Summary

Очистка и характеристика внеклеточных везикул из мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани человека

Published: May 03, 2024
doi:

Summary

Этот протокол описывает все процедуры, от культивирования мезенхимальных стволовых клеток (ADSC) человека, полученных из жировой ткани, и сбора надосадочной жидкости до экстракции внеклеточных везикул (ВВ) с помощью ультрацентрифугирования.

Abstract

Мезенхимальные стволовые клетки (ADSC) человека, полученные из жировой ткани, могут способствовать регенерации и реконструкции различных тканей и органов. Недавние исследования показывают, что их регенеративная функция может быть связана с межклеточным контактом и клеточными паракринными эффектами. Паракринный эффект является важным способом взаимодействия клеток и передачи информации на короткие расстояния, в которых внеклеточные везикулы (ВВ) играют функциональную роль в качестве носителей. Существует значительный потенциал для ADSC EV в регенеративной медицине. В многочисленных исследованиях сообщалось об эффективности этих методов. В настоящее время описываются различные методы экстракции и изоляции ВВ, основанные на таких принципах, как центрифугирование, осаждение, размер молекул, аффинность и микрофлюидика. Ультрацентрифугирование считается золотым стандартом для изоляции электромобилей. Тем не менее, тщательный протокол, подчеркивающий меры предосторожности во время ультрацентрифугирования, до сих пор отсутствует. В этом исследовании представлена методология и важнейшие этапы, связанные с культивированием ADSC, сбором надосадочной жидкости и ультрацентрифугированием EV. Однако, несмотря на то, что ультрацентрифугирование является экономически эффективным и не требует дополнительной обработки, все же есть некоторые неизбежные недостатки, такие как низкая скорость восстановления и агрегация EV.

Introduction

Большинство ADSC получают из жировой ткани и, как было продемонстрировано, способствуют регенерации и реконструкции различных тканей и органов, включая миокард, кости и кожу1. Недавние исследования показывают, что регенеративная функция ADSC может быть обусловлена межклеточным контактом и паракринными эффектамиклеток. Паракринный эффект является важным средством взаимодействия клеток и передачи информации на короткие расстояния, и эта функция достигается за счет внеклеточных везикул (ВВ).

ВВ представляют собой двухслойные мембранные структуры, производимые клетками, диаметром от 40 нм до 160 нм (в среднем около 100 нм). Они влияют на различные клеточные функции, такие как выработка цитокинов, пролиферация клеток, апоптоз и метаболизм 3,4. Были проведены многочисленные исследования функций ADSC EVs, включая содействие регенерации костной ткани, регенерации слизистой оболочки полости рта, выживаемость жировой ткани после трансплантации тканей и восстановление кожных ран 5,6,7,8. Огромный потенциал электромобилей ADSC в регенеративной медицине очевиден. Существуют различные методы экстракции и отделения ВВ из надосадочной жидкости, такие как методы, основанные на центрифугировании, осаждении, размере молекул, аффинности и микрофлюидике. Метод ультрацентрифугирования считается золотым стандартом для изоляции электромобилей9. Фундаментальный принцип ультрацентрифугирования для разделения EV основан на том, что частицы в образце имеют различные коэффициенты осаждения, что приводит к их осаждению и агрегации в отдельных разделительных слоях. Тем не менее, подробный протокол, подчеркивающий меры предосторожности во время ультрацентрифугирования, еще не разработан.

Таким образом, в данном исследовании объективно излагаются культура ADSC, сбор надосадочной жидкости и процедуры ультрацентрифугирования ВВ, а также ключевые моменты с логическим потоком информации и четким, формальным языком. Это дает ценный ориентир для будущих экспериментов.

Protocol

Обзор этапов протокола показан на рисунке 1. Подробная информация о реактивах и оборудовании, использованных в исследовании, приведена в Таблице материалов. 1. Подготовка СМИ Готовят питательную среду для АДСК без экзосом, использу…

Representative Results

Во-первых, были охарактеризованы и идентифицированы ADSC, включая их морфологию10 и поверхностные антитела. Исходя из рисунка 2А, видно, что ADSC расположены в форме веретена и образуют вихрь после плотного роста. Культивируемые клетки дифференцировали в адипог?…

Discussion

В ходе формального экспериментального процесса несколько моментов имеют решающее значение для достижения наилучших экспериментальных результатов. Исходя из нашего предыдущего опыта, рекомендуется выбирать 3-6 ADSC, так как они обеспечивают наилучшее возможное состояние клеток. До P3 эр?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была частично поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (82202473).

