Summary

Rekonstituering av den bakterielle glutamatreseptorkanalen ved innkapsling av et cellefritt ekspresjonssystem

Published: March 08, 2024
doi:

Summary

Denne protokollen beskriver den inverterte emulsjonsmetoden som brukes til å innkapsle et cellefritt ekspresjonssystem (CFE) i en gigantisk unilamellær vesikkel (GUV) for undersøkelse av syntese og inkorporering av et modellmembranprotein i lipid-dobbeltlaget.

Abstract

Cellefrie ekspresjonssystemer (CFE) er kraftige verktøy innen syntetisk biologi som tillater biomimikk av cellulære funksjoner som biosensing og energiregenerering i syntetiske celler. Rekonstruksjon av et bredt spekter av cellulære prosesser krever imidlertid vellykket rekonstituering av membranproteiner i membranen til syntetiske celler. Mens ekspresjonen av løselige proteiner vanligvis er vellykket i vanlige CFE-systemer, har rekonstituering av membranproteiner i lipid-dobbeltlag av syntetiske celler vist seg å være utfordrende. Her demonstreres en metode for rekonstituering av et modellmembranprotein, bakteriell glutamatreseptor (GluR0), i gigantiske unilamellære vesikler (GUV) som modellsyntetiske celler basert på innkapsling og inkubasjon av CFE-reaksjonen inne i syntetiske celler. Ved å bruke denne plattformen demonstreres effekten av å substituere det N-terminale signalpeptidet til GluR0 med proteorhodopsin-signalpeptid på vellykket kotranslasjonell translokasjon av GluR0 til membraner av hybride GUV-er. Denne metoden gir en robust prosedyre som vil tillate cellefri rekonstituering av ulike membranproteiner i syntetiske celler.

Introduction

Nedenfra og opp syntetisk biologi har fått økende interesse det siste tiåret som et fremvoksende felt med mange potensielle anvendelser innen bioteknologi, legemiddellevering og regenerativ medisin 1,2. Utviklingen av syntetiske celler som en hjørnestein i syntetisk biologi nedenfra og opp, har spesielt tiltrukket seg et bredt spekter av vitenskapelige miljøer på grunn av de lovende anvendelsene av syntetiske celler, så vel som deres cellelignende fysiske og biokjemiske egenskaper som letter in vitro biofysiske studier 3,4,5,6 . Syntetiske celler er ofte konstruert i cellestore gigantiske unilamellære vesikler (GUV) der forskjellige biologiske prosesser gjenskapes. Rekonstituering av cellecytoskjelett 7,8, lysavhengig energiregenerering9, cellulær kommunikasjon10,11 og biosensing12 er eksempler på innsats som er gjort for å rekonstruere cellelignende atferd i syntetiske celler.

Mens noen cellulære prosesser er avhengige av løselige proteiner, bruker mange egenskaper ved naturlige celler, som sensing og kommunikasjon, ofte membranproteiner, inkludert ionekanaler, reseptorer og transportører. En stor utfordring i syntetisk celleutvikling er rekonstituering av membranproteiner. Selv om tradisjonelle metoder for membranproteinrekonstituering i lipid-dobbeltlag er avhengige av vaskemiddelmediert rensing, er slike metoder arbeidskrevende, ineffektive for proteiner som er giftige for ekspresjonsverten, eller er ofte ikke egnet for membranproteinrekonstituering i GUV-er13.

En alternativ metode for proteinekspresjon er cellefrie ekspresjonssystemer (CFE). CFE-systemer har vært et kraftig verktøy innen syntetisk biologi som tillater in vitro-ekspresjon av ulike proteiner ved bruk av enten cellelysat eller renset transkripsjonstranslasjonsmaskineri14. CFE-systemer kan også innkapsles i GUV-er, og dermed tillate oppdelte proteinsyntesereaksjoner som kan programmeres for ulike applikasjoner, for eksempel å lage lyshøstende syntetiske celler9 eller mekanosensitive biosensorer15,16. Analogt med rekombinante proteinekspresjonsmetoder er membranproteinekspresjon utfordrende i CFE-systemer17. Aggregering, feilfolding og mangel på post-translasjonell modifikasjon i CFE-systemer er store flaskehalser som hindrer vellykket membranproteinsyntese ved bruk av CFE-systemer. Vanskeligheten med rekonstituering av membranprotein nedenfra og opp ved bruk av CFE-systemer skyldes delvis fraværet av en kompleks membranproteinbiogenesevei som er avhengig av signalpeptider, signalgjenkjenningspartikler, translokanser og chaperoning-molekyler. Imidlertid har nylig flere studier antydet at tilstedeværelsen av membranøse strukturer som mikrosomer eller liposomer under translasjon fremmer vellykket membranproteinuttrykk 18,19,20,21. I tillegg Eaglesfield et al. og Steinküher et al. har funnet ut at inkluderingen av spesifikke hydrofobe domener kjent som signalpeptider i N-terminalen til membranproteinet kan forbedre uttrykket betydelig22,23. Til sammen antyder disse studiene at utfordringen med membranproteinrekonstituering i syntetiske celler kan overvinnes hvis proteintranslasjonen skjer i nærvær av GUV-membranen og hvis riktig N-terminalt signalpeptid brukes.

