Summary

Dreidimensionale Zellkultur von aus Fett gewonnenen Stammzellen in einem Hydrogel mit Photobiomodulationsaugmentation

Published: April 05, 2024
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Summary

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das die Verwendung von Hydrogel als dreidimensionales (3D) Zellkulturgerüst für die ADSC-Kultur (Adipose-Derived Stem Cells) demonstriert und Photobiomodulation (PBM) einführt, um die Proliferation von ADSCs innerhalb der 3D-Kulturumgebung zu verbessern.

Abstract

Aus Fettgewebe gewonnene Stammzellen (ADSCs), die multipotente mesenchymale Eigenschaften ähnlich wie Stammzellen besitzen, werden häufig in der regenerativen Medizin eingesetzt, da sie eine Vielzahl von Zelldifferenzierungen ermöglichen und die Migration und Proliferation verbessern und Entzündungen lindern können. ADSCs stehen jedoch oft vor Herausforderungen beim Überleben und der Transplantation in Wunden, vor allem aufgrund ungünstiger entzündlicher Bedingungen. Um dieses Problem anzugehen, wurden Hydrogele entwickelt, um die Lebensfähigkeit von ADSC in Wunden zu erhalten und den Wundheilungsprozess zu beschleunigen. Hier wollten wir den synergistischen Einfluss der Photobiomodulation (PBM) auf die ADSC-Proliferation und Zytotoxizität innerhalb eines 3D-Zellkulturrahmens bewerten. Immortalisierte ADSCs wurden in 10-μl-Hydrogele mit einer Dichte von 2,5 x 103 Zellen ausgesät und mit 525-nm- und 825-nm-Dioden bei Fluenzen von 5 J/cm2 und 10 J/cm2 bestrahlt. Morphologische Veränderungen, Zytotoxizität und Proliferation wurden 24 Stunden und 10 Tage nach der PBM-Exposition bewertet. Die ADSCs wiesen eine abgerundete Morphologie auf und waren als einzelne Zellen oder Sphäroidaggregate über das Gel verteilt. Wichtig ist, dass sowohl PBM als auch 3D-Kulturrahmen keine zytotoxischen Wirkungen auf die Zellen zeigten, während PBM die Proliferationsraten von ADSCs signifikant erhöhte. Zusammenfassend zeigt diese Studie die Verwendung von Hydrogel als geeignete 3D-Umgebung für die ADSC-Kultur und führt PBM als signifikante Augmentationsstrategie ein, die insbesondere die langsamen Proliferationsraten im Zusammenhang mit 3D-Zellkulturen berücksichtigt.

Introduction

ADSCs sind mesenchymale multipotente Vorläuferzellen mit der Fähigkeit, sich selbst zu erneuern und in mehrere Zelllinien zu differenzieren. Diese Zellen können während eines Lipoaspirationsverfahrens aus der stromalen vaskulären Fraktion (SVF) des Fettgewebes entnommen werden1. ADSCs haben sich als idealer Stammzelltyp für den Einsatz in der regenerativen Medizin herausgestellt, da diese Zellen reichlich vorhanden, minimalinvasiv zu ernten, leicht zugänglich und gut charakterisiert sind2. Die Stammzelltherapie bietet einen möglichen Weg zur Wundheilung, indem sie die Zellmigration, Proliferation, Neovaskularisation stimuliert und Entzündungen in Wunden reduziert 3,4. Etwa 80 % der Regenerationskapazität von ADSCs sind auf die parakrine Signalübertragung über ihr Sekretomzurückzuführen 5. Zuvor wurde vorgeschlagen, dass eine direkte lokale Injektion von Stammzellen oder Wachstumsfaktoren in geschädigtes Gewebe ausreichende In-vivo-Reparaturmechanismen verhindern könnte 6,7,8. Dieser Ansatz war jedoch mit mehreren Herausforderungen verbunden, wie z. B. einem schlechten Überleben und einer reduzierten Stammzelltransplantation in geschädigtem Gewebe als Folge der entzündlichen Umgebung 9. Darüber hinaus war einer der genannten Gründe das Fehlen einer extrazellulären Matrix, um das Überleben und die Funktionalität der transplantierten Zellen zu unterstützen10. Um diese Herausforderungen zu meistern, liegt der Schwerpunkt nun auf der Entwicklung von Biomaterialträgern zur Unterstützung der Lebensfähigkeit und Funktion von Stammzellen.

