Summary

Antimikrobiyal Direnci İncelemek İçin Bir Model Olarak Mikobakteriyel Biyofilm Yetiştirme

Published: July 12, 2024
doi:

Summary

Bu protokol, pelikül biyofilmi geliştirmek için sağlam bir yöntemi tanımlar. Yöntem, farklı kültür hacimlerine ölçeklenebilir ve çeşitli deneysel hedefler için kolay benimseme sağlar. Yöntemin tasarımı, çeşitli mikobakteri türlerinin biyofilm oluşturma potansiyelinin kalitatif veya kantitatif olarak değerlendirilmesini sağlar.

Abstract

Birçok bakteri, karmaşık doğal topluluklarda gelişir ve iletişim, işbirliği ve rekabet gibi çok hücreliliğin temel özelliklerini sergiler. Bakteriyel çok hücreli davranışın en yaygın tezahürü, genellikle patojenite ile bağlantılı olan biyofilmlerin oluşumudur. Biyofilmler, antimikrobiyal ajanlara karşı bir sığınak sunarak antimikrobiyal direncin ortaya çıkmasını teşvik eder. Çalkalama şişesi sıvı kültürlerinde bakteri yetiştirmenin geleneksel uygulaması, doğadaki uygun fizyolojik büyümelerini temsil etmekte başarısız olur ve sonuç olarak karmaşık dinamiklerini anlamamızı sınırlar. Özellikle, biyofilmlerde bulunan bakterilerin metabolik ve transkripsiyonel profilleri, doğal olarak büyüyen hücrelerinkine çok benzer. Bu paralellik, biyofilmlerin temel ve translasyonel araştırmalar için ideal bir model olarak önemini vurgulamaktadır. Bu makale, pelikül biyofilmlerinin yetiştirilmesi için bir tekniği göstermek için Mycobacterium smegmatis’in bir model organizma olarak kullanılmasına odaklanmaktadır. Yaklaşım, çeşitli kültür hacimlerine uyarlanabilir ve antimikrobiyal çalışmalar gibi çeşitli deneysel hedefler için uygulanmasını kolaylaştırır. Ayrıca, yöntemin tasarımı, farklı mikobakteri türlerinin biyofilm oluşturma yeteneklerinin küçük ayarlamalarla kalitatif veya kantitatif olarak değerlendirilmesini sağlar.

Introduction

Bakteriler tek hücreli varlıklar olarak hayatta kalabilirler; Bununla birlikte, fizyolojik olarak ilgili koşulların çoğunda, topluluk taklitçilerine dönüşürler. Biyofilm, kendi kendine üretilen bir matris1 içinde kaplanmış kümelenmiş hücreler tarafından oluşturulan, yaygın olarak tanınan bir bakteri topluluğu organizasyonudur. Bu tür bir montaj, erken çok hücrelilik imzalarına sahiptir ve bakteri sistemlerine daha yüksek stres direnci sağlar. Biyofilmler genellikle antimikrobiyallere toleranslıdır ve mikrobiyal enfeksiyonların neredeyse %80’inden sorumlu olduğu tahmin edilmektedir 2,3.

Çalkalama şişesi ve plaka bazlı kültürler geleneksel olarak bakteri kültürü için olağan uygulamalar olmuştur. Muazzam kabul edilebilirlikleri ve başarıları, kullanım kolaylığına, tekrarlanabilirliğine ve ölçeklenebilirliğine bağlanabilir. Bununla birlikte, fizyolojik bağlam eksikliği, bu tür sistemler kullanılarak üretilen bilginin çeviri potansiyelini sınırlar4. Bu nedenle, biyofilmler bakteri patofizyolojisini incelemek için çekici bir model sistem haline gelmektedir. Biyofilmler, doğal koşulları yakından yansıtan dinamik bir model sistemi sağlar ve araştırmacıların besin gradyanları ve mekansal heterojenlik gibi fizyolojik yönleri çoğaltmasına olanak tanır 5,6.