Her presenteres en protokoll for innkapsling av proteinsyntesen ved bruk av rekombinante elementer (PURE) CFE-reaksjoner for membranproteinrekonstituering i GUV-er. Bakteriell glutamatreseptor24 (GluR0) er valgt som modellmembranprotein, og effekten av dets N-terminale signalpeptid på membranrekonstituering studeres. Effekten av proteorhodopsin-signalpeptid, som ble vist å forbedre membranproteinrekonstitusjonseffektiviteten av Eaglesfield et al.22, undersøkes ved å konstruere en mutert variant av GluR0 betegnet som PRSP-GluR0 og dens ekspresjon og membranlokalisering med villtype GluR0 (heretter referert til som WT-GluR0) som inneholder sitt opprinnelige signalpeptid. Denne protokollen er basert på den inverterte emulsjonsmetoden25 med modifikasjoner som gjør den robust for CFE-innkapsling. I den presenterte metoden emulgeres CFE-reaksjonene først ved hjelp av en lipid-i-olje-løsning som genererer dråper på mikronstørrelse som inneholder CFE-systemet og stabiliseres av lipidmonolaget. Emulsjonsdråpene legges deretter på toppen av et olje-vann-grensesnitt som er mettet med et annet lipidmonolag. Emulsjonsdråpene blir deretter tvunget til å bevege seg over olje-vann-grensesnittet via sentrifugalkraft. Gjennom denne prosessen får dråpene et annet monolag, og genererer dermed en tolags lipidvesikkel. GUV-ene som inneholder CFE-reaksjonen blir deretter inkubert, hvor membranproteinet uttrykkes og inkorporeres i GUV-membranen. Selv om denne protokollen er spesifisert for cellefri ekspresjon av GluR0, kan den brukes til cellefri syntese av andre membranproteiner eller forskjellige syntetiske celleapplikasjoner som cytoskjelettrekonstituering eller membranfusjonsstudier26.

Protocol

Reagensene og utstyret som brukes til denne studien er gitt i materialtabellen. 1. Bulk CFE-reaksjoner i nærvær av små unilamellære vesikler (SUV-er) Forberedelse av SUVNOTAT: Dette trinnet må utføres i et avtrekkshette i henhold til sikkerhetsinstruksjonene for arbeid med kloroform.Forbered 5 mM 1-palmitoyl-2-oleoyl-glysero-3-fosfokolin (POPC) SUV-er i et hetteglass ved å overføre 76 μL 25 mg/ml POPC-stamløsning oppløst i klor…

Representative Results

Før innkapsling av CFE-reaksjonene ble to varianter av GluR0-sfGFP med native og proteorhodopsin-signalpeptider (signalpeptidsekvenser er presentert i tilleggstabell 1), og den løselige sfGFP ble individuelt uttrykt i bulkreaksjoner, og deres uttrykk ble overvåket ved å detektere sfGFP-signalet ved hjelp av en plateleser (figur 2A). Membranproteiner ble uttrykt i fravær eller tilstedeværelse av 100 nm SUV-er. I tillegg, ved å bruke en kalibreringskurv…

Discussion

Praktisk talt enhver cellulær prosess som er avhengig av overføring av molekyler eller informasjon over cellemembranen, som cellesignalering eller celleeksitasjon, krever membranproteiner. Dermed har rekonstituering av membranproteiner blitt den viktigste flaskehalsen for å realisere ulike syntetiske celledesign for forskjellige bruksområder. Tradisjonell vaskemiddelmediert rekonstituering av membranproteiner i biologiske membraner krever GUV-genereringsmetoder som skånsom hevelse eller elektroformasjon. Hevelsestil…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

APL anerkjenner støtte fra National Science Foundation (EF1935265), National Institutes of Health (R01-EB030031 og R21-AR080363) og Army Research Office (80523-BB)

