonkia Scientific Instruments Co.,Ltd. | SC-3612 | |
Normocin | InvivoGen | ant-nr-05 | |
Optima Max-XP Tabletop Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 393315 | |
Penicillin-Streptomycin-Gentamicin Solution (100x) | Solarbio | P1410 |