Dreidimensionale (3D) Zellkulturen verbessern die Zell-zu-Zell- und Zell-zu-Matrix-Interaktion in vitro, um eine Umgebung zu schaffen, die der In-vivo-Umgebung besser ähnelt11. Hydrogele wurden ausgiebig als eine Klasse von Biomaterialträgern untersucht, die eine 3D-Umgebung für die Stammzellkultur bieten. Diese Strukturen bestehen aus Wasser und vernetzten Polymeren12. Die Verkapselung von ADSCs in Hydrogel hat während der Kultur praktisch keine zytotoxische Wirkung auf die Zellen, während die Lebensfähigkeit der Zellen erhaltenbleibt 6. In 3D kultivierte Stammzellen zeigen eine verbesserte Beibehaltung ihrer Stammzellen und eine verbesserte Differenzierungsfähigkeit13. In ähnlicher Weise zeigten Hydrogel-ausgesäte ADSCs in Tiermodellen eine erhöhte Lebensfähigkeit und einen beschleunigten Wundverschluss14. Darüber hinaus erhöht die Hydrogelverkapselung die Transplantation und Retention von ADSCs in Wunden signifikant15,16. TrueGel3D besteht aus einem Polymer, entweder Polyvinylalkohol oder Dextran, das durch einen Vernetzer, entweder Cyclodextrin oder Polyethylenglykol17, verfestigt wird. Das Gel ist ein synthetisches Hydrogel, das keine tierischen Produkte enthält, die die Experimente stören oder eine Immunreaktion während der Transplantation des Gels in einen Patienten auslösen könnten, während es effektiv eine extrazelluläre Matrix nachahmt18. Das Gel ist vollständig anpassbar, indem die Zusammensetzung und die einzelnen Komponenten geändert werden. Es kann verschiedene Stammzellen beherbergen und die Differenzierung mehrerer Zelltypen unterstützen, indem es die Steifigkeit des Gels19 anpasst. Bindungsstellen können durch Zugabe von Peptiden20 erzeugt werden. Das Gel ist durch die Sekretion von Metalloproteasen abbaubar, was eine Zellmigration ermöglicht21. Schließlich ist es klar und ermöglicht bildgebende Verfahren.

PBM ist eine minimalinvasive und einfach durchzuführende Form der Low-Level-Lasertherapie zur Stimulation intrazellulärer Chromophore. Unterschiedliche Wellenlängen erzeugen unterschiedliche Wirkungen auf Zellen22. Licht im roten bis nahen Infrarotbereich stimuliert eine erhöhte Produktion von Adenosintriphosphat (ATP) und reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), indem es den Fluss durch die Elektronentransportkette erhöht23. Licht im blauen und grünen Bereich stimuliert lichtgesteuerte Ionenkanäle und ermöglicht den unspezifischen Einstrom von Kationen wie Kalzium und Magnesium in die Zellen, was bekanntermaßen die Differenzierung verbessert24. Der Nettoeffekt ist die Erzeugung von sekundären Botenstoffen, die die Transkription von Faktoren stimulieren, die nachgelagerte zelluläre Prozesse wie Migration, Proliferation und Differenzierung auslösen25. PBM kann verwendet werden, um Zellen für die Proliferation oder Differenzierung vorzukonditionieren, bevor die Zellen in eine ungünstige Umgebung, z. B. beschädigtes Gewebe, transplantiert werden26. Die PBM-Exposition vor und nach der Transplantation (630 nm und 810 nm) von ADSCs verbesserte die Lebensfähigkeit und Funktion dieser Zellen in vivo in einem diabetischen Rattenmodell signifikant27. Die regenerative Medizin benötigt eine ausreichende Anzahl von Zellen für eine effektive Reparatur von Geweben28. In der 3D-Zellkultur wurden ADSCs mit langsameren Proliferationsraten im Vergleich zu zweidimensionalen Zellkulturen in Verbindung gebracht6. PBM kann jedoch verwendet werden, um den 3D-Zellkulturprozess von ADSCs zu verbessern, indem es die Lebensfähigkeit, Proliferation, Migration und Differenzierung verbessert29,30.

