Neonatal benmärgsisolering hos mus och förberedelse av makrofager härledda från benmärg
Summary
Detta protokoll beskriver en icke-enzymatisk och okomplicerad metod för att isolera 7-9 dagar gamla neonatala benmärgsceller från möss och generera differentierade makrofager med hjälp av en supernatant av L929-celler som en källa till granulocytkolonistimulerande faktor (M-CSF). De benmärgshärledda makrofagerna analyserades vidare med avseende på ytantigener F4/80, CD206, CD11b och funktionell kompetens.
Abstract
Olika tekniker för att isolera benmärg från vuxna möss är väl etablerade. Att isolera benmärg från neonatala möss är dock utmanande och tidskrävande, men för vissa modeller är det translationellt relevant och nödvändigt. Detta protokoll beskriver en effektiv och okomplicerad metod för att framställa benmärgsceller från 7-9 dagar gamla ungar. Dessa celler kan sedan isoleras ytterligare eller differentieras till specifika celltyper av intresse. Makrofager är viktiga immunceller som spelar en viktig roll vid inflammation och infektion. Under utvecklingen bidrar neonatala makrofager i hög grad till vävnadsremodellering. Dessutom skiljer sig fenotypen och funktionerna hos neonatala makrofager från deras vuxna motsvarigheter. Detta protokoll beskriver också differentieringen av neonatala makrofager från de isolerade benmärgscellerna i närvaro av L929-konditionerat medium. Ytmarkörer för differentierade neonatala makrofager utvärderades med hjälp av flödescytometrisk analys. För att demonstrera funktionaliteten testades även den fagocytiska effektiviteten med hjälp av pH-känsliga färgämneskonjugerade Escherichia coli.
Introduction
Benmärg omsluter både hematopoetiska och mesenkymala stamcellspopulationer som är självförnyande och kan differentieras till olika cellinjer. Hematopoetiska stamceller i benmärgen ger upphov till myeloida och lymfoida linjer1. Mesenkymala stamceller producerar osteoblaster (ben), adipocyter (fett) eller kondrocyter (brosk)2. Dessa celler har flera tillämpningar inom cellbiologi och vävnadsteknik, inklusive genterapi 3,4. Stamceller som finns i benmärgen differentieras till specifika celltyper i närvaro av linjespecifika tillväxtfaktorer. Erytropoietin främjar proliferationen av erytroida stamceller, granulocytkolonistimulerande faktor (G-CSF) stimulerar tillväxten av neutrofila kolonier och trombopoietin reglerar produktionen av blodplättar som några exempel på härstamningsspecifika tillväxtfaktorer5. Celyteantigen märkt FACS och magnetiskt aktiverad cellsortering (MACS) är väletablerade metoder för isolering och rening av de specifika benmärgshärledda celltyperna6.
Även om neonatalstudier går framåt mot att hitta orsakerna till neonatala dödsfall och ta itu med komplikationerna under för tidiga födslar, är direkt terapeutisk utveckling fortfarande ett ouppfyllt medicinskt behov. Smith och Davis konstaterade: “Pediatriska patienter förblir terapeutiskt föräldralösa”7. Det finns flera utmaningar, såsom små prover, livslånga effekter av utfallet och etiska problem med att inhämta samtycke i kliniska studier av nyfödda8. Därför finns det en stor efterfrågan på in vivo och in vitro studiemodeller som är specifika för nyfödda för att uppnå translationell relevans. På grund av likheterna mellan anatomiska nivåer och vävnadsnivåer, korta dräktighetsperioder och kullstorlekar är gnagare det mest studerade modellsystemet för däggdjur.
Här beskriver vi en detaljerad, mycket genomförbar och reproducerbar procedur för att isolera benmärg från 7-9 dagar gamla musungar och deras förmåga att differentiera till makrofager. En mängd olika cellinjer kan dock uppnås med hjälp av distinkta differentieringssignaler. Vi visar också närvaron av cellytemarkörer och närvaron av in vitro fagocytisk aktivitet som förväntas för benmärgsderiverade makrofager (BMDM).
Protocol
Representative Results
Discussion
Forskning med neonatala musmodeller kan innebära en rad utmaningar. Nyfödda har ett immunförsvar under utveckling som är unikt jämfört med vuxna8. Data som genereras från vuxna djurmodeller bör därför inte antas gälla för nyfödda, och flera publicerade arbeten har formulerat denna idé väl18,19. Därför är neonatalspecifika modeller och källor till celler nödvändiga för att studera komplexiteten i immunsvaret tidigt i l…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av National Institutes of Health [R01 AI163333] till CMR. Vi erkänner ytterligare finansieringsstöd som ges till West Virginia University Flow Cytometry and Single Cell Core Facility genom följande anslag: WV CTSI-anslag GM104942, Tumor Microenvironment CoBRE-anslag GM121322 och NIH-anslag OD016165.