Biyofilm yaşam tarzı, kötü şöhretli Mycobacterium tuberculosis de dahil olmak üzere mikobakteriler usta biyofilm oluşturucular olduğundan, mikobakteriyel çalışmalarda özellikle önemlidir7. Biyofilmler içinde gelişme yetenekleri, enfeksiyonlar sırasında konakçı dokularda kalıcılıklarına katkıda bulunur. Biyofilm yaşam tarzlarıyla ilişkili doğal antibiyotik direnci göz önüne alındığında, mikobakteriyel hastalıkların tedavisinde zorlu bir zorluk teşkil etmektedir8. Biyofilmler ayrıca, karmaşık mikrobiyal topluluklar içinde mikobakteriler tarafından kullanılan benzersiz metabolik adaptasyonların ve besin kullanım stratejilerinin araştırılmasına izin verdikleri için mikobakteriyel metabolizmayı incelemek için ideal bir model sistem sağlarlar9.

Biyofilm, mikobakteriyel çalışmalariçin daha iyi bir model sistem olarak giderek daha fazla kabul edilirken10, özellikle farklı laboratuvarlarda yürütülen çalışmalar arasında paralellikler çizmek için tutarlı ve tekrarlanabilir standart işletim prosedürlerine ihtiyaç vardır. Burada özetlenen yöntem, bir mikobakteriyel tür olan M. smegmatis için biyofilm oluşturma prosedürlerini açıklar. M. smegmatis , patojenite olmaması ve daha hızlı biyofilm oluşum kinetiği göz önüne alındığında, mikobakteriyel biyofilmleri incelemek için daha erişilebilir bir modeldir. Yöntem, antimikobakteriyel tarama, metabolit ekstraksiyonu ve omik çalışmaları gibi uygulamalara uyacak şekilde değiştirilebilir.

Protocol

Çalışma için kullanılan tüm reaktiflerin ve ekipmanların detayları Malzeme Tablosunda listelenmiştir. 1. Sauton’un medya hazırlığı 1.25 g potasyum dihidrojen fosfatı dikkatlice tartarak ve 50 mL deiyonize su içinde çözerek 50 mL %2.5 potasyum dihidrojen fosfat çözeltisi hazırlayın. 2.56 g magnezyum sülfatı tartarak ve 50 mL deiyonize suda çözerek 50 mL% 2.5 magnezyum sülfat çözel…

Representative Results

Biyofilm pelikülleri üçüncü günden itibaren çıplak gözle görülebilir hale gelir. Biyofilm, Soton’un ortamında% 2 glikoz olmadan büyümesine rağmen, eklendiğinde retikülasyonda bir iyileşme gözlendi. Dört gün boyunca büyütülen 1.5 mL Soton’un ortamı (% 2 glikoz ile desteklenmiş) ile 24 oyuklu bir plakanın her bir oyuğundan 10.48 mg ± 3.13 mg (n = 4) biyofilm kuru ağırlığı elde ettik. Şekil 2’de, biyofilm gelişimi 3. günden …

Discussion

Mikropların çok hücreli yaşam tarzı neredeyse bir asır önce tanımlandı; Bununla birlikte, çoğunlukla sağlam yöntemlerin olmaması nedeniyle klinik çalışmalar seyrek kalmaktadır14. Biyofilm biyolojisi ile ilgili çalışmalarda açıklanan yöntemlerin uyarlanması genellikle zordur. Burada, kritik adımların gösterilmesiyle desteklenen ayrıntılı metodolojinin, protokollerin tekrarlanabilirliğini iyileştirmesi beklenmektedir.

<p class="j…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma, Amitesh Anand’a verilen DBT-Ramalingaswami Bursu tarafından desteklenmiştir.

