Denne protokollen beskriver den inverterte emulsjonsmetoden som brukes til å innkapsle et cellefritt ekspresjonssystem (CFE) i en gigantisk unilamellær vesikkel (GUV) for undersøkelse av syntese og inkorporering av et modellmembranprotein i lipid-dobbeltlaget.
Cellefrie ekspresjonssystemer (CFE) er kraftige verktøy innen syntetisk biologi som tillater biomimikk av cellulære funksjoner som biosensing og energiregenerering i syntetiske celler. Rekonstruksjon av et bredt spekter av cellulære prosesser krever imidlertid vellykket rekonstituering av membranproteiner i membranen til syntetiske celler. Mens ekspresjonen av løselige proteiner vanligvis er vellykket i vanlige CFE-systemer, har rekonstituering av membranproteiner i lipid-dobbeltlag av syntetiske celler vist seg å være utfordrende. Her demonstreres en metode for rekonstituering av et modellmembranprotein, bakteriell glutamatreseptor (GluR0), i gigantiske unilamellære vesikler (GUV) som modellsyntetiske celler basert på innkapsling og inkubasjon av CFE-reaksjonen inne i syntetiske celler. Ved å bruke denne plattformen demonstreres effekten av å substituere det N-terminale signalpeptidet til GluR0 med proteorhodopsin-signalpeptid på vellykket kotranslasjonell translokasjon av GluR0 til membraner av hybride GUV-er. Denne metoden gir en robust prosedyre som vil tillate cellefri rekonstituering av ulike membranproteiner i syntetiske celler.
Nedenfra og opp syntetisk biologi har fått økende interesse det siste tiåret som et fremvoksende felt med mange potensielle anvendelser innen bioteknologi, legemiddellevering og regenerativ medisin 1,2. Utviklingen av syntetiske celler som en hjørnestein i syntetisk biologi nedenfra og opp, har spesielt tiltrukket seg et bredt spekter av vitenskapelige miljøer på grunn av de lovende anvendelsene av syntetiske celler, så vel som deres cellelignende fysiske og biokjemiske egenskaper som letter in vitro biofysiske studier 3,4,5,6 . Syntetiske celler er ofte konstruert i cellestore gigantiske unilamellære vesikler (GUV) der forskjellige biologiske prosesser gjenskapes. Rekonstituering av cellecytoskjelett 7,8, lysavhengig energiregenerering9, cellulær kommunikasjon10,11 og biosensing12 er eksempler på innsats som er gjort for å rekonstruere cellelignende atferd i syntetiske celler.
Mens noen cellulære prosesser er avhengige av løselige proteiner, bruker mange egenskaper ved naturlige celler, som sensing og kommunikasjon, ofte membranproteiner, inkludert ionekanaler, reseptorer og transportører. En stor utfordring i syntetisk celleutvikling er rekonstituering av membranproteiner. Selv om tradisjonelle metoder for membranproteinrekonstituering i lipid-dobbeltlag er avhengige av vaskemiddelmediert rensing, er slike metoder arbeidskrevende, ineffektive for proteiner som er giftige for ekspresjonsverten, eller er ofte ikke egnet for membranproteinrekonstituering i GUV-er13.
En alternativ metode for proteinekspresjon er cellefrie ekspresjonssystemer (CFE). CFE-systemer har vært et kraftig verktøy innen syntetisk biologi som tillater in vitro-ekspresjon av ulike proteiner ved bruk av enten cellelysat eller renset transkripsjonstranslasjonsmaskineri14. CFE-systemer kan også innkapsles i GUV-er, og dermed tillate oppdelte proteinsyntesereaksjoner som kan programmeres for ulike applikasjoner, for eksempel å lage lyshøstende syntetiske celler9 eller mekanosensitive biosensorer15,16. Analogt med rekombinante proteinekspresjonsmetoder er membranproteinekspresjon utfordrende i CFE-systemer17. Aggregering, feilfolding og mangel på post-translasjonell modifikasjon i CFE-systemer er store flaskehalser som hindrer vellykket membranproteinsyntese ved bruk av CFE-systemer. Vanskeligheten med rekonstituering av membranprotein nedenfra og opp ved bruk av CFE-systemer skyldes delvis fraværet av en kompleks membranproteinbiogenesevei som er avhengig av signalpeptider, signalgjenkjenningspartikler, translokanser og chaperoning-molekyler. Imidlertid har nylig flere studier antydet at tilstedeværelsen av membranøse strukturer som mikrosomer eller liposomer under translasjon fremmer vellykket membranproteinuttrykk 18,19,20,21. I tillegg Eaglesfield et al. og Steinküher et al. har funnet ut at inkluderingen av spesifikke hydrofobe domener kjent som signalpeptider i N-terminalen til membranproteinet kan forbedre uttrykket betydelig22,23. Til sammen antyder disse studiene at utfordringen med membranproteinrekonstituering i syntetiske celler kan overvinnes hvis proteintranslasjonen skjer i nærvær av GUV-membranen og hvis riktig N-terminalt signalpeptid brukes.