Materials
| 40 µm strainer | Greiner | 542040 | Cell culture |
| 96 well round (U) bottom plate | Thermo Scientific | 12-565-65 | Cell culture |
| Anti-mouse CD11b-BV786 | BD Biosciences | 740861 | FACS analysis |
| Anti-mouse CD206-Alexa Fluor488 | BD Biosciences | 141709 | FACS analysis |
| Anti-mouse F4/80-PE | BD Biosciences | 565410 | FACS analysis |
| Countess3 | Thermo Scientific | TSI-C3ACC | Automated cell counter |
| DMEM | Hyclone | SH30022.01 | Cell culture |
| DMSO | VWR | WN182 | Cell culture |
| DPBS, 1x | Corning | 21-031-CV | Cell culture |
| Escherichia coli O1:K1:H7 | ATCC | 11775 | Infection |
| EVOS FL | Invitrogen | 12-563-649 | Cell Imaging System |
| FBS | Avantor | 76419-584 | Cell culture |
| FluoroBright BMDM | Thermo fisher Scientific | A1896701 | Dye free culture media |
| Glutamine | Cytiva | SH30034.01 | Cell culture |
| HEPES | Cytiva | SH30237.01 | Cell culture |
| L-929 | ATCC | Differentiation | |
| LSRFortessa | Becton Dickinson | Flowcytometer | |
| Lysotracker red DND 99 | Invitrogen | L7528 | Fluorescent dye |
| MEM | Corning | 15-010-CV | Cell culture |
| Penicillin /streptomycin | Hyclone | SV30010 | Cell culture |
| pHrodo green STP ester | Invitrogen | P35369 | Fluorescent dye |
| T75 flask | Cell star | 658170 | Cell culture |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300120 | Cell culture |
| Zeiss 710 | Zeiss | P20GM103434 | Confocal |
References
- Lucas, D. Structural organization of the bone marrow and its role in hematopoiesis. Curr Opin Hematol. 28 (1), 36-42 (2021).
- Deb, A. How stem cells turn into bone and fat. N Engl J Med. 380 (23), 2268-2270 (2019).
- Lin, H., Sohn, J., Shen, H., Langhans, M. T., Tuan, R. S. Bone marrow mesenchymal stem cells: Aging and tissue engineering applications to enhance bone healing. Biomaterials. 203, 96-110 (2019).
- Soleimani, M., Nadri, S. A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow. Nat Protoc. 4 (1), 102-106 (2009).
- Kaushansky, K. Lineage-specific hematopoietic growth factors. N Engl J Med. 354 (19), 2034-2045 (2006).
- Huang, S., et al. An improved protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow. J Orthop Translat. 3 (1), 26-33 (2015).
- Smith, A. M., Davis, J. M. Challenges and opportunities to enhance global drug development in neonates. Curr Opin Pediatr. 29 (2), 149-152 (2017).
- Lagler, F. B., Hirschfeld, S., Kindblom, J. M. Challenges in clinical trials for children and young people. Arch Dis Child. 106 (4), 321-325 (2021).
- Heap, R. E., et al. Proteomics characterization of the L929 cell supernatant and its role in BMDM differentiation. Life Sci Alliance. 4 (6), 202000957 (2021).
- Weischenfeldt, J., Bone Porse, B. marrow-derived macrophages (BMM): Isolation and Applications. CSH Protoc. 2008, (2008).
- Goncalves, R., Kaliff Teofilo Murta, G., Aparecidade de Souza, I., Mosser, D. M. Isolation and culture of bone marrow-derived macrophages from mice. J Vis Exp. (196), e64566 (2023).
- Perfetto, S. P., et al. Amine reactive dyes: An effective tool to discriminate live and dead cells in polychromatic flow cytometry. J Immunol Methods. 313 (1-2), 199-208 (2006).
- Springer, T., Galfre, G., Secher, D. S., Milstein, C. Mac-1: A macrophage differentiation antigen identified by monoclonal antibody. Eur J Immunol. 9 (4), 301-306 (1979).
- Austyn, J. M., Gordon, S. F4/80, a monoclonal antibody directed specifically against the mouse macrophage. Eur J Immunol. 11 (10), 805-815 (1981).
- Akbarshahi, H., Menzel, M., Posaric Bauden, M., Rosendahl, A., Andersson, R. Enrichment of murine CD68+ CCR2+ and CD68+ CD206+ lung macrophages in acute pancreatitis-associated acute lung injury. PLoS One. 7 (10), e42654 (2012).
- Yao, Y., Xu, X. H., Jin, L. Macrophage polarization in physiological and pathological pregnancy. Front Immunol. 10, 792 (2019).
- Lu, L., et al. Differential expression of CD11c defines two types of tissue-resident macrophages with different origins in steady-state salivary glands. Sci Rep. 12 (1), 931 (2022).
- Harbeson, D., Ben-Othman, R., Amenyogbe, N., Kollmann, T. R. Outgrowing the immaturity myth: The cost of defending from neonatal infectious disease. Front Immunol. 9, 1077 (2018).
- Kollmann, T. R., Kampmann, B., Mazmanian, S. K., Marchant, A., Levy, O. Protecting the newborn and young infant from infectious diseases: Lessons from immune ontogeny. Immunity. 46 (3), 350-363 (2017).
- Loopmans, S., Stockmans, I., Carmeliet, G., Stegen, S. Isolation and in vitro characterization of murine young-adult long bone skeletal progenitors. Front Endocrinol (Lausanne). 13, 930358 (2022).
- Winterberg, T., et al. Distinct phenotypic features of neonatal murine macrophages). Eur J Immunol. 45 (1), 214-224 (2015).
- de Brito Monteiro, L., et al. M-CSF- and L929-derived macrophages present distinct metabolic profiles with similar inflammatory outcomes. Immunobiology. 225 (3), 151935 (2020).