Materials

0.2 µM PVDF syringe filter Axiva SFNY04 R
1 mL tips Genetix GXM-611000 C
10 µL tips Genetix GXM-6110 C
200 µL tips Genetix GXM-61200C
6-well polypropylene plates Tarsons 980010
Amber tubes Tarsons 546051
Autoclave Hospharma
Biosafety Cabinet A II MSET
Blotting paper Any suitable vendor
Centrifuge Eppendorf
Citric acid Sigma 251275
Cuvettes Bio-Rad 2239955
Ferric ammonium citrate Sigma F5879
Gel documentation system Bio-Rad
Glass Beads Sigma G8772
Glucose Sigma 49139
Glycerol Sigma G5516
Inoculation loops Genaxy HS81121C
L-Aspargine Sigma A0884
LB-agar Himedia M1151
LB-media Himedia M575
M. smegmatis mc2155 cryo-stock ATCC 700084
Magnesium sulfate Sigma M2643
Micropipettes Gilson
Parafilm Tarsons
Petri Dish Tarsons 460020
pH meter Labman Scientific Instruments
Plate Reader Tecan
Polypropylene test tubes Genaxy GEN-14100-PS
Potassium phosphate monobasic Sigma P5379
Rifampicin MedchemExpress HY-B0272
Serological pipette SPL Life Sciences 95210
Shaker Incubator Eppendorf
Spatula
Spectrophotometer Thermo Scientific
Static Incubator CARON
Sterile 10 mL syringe Becton Dickinson 309642
Sterile 50 mL syringe Becton Dickinson 309653
Tween-80 Sigma P1754
Weighing balance Sartorius
Zinc sulfate Sigma Z0251

References

  1. Davey, M. E., O’toole, G. A. Microbial biofilms: From ecology to molecular genetics. Microbiol Mol Biol Rev. 64 (4), 847-867 (2000).
  2. Rumbaugh, K. P., Sauer, K. Biofilm dispersion. Nat Rev Microbiol. 18 (10), 571-586 (2020).
  3. Davies, D. Understanding biofilm resistance to antibacterial agents. Nat Rev Drug Discov. 2 (2), 114-122 (2003).
  4. Hernández-Jiménez, E., et al. Biofilm vs. planktonic bacterial mode of growth: Which do human macrophages prefer. Biochem Biophys Res Commun. 441 (4), 947-952 (2013).
  5. Nadell, C. D., Drescher, K., Foster, K. R. Spatial structure, cooperation and competition in biofilms. Nat Rev Microbiol. 14 (9), 589-600 (2016).
  6. Jo, J., Price-Whelan, A., Dietrich, L. E. P. Gradients and consequences of heterogeneity in biofilms. Nat Rev Microbiol. 20 (10), 593-607 (2022).
  7. Keating, T., et al. Mycobacterium tuberculosis modifies cell wall carbohydrates during biofilm growth with a concomitant reduction in complement activation. Cell Surf. 7, 100065 (2021).
  8. Ojha, A. K., et al. Growth of Mycobacterium tuberculosis biofilms containing free mycolic acids and harbouring drug-tolerant bacteria. Mol Microbiol. 69 (1), 164-174 (2008).
  9. Dietrich, L. E. P., et al. Bacterial community morphogenesis is intimately linked to the intracellular redox state. J Bacteriol. 195 (7), 1371-1380 (2013).
  10. Kulka, K., Hatfull, G., Ojha, A. K. Growth of Mycobacterium tuberculosis biofilms. J Vis Exp. 60, e3820 (2012).
  11. Wiegand, I., Hilpert, K., Hancock, R. E. W. Agar and broth dilution methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances. Nat Protoc. 3 (2), 163-175 (2008).
  12. Anand, A., et al. Polyketide quinones are alternate intermediate electron carriers during mycobacterial respiration in oxygen-deficient niches. Mol Cell. 60 (4), 637-650 (2015).
  13. . Growth Curves: Generating Growth Curves Using Colony Forming Units and Optical Density Measurements Available from: https://www.jove.com/v/10511/growth-curves-cfu-and-optical-density-measurements (2019)
  14. Høiby, N. A personal history of research on microbial biofilms and biofilm infections. Pathog Dis. 70 (3), 205-211 (2014).
  15. Rajewska, M., Maciąg, T., Jafra, S. Carbon source and surface type influence the early-stage biofilm formation by rhizosphere bacterium Pseudomonas donghuensis P482. bioRxiv. , (2023).
  16. O’Toole, G. A. Microtiter dish biofilm formation assay. J Vis exp. 47, e2437 (2011).
  17. Chakraborty, P., Bajeli, S., Kaushal, D., Radotra, B. D., Kumar, A. Biofilm formation in the lung contributes to virulence and drug tolerance of Mycobacterium tuberculosis. Nat Comm. 12 (1), 1606 (2021).

Play Video

Cite This Article
Poddar, K., Anand, A. Growing Mycobacterial Biofilm as a Model to Study Antimicrobial Resistance. J. Vis. Exp. (209), e66607, doi:10.3791/66607 (2024).

View Video