Her presenteres en protokoll for innkapsling av proteinsyntesen ved bruk av rekombinante elementer (PURE) CFE-reaksjoner for membranproteinrekonstituering i GUV-er. Bakteriell glutamatreseptor24 (GluR0) er valgt som modellmembranprotein, og effekten av dets N-terminale signalpeptid på membranrekonstituering studeres. Effekten av proteorhodopsin-signalpeptid, som ble vist å forbedre membranproteinrekonstitusjonseffektiviteten av Eaglesfield et al.22, undersøkes ved å konstruere en mutert variant av GluR0 betegnet som PRSP-GluR0 og dens ekspresjon og membranlokalisering med villtype GluR0 (heretter referert til som WT-GluR0) som inneholder sitt opprinnelige signalpeptid. Denne protokollen er basert på den inverterte emulsjonsmetoden25 med modifikasjoner som gjør den robust for CFE-innkapsling. I den presenterte metoden emulgeres CFE-reaksjonene først ved hjelp av en lipid-i-olje-løsning som genererer dråper på mikronstørrelse som inneholder CFE-systemet og stabiliseres av lipidmonolaget. Emulsjonsdråpene legges deretter på toppen av et olje-vann-grensesnitt som er mettet med et annet lipidmonolag. Emulsjonsdråpene blir deretter tvunget til å bevege seg over olje-vann-grensesnittet via sentrifugalkraft. Gjennom denne prosessen får dråpene et annet monolag, og genererer dermed en tolags lipidvesikkel. GUV-ene som inneholder CFE-reaksjonen blir deretter inkubert, hvor membranproteinet uttrykkes og inkorporeres i GUV-membranen. Selv om denne protokollen er spesifisert for cellefri ekspresjon av GluR0, kan den brukes til cellefri syntese av andre membranproteiner eller forskjellige syntetiske celleapplikasjoner som cytoskjelettrekonstituering eller membranfusjonsstudier26.
Praktisk talt enhver cellulær prosess som er avhengig av overføring av molekyler eller informasjon over cellemembranen, som cellesignalering eller celleeksitasjon, krever membranproteiner. Dermed har rekonstituering av membranproteiner blitt den viktigste flaskehalsen for å realisere ulike syntetiske celledesign for forskjellige bruksområder. Tradisjonell vaskemiddelmediert rekonstituering av membranproteiner i biologiske membraner krever GUV-genereringsmetoder som skånsom hevelse eller elektroformasjon. Hevelsestil…
The authors have nothing to disclose.
APL anerkjenner støtte fra National Science Foundation (EF1935265), National Institutes of Health (R01-EB030031 og R21-AR080363) og Army Research Office (80523-BB)
100 nm polycarbonate filter | STERLITECH | 1270193 | |
96 Well Clear Bottom Plate | ThermoFisher Scientific | 165305 | |
BioTek Synergy H1M Hybrid Multi-Mode Reader | Agilent | 11-120-533 | |
Creatine phosphate | Millipore Sigma | 10621714001 | |
CSU-X1 Confocal Scanner Unit | Yokogawa | CSU-X1 | |
Density gradient medium (Optiprep) | Millipore Sigma | D1556 | Optional to switch with sucrose in inner solution |
Filter supports | Avanti | 610014 | |
Fisherbrand microtubes (1.5 mL) | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
Folinic acid calcium salt hydrate | Millipore Sigma | F7878 | |
Glucose | Millipore Sigma | 158968 | |
HEPES | Millipore Sigma | H3375 | |
iXon X3 camera | Andor | DU-897E-CS0 | |
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate | Millipore Sigma | G1501 | |
Light mineral oil | Millipore Sigma | M5904 | |
Magnesium acetate tetrahydrate | Millipore Sigma | M5661 | |
Mini-extruder kit (including syringe holder and extruder stand) | Avanti | 610020 | |
Olympus IX81 Inverted Microscope | Olympus | IX21 | |
Olympus PlanApo N 60x Oil Microscope Objective | Olympus | 1-U2B933 | |
PEO-b-PBD | Polymer Source | P41745-BdEO | |
pET28b-PRSP-GluR0-sfGFP plasmid DNA | Homemade | N/A | |
pET28b-sfGFP-sfCherry(1-10) plasmid DNA | Homemade | N/A | |
pET28b-WT-GluR0-sfGFP plasmid DNA | Homemade | N/A | |
POPC lipid in chloroform | Avanti | 850457C | |
Potassium chloride | Millipore Sigma | P9541 | |
PUREfrex 2.0 | Cosmo Bio USA | GFK-PF201 | |
Ribonucleotide Solution Set | New England BioLabs | N0450 | |
RNase Inhibitor, Murine | New England BioLabs | M0314S | |
RTS Amino Acid Sampler | Biotechrabbit | BR1401801 | |
Sodium chloride | Millipore Sigma | S9888 | |
Spermidine | Millipore Sigma | S2626 | |
Sucrose | Millipore Sigma | S0389 | |
VAPRO Vapor Pressure Osmometer Model 5600 | ELITechGroup | VAPRO 5600 |