Materials

Acrodisc Needle Filter of Supor Membrane Acros Organics 4652 0.22 μm
Basal Medium For Cell Culture OriCell BHDM-03011
Fetal Bovine Serum Without EXO + Culture Supplement (For Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells) OriCell HUXMD-05002
Inverted Microscope OLYMPUS Lx70-S8F2
Low Speed Centrifuge Anhui USTC Zonkia Scientific Instruments Co.,Ltd. SC-3612
Normocin InvivoGen ant-nr-05
Optima Max-XP Tabletop Ultracentrifuge Beckman Coulter 393315
Penicillin-Streptomycin-Gentamicin Solution (100x) Solarbio P1410

References

  1. Al-Ghadban, S., Artiles, M., Bunnell, B. A. Adipose stem cells in regenerative medicine: Looking forward. Front Bioeng Biotechnol. 9, 837464 (2021).
  2. Xin, H., Li, Y., Chopp, M. Exosomes/miRNAs as mediating cell-based therapy of stroke. Front Cell Neurosci. 8, 377 (2014).
  3. Li, Q., et al. The tissue origin effect of extracellular vesicles on cartilage and bone regeneration. Acta Biomater. 125, 253-266 (2021).
  4. Gao, X., Salomon, C., Freeman, D. J. Extracellular vesicles from adipose tissue-a potential role in obesity and type 2 diabetes. Front Endocrinol (Lausanne). 8, 202 (2017).
  5. Zheng, Y., et al. Production and biological effects of extracellular vesicles from adipose-derived stem cells were markedly increased by low-intensity ultrasound stimulation for promoting diabetic wound healing). Stem Cell Rev Rep. 19 (3), 784-806 (2023).
  6. Mou, S., et al. Extracellular vesicles from human adipose-derived stem cells for the improvement of angiogenesis and fat-grafting application. Plast Reconstr Surg. 144 (4), 869-880 (2019).
  7. Li, W., et al. Tissue-engineered bone immobilized with human adipose stem cells-derived exosomes promotes bone regeneration. ACS Appl Mater Interfaces. 10 (6), 5240-5254 (2018).
  8. Han, B., et al. Adipose-derived stem cell-derived extracellular vesicles inhibit the fibrosis of fibrotic buccal mucosal fibroblasts via the microRNA-375/foxf1 axis. Stem Cells Int. 2021, 9964159 (2021).
  9. Brezgin, S., et al. Technological aspects of manufacturing and analytical control of biological nanoparticles. Biotechnol Adv. 64, 108122 (2023).
  10. Kim, S. H., et al. Character comparison of abdomen-derived and eyelid-derived mesenchymal stem cells. Cell Prolif. 46 (3), 291-299 (2013).
  11. Gan, L., et al. Exosomes from adipose-derived mesenchymal stem cells improve liver fibrosis by regulating the miR-20a-5p/TGFBR2 axis to affect the p38 MAPK/NF-κB pathway. Cytokine. 172, 156386 (2023).
  12. Jung, M. K., Mun, J. Y. Sample preparation and imaging of exosomes by transmission electron microscopy. J Vis Exp. (131), e56482 (2018).
  13. Han, Y. D., et al. Co-transplantation of exosomes derived from hypoxia-preconditioned adipose mesenchymal stem cells promotes neovascularization and graft survival in fat grafting. Biochem Biophys Res Commun. 497 (1), 305-312 (2018).
  14. Linares, R., Tan, S., Gounou, C., Arraud, N., Brisson, A. R. High-speed centrifugation induces aggregation of extracellular vesicles. J Extracell Vesicles. 4, 29509 (2015).
  15. Lamparski, H. G., et al. Production and characterization of clinical grade exosomes derived from dendritic cells. J Immunol Methods. 270 (2), 211-226 (2002).
  16. Baranyai, T., et al. Isolation of exosomes from blood plasma: Qualitative and quantitative comparison of ultracentrifugation and size exclusion chromatography methods. PLoS One. 10 (12), e0145686 (2015).
  17. Yuan, X., et al. Engineering extracellular vesicles by three-dimensional dynamic culture of human mesenchymal stem cells. J Extracell Vesicles. 11 (6), e12235 (2022).
  18. Eguchi, T., et al. Organoids with cancer stem cell-like properties secrete exosomes and HSP90 in a 3D nanoenvironment. PLoS One. 13 (2), e0191109 (2018).

Play Video

Cite This Article
Wang, Y., Han, Y., Han, Y. Purification and Characterization of Extracellular Vesicles from Human Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells. J. Vis. Exp. (207), e66585, doi:10.3791/66585 (2024).

View Video