Materials

100 nm polycarbonate filter STERLITECH 1270193
96 Well Clear Bottom Plate ThermoFisher Scientific 165305
BioTek Synergy H1M Hybrid Multi-Mode Reader Agilent 11-120-533
Creatine phosphate Millipore Sigma 10621714001
CSU-X1 Confocal Scanner Unit Yokogawa CSU-X1 
Density gradient medium (Optiprep) Millipore Sigma D1556 Optional to switch with sucrose in inner solution
Filter supports Avanti 610014
Fisherbrand microtubes (1.5 mL) Fisher Scientific 05-408-129 
Folinic acid calcium salt hydrate Millipore Sigma F7878
Glucose Millipore Sigma 158968
HEPES Millipore Sigma H3375
iXon X3 camera  Andor DU-897E-CS0 
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate Millipore Sigma G1501
Light mineral oil Millipore Sigma M5904
Magnesium acetate tetrahydrate  Millipore Sigma M5661
Mini-extruder kit (including syringe holder and extruder stand) Avanti 610020
Olympus IX81 Inverted Microscope  Olympus IX21
Olympus PlanApo N 60x Oil Microscope Objective  Olympus 1-U2B933 
PEO-b-PBD Polymer Source P41745-BdEO
pET28b-PRSP-GluR0-sfGFP plasmid DNA Homemade N/A
pET28b-sfGFP-sfCherry(1-10) plasmid DNA Homemade N/A
pET28b-WT-GluR0-sfGFP plasmid DNA Homemade N/A
POPC lipid in chloroform  Avanti 850457C
Potassium chloride Millipore Sigma P9541
PUREfrex 2.0 Cosmo Bio USA GFK-PF201
Ribonucleotide Solution Set New England BioLabs N0450
RNase Inhibitor, Murine New England BioLabs M0314S
RTS Amino Acid Sampler Biotechrabbit BR1401801
Sodium chloride Millipore Sigma S9888
Spermidine Millipore Sigma S2626
Sucrose Millipore Sigma S0389
VAPRO Vapor Pressure Osmometer Model 5600 ELITechGroup VAPRO 5600