Protocol

HINWEIS: In der Materialtabelle finden Sie Details zu allen Materialien, Reagenzien und Software, die in diesem Protokoll verwendet werden. Das Protokoll ist in Abbildung 1 grafisch zusammengefasst. 1. Zweidimensionale (2D) Zellkultur HINWEIS: Immortalisierte ADSCs (1 x106 Zellen) werden bei -195,8 °C in flüssigem Stickstoff in einem Kryokonservierungsfläschchen mit 1 ml Zellgefriermedium ge…

Representative Results

Um die Morphologie zu beurteilen und die Zelldichte der Hydrogele visuell zu untersuchen, wurde die inverse Mikroskopie verwendet (Abbildung 2). Die ADSCs behielten 24 Stunden nach der Aussaat und PBM-Exposition eine abgerundete Morphologie bei. Die Zellen waren als Einzelzellen oder in traubenartigen Clustern über das Gel verstreut. Die Morphologie war nach 10 Tagen in 3D-Kultur unverändert. Es wurde kein eindeutiger Unterschied in der Morphologie zwischen den Versuchsgruppen und Kontroll…

Discussion

ADSCs sind ein idealer Zelltyp für die regenerative Medizin, da sie verschiedene Prozesse stimulieren, um die Wundheilung zu unterstützen 3,4. Es gibt jedoch mehrere Herausforderungen, die umgangen werden müssen, z. B. schlechte Überlebensraten und eine ineffektive Transplantation der Zellen an einer Verletzungsstelle9. Immortalisierte Zellen wurden als kommerziell erhältliche Zelllinie verwendet, da sie im Vergleich zu Primärzellen …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Forschung wurde finanziert von der National Research Foundation of South Africa Thuthuka Instrument, Fördernummer TTK2205035996; das vom Ministerium für Wissenschaft und Innovation (DSI) finanzierte African Laser Centre (ALC), Fördernummer HLHA23X Aufgabe ALC-R007; der University Research Council, Fördernummer 2022URC00513; die South African Research Chairs Initiative (DST-NRF/SARChI) des Ministeriums für Wissenschaft und Technologie, Fördernummer 98337. Die Fördergeber spielten keine Rolle bei der Konzeption der Studie, der Sammlung, der Analyse, der Interpretation der Daten oder dem Verfassen des Manuskripts. Die Autoren danken der University of Johannesburg (UJ) und dem Laser Research Centre (LRC) für die Nutzung der Einrichtungen und Ressourcen.

Materials

525 nm diode laser National Laser Centre of South Africa EN 60825-1:2007
825 nm diode laser National Laser Centre of South Africa SN 101080908ADR-1800
96 Well Strip Plates Sigma-Aldrich BR782301
Amphotericin B Sigma-Aldrich A2942 Antibiotic (0.5%; 0.5 mL)
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay Promega G9681 ATP reagent, Proliferation assay Kit
Corning 2 mL External Threaded Polypropylene Cryogenic Vial Corning 430659 cryovial
CryoSOfree Sigma-Aldrich C9249 Cell freezing media
CytoTox96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay Promega G1780 Cytotoxicity reagent
Dulbecco’s Modified Eagle Media Sigma-Aldrich D5796 Basal medium (39 mL/44 mL)
FieldMate Laser Power Meter Coherent 1098297
Flat-bottomed Corning 96 well clear polystyrene plate Sigma-Aldrich CLS3370
Foetal bovine serum Biochrom S0615 Culture medium enrichment (5 mL; 10% / 10 mL; 20%)
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) Sigma-Aldrich H9394 Rinse solution
Heracell 150i CO2 incubator Thermo Scientific 51026280
Heraeus Labofuge 400 Thermo Scientific 75008371 Plate spinner for 96 well plates
Heraeus Megafuge 16R centrifuge ThermoFisher 75004270
Immortalized ADSCs ATCC ASC52Telo hTERT, ATCC SCRC-4000 Passage 37
Invitrogen Countess 3 Invitrogen AMQAX2000 Automated cell counter for Trypan Blue
Julabo TW20 waterbath Sigma-Aldrich Z615501 Waterbath used to warm media to 37 °C
Olympus CellSens Entry Olympus Version 3.2 (23706)  Imaging software: digital image acquisition
Olympus CKX41 Olympus SN9B02019 Inverted light microscope
Olympus SC30 camera Olympus SN57000530 Camera attached to inverted light microscope
Opaque-walled Corning 96 well solid polystyrene microplates Sigma-Aldrich CLS3912 Opaque well used for ATP luminescence
Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich P4333 Antibiotic (0.5%; 0.5 mL)
SigmaPlot 12.0 Systat Software Incorporated
TrueGel3D – True3 Sigma-Aldrich TRUE3-1KT 10 µL
TrueGel3D Enzymatic Cell Recovery Solution Sigma-Aldrich TRUEENZ 01:20
Trypan Blue Stain Thermo Fisher – Invitrogen T10282 0.4% solution
TrypLE Select Enzyme (1x) Gibco 12563029 Cell detachment solution
Victor Nivo Plate Reader Perkin Elmer HH3522019094 Spectrophotometric plate reader