References

  1. Liu, A. P., Fletcher, D. A. Biology under construction: In vitro reconstitution of cellular function. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (9), 644-650 (2009).
  2. Lin, A. J., Sihorwala, A. Z., Belardi, B. Engineering tissue-scale properties with synthetic cells: Forging one from many. ACS Synth Biol. 12 (7), 1889-1907 (2023).
  3. Powers, J., Jang, Y. Advancing biomimetic functions of synthetic cells through compartmentalized cell-free protein synthesis. Biomacromolecules. 24 (12), 5539-5550 (2023).
  4. Jiang, W., et al. Artificial cells: Past, present and future. ACS Nano. 16 (10), 15705-15733 (2022).
  5. Groaz, A., et al. Engineering spatiotemporal organization and dynamics in synthetic cells. WIREs Nanomed Nanobiotech. 13 (3), 1685 (2021).
  6. Sharma, B., Moghimianavval, H., Hwang, S. W., Liu, A. P. Synthetic cell as a platform for understanding membrane-membrane interactions. Membranes. 11 (12), 912 (2021).
  7. Bashirzadeh, Y., et al. Actin crosslinker competition and sorting drive emergent GUV size-dependent actin network architecture. Commun Biol. 4 (1), 1-11 (2021).
  8. Bashirzadeh, Y., Moghimianavval, H., Liu, A. P. Encapsulated actomyosin patterns drive cell-like membrane shape changes. iScience. 25 (5), 104236 (2021).
  9. Berhanu, S., Ueda, T., Kuruma, Y. Artificial photosynthetic cell producing energy for protein synthesis. Nat Commun. 10 (1), 1325 (2019).
  10. Ji, Y., Chakraborty, T., Wegner, S. V. Self-regulated and bidirectional communication in synthetic cell communities. ACS Nano. 17 (10), 8992-9002 (2023).
  11. Moghimianavval, H., Loi, K. J., Hwang, S. W., Bashirzadeh, Y., Liu, A. P. Light-based juxtacrine signaling between synthetic cells. bioRxiv. , (2024).
  12. Boyd, M. A., Thavarajah, W., Lucks, J. B., Kamat, N. P. Robust and tunable performance of a cell-free biosensor encapsulated in lipid vesicles. Science Advances. 9 (1), 6605 (2023).
  13. Schneider, B., et al. Membrane Protein expression in cell-free systems. Methods Mol Biol. 601, 165-186 (2010).
  14. Noireaux, V., Liu, A. P. The new age of cell-free biology. Annu Rev Biomed Eng. 22 (1), 51-77 (2020).
  15. Majumder, S., et al. Cell-sized mechanosensitive and biosensing compartment programmed with DNA. Chem. Commun. 53 (53), 7349-7352 (2017).
  16. Poddar, A., et al. Membrane stretching activates calcium permeability of a putative channel Pkd2 during fission yeast cytokinesis. MBoC. 33 (14), (2022).
  17. Sachse, R., Dondapati, S. K., Fenz, S. F., Schmidt, T., Kubick, S. Membrane protein synthesis in cell-free systems: From bio-mimetic systems to bio-membranes. FEBS Letters. 588 (17), 2774-2781 (2014).
  18. Dondapati, S. K., et al. Functional reconstitution of membrane proteins derived from eukaryotic cell-free systems. Front Pharmacol. 10, 917 (2019).
  19. Majumder, S., et al. In vitro synthesis and reconstitution using mammalian cell-free lysates enables the systematic study of the regulation of LINC complex assembly. Biochemistry. 61 (14), 1495-1507 (2022).
  20. Niwa, T., et al. Comprehensive study of liposome-assisted synthesis of membrane proteins using a reconstituted cell-free translation system. Sci Rep. 5 (1), 18025 (2015).
  21. Moghimianavval, H., Hsu, Y. Y., Groaz, A., Liu, A. P. In vitro reconstitution platforms of mammalian cell-free expressed membrane proteinsmembrane proteins. Methods Mol Biol. 2433, 105-120 (2022).
  22. Eaglesfield, R., Madsen, M. A., Sanyal, S., Reboud, J., Amtmann, A. Cotranslational recruitment of ribosomes in protocells recreates a translocon-independent mechanism of proteorhodopsin biogenesis. iScience. 24 (5), 102429 (2021).
  23. Steinküher, J., et al. Improving cell-free expression of membrane proteins by tuning ribosome cotranslational membrane association and nascent chain aggregation. bioRxiv. , (2023).
  24. Chen, G. Q., Cui, C., Mayer, M. L., Gouaux, E. Functional characterization of a potassium-selective prokaryotic glutamate receptor. Nature. 402 (6763), 817-821 (1999).
  25. Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of unilamellar vesicles using an inverted emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
  26. Hsu, Y. Y., et al. Calcium-triggered DNA-mediated membrane fusion in synthetic cells. Chemical Communications. 59 (57), 8806-8809 (2023).
  27. Moghimianavval, H., et al. Engineering functional membrane-membrane interfaces by interspy. Small. 19 (13), 2202104 (2023).
  28. Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. J Vis Exp. (79), e50762 (2013).
  29. Jacobs, M. L., Boyd, M. A., Kamat, N. P. Diblock copolymers enhance folding of a mechanosensitive membrane protein during cell-free expression. PNAS. 116 (10), 4031-4036 (2019).
  30. Kostarelos, K., Tadros, T. F., Luckham, P. F. Physical conjugation of (tri-) block copolymers to liposomes toward the construction of sterically stabilized vesicle systems. Langmuir. 15 (2), 369-376 (1999).
  31. Adir, O., et al. Preparing protein producing synthetic cells using cell free bacterial extracts, liposomes and emulsion transfer. J Vis Exp. (158), e60829 (2020).
  32. van de Cauter, L., van Buren, L., Koenderink, G. H., Ganzinger, K. A. Exploring giant unilamellar vesicle production for artificial cells – current challenges and future directions. Small Methods. 7 (12), 2300416 (2023).
  33. Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: Not just a soap opera. Biochim Biophys Acta Biomembr. 1666 (1), 105-117 (2004).
  34. Guo, Y. Detergent-free systems for structural studies of membrane proteins. Biochem Soc Trans. 49 (3), 1361-1374 (2021).
  35. Bashirzadeh, Y., Wubshet, N., Litschel, T., Schwille, P., Liu, A. P. Rapid encapsulation of reconstituted cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles. J Vis Exp. (177), e63332 (2021).
  36. Hwang, S. W., et al. Hybrid vesicles enable mechano-responsive hydrogel degradation. Angew Chemie Int Ed. 62 (41), e202308509 (2023).
  37. Rideau, E., Dimova, R., Schwille, P., Wurm, F. R., Landfester, K. Liposomes and polymersomes: a comparative review towards cell mimicking. Chem Soc Rev. 47 (23), 8572-8610 (2018).
  38. Tsumoto, K., Hayashi, Y., Tabata, J., Tomita, M. A reverse-phase method revisited: Rapid high-yield preparation of giant unilamellar vesicles (GUVs) using emulsification followed by centrifugation. Colloids Surf A: Physicochem Eng Asp. 546, 74-82 (2018).
  39. Huang, Y. L., Walker, A. S., Miller, E. W. A photostable silicon rhodamine platform for optical voltage sensing. J Am Chem Soc. 137 (33), 10767-10776 (2015).
  40. Bailoni, E., et al. Minimal out-of-equilibrium metabolism for synthetic cells: A membrane perspective. ACS Synth Biol. 12 (4), 922-946 (2023).

Play Video

Cite This Article
Loi, K. J., Moghimianavval, H., Liu, A. P. Reconstitution of the Bacterial Glutamate Receptor Channel by Encapsulation of a Cell-Free Expression System. J. Vis. Exp. (205), e66595, doi:10.3791/66595 (2024).

View Video