References

  1. Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: Implications for cell-based therapies. Tissue Eng. 7 (2), 211-228 (2001).
  2. Yuan, X., et al. Strategies for improving adipose-derived stem cells for tissue regeneration. Burns Trauma. 10, (2022).
  3. Nilforoushzadeh, M. A., et al. Mesenchymal stem cell spheroids embedded in an injectable thermosensitive hydrogel: An in situ drug formation platform for accelerated wound healing. ACS Biomater Sci Eng. 6 (9), 5096-5109 (2020).
  4. Yang, M., et al. Thermosensitive injectable chitosan/collagen/β-glycerophosphate composite hydrogels for enhancing wound healing by encapsulating mesenchymal stem cell spheroids. ACS Omega. 5 (33), 21015-21023 (2020).
  5. Chimenti, I., et al. Relative roles of direct regeneration versus paracrine effects of human cardiosphere-derived cells transplanted into infarcted mice. Circ Res. 106 (5), 971-980 (2010).
  6. Hassan, W., Dong, Y., Wang, W. Encapsulation and 3d culture of human adipose-derived stem cells in an in-situ crosslinked hybrid hydrogel composed of peg-based hyperbranched copolymer and hyaluronic acid. Stem Cell Res Ther. 4 (2), 32 (2013).
  7. Wu, K. H., Mo, X. M., Han, Z. C., Zhou, B. Stem cell engraftment and survival in the ischemic heart. The Ann Thorac Surg. 92 (5), 1917-1925 (2011).
  8. Lee, K., Silva, E. A., Mooney, D. J. Growth factor delivery-based tissue engineering: General approaches and a review of recent developments. J R Soc Interface. 8 (55), 153-170 (2011).
  9. Koivunotko, E., et al. Angiogenic potential of human adipose-derived mesenchymal stromal cells in nanofibrillated cellulose hydrogel. Biomedicines. 10 (10), 2584 (2022).
  10. Dong, Y., et al. Injectable and tunable gelatin hydrogels enhance stem cell retention and improve cutaneous wound healing. Adv Funct Mater. 27 (24), 1606619 (2017).
  11. Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3d cell culture. Biotechnol Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).
  12. Mantha, S., et al. Smart hydrogels in tissue engineering and regenerative medicine. Materials. 12 (20), 3323 (2019).
  13. Sung, T. -. C., et al. 3D culturing of human adipose-derived stem cells enhances their pluripotency and differentiation abilities. J Mater Sci Technol. 63, 9-17 (2021).
  14. Garg, R. K., et al. Capillary force seeding of hydrogels for adipose-derived stem cell delivery in wounds. Stem Cells Transl Med. 3 (9), 1079-1089 (2014).
  15. Kim, Y. M., et al. Adipose-derived stem cell-containing hyaluronic acid/alginate hydrogel improves vocal fold wound healing. Laryngoscope. 124 (3), E64-E72 (2014).
  16. Dong, Y., et al. Conformable hyaluronic acid hydrogel delivers adipose-derived stem cells and promotes regeneration of burn injury. Acta Biomater. 108, 56-66 (2020).
  17. Truegel3d hydrogel for 3d cell culture. Merck Available from: https://www.sigmaaldrich.com/ZA/en/technical-documents/technical-article/cell-culture-and-cell-culture-analysis/3d-cell-culture/truegel3d (2024)
  18. Braccini, S., Tacchini, C., Chiellini, F., Puppi, D. Polymeric hydrogels for in vitro 3d ovarian cancer modeling. Int J Mol Sci. 23 (6), 3265 (2022).
  19. Mashinchian, O., et al. In vivo transcriptomic profiling using cell encapsulation identifies effector pathways of systemic aging. eLife. 11, e57393 (2022).
  20. Matsushige, C., Xu, X., Miyagi, M., Zuo, Y. Y., Yamazaki, Y. Rgd-modified dextran hydrogel promotes follicle growth in three-dimensional ovarian tissue culture in mice. Theriogenology. 183, 120-131 (2022).
  21. Marx, V. How some labs put more bio into biomaterials. Nat Methods. 16 (5), 365-368 (2019).
  22. Marques, M. M. Photobiomodulation therapy weaknesses. Laser Dent Sci. 6 (3), 131-132 (2022).
  23. Hamblin, M. R. Mechanisms and mitochondrial redox signaling in photobiomodulation. Photochem Photobiol. 94 (2), 199-212 (2018).
  24. Chen, J., et al. Low-level controllable blue LEDs irradiation enhances human dental pulp stem cells osteogenic differentiation via transient receptor potential vanilloid 1. J Photochem Photobiol B. 233, 112472 (2022).
  25. Chang, S. -. Y., Carpena, N. T., Kang, B. J., Lee, M. Y. Effects of photobiomodulation on stem cells important for regenerative medicine. Med Lasers. 9 (2), 134-141 (2020).
  26. Bikmulina, P. Y., et al. Beyond 2d: Effects of photobiomodulation in 3d tissue-like systems. J Biomed Opt. 25 (4), 048001 (2020).
  27. Ahmadi, H., et al. Transplantation of photobiomodulation-preconditioned diabetic stem cells accelerates ischemic wound healing in diabetic rats. Stem Cell Res Ther. 11 (1), 494 (2020).
  28. Mao, A. S., Mooney, D. J. Regenerative medicine: Current therapies and future directions. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (47), 14452-14459 (2015).
  29. De Andrade, A. L. M., et al. Effect of photobiomodulation on the behaviour of mesenchymal stem cells in three-dimensional cultures. Lasers Med Sci. 38 (1), 221 (2023).
  30. Diniz, I. M., et al. Photobiomodulation of mesenchymal stem cells encapsulated in an injectable rhbmp4-loaded hydrogel directs hard tissue bioengineering. J Cell Physiol. 233 (6), 4907-4918 (2018).
  31. Carter, M., Shieh, J. C. . Guide to Research Techniques in Neuroscience. , (2015).
  32. Lutolf, M. P., et al. Synthetic matrix metalloproteinase-sensitive hydrogels for the conduction of tissue regeneration: Engineering cell-invasion characteristics. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (9), 5413-5418 (2003).
  33. Robledo, F., et al. Spheroids derived from the stromal vascular fraction of adipose tissue self-organize in complex adipose organoids and secrete leptin. Stem Cell Res Ther. 14 (1), 70 (2023).
  34. Landry, J., Freyer, J. P., Sutherland, R. M. Shedding of mitotic cells from the surface of multicell spheroids during growth. J Cell Physiol. 106 (1), 23-32 (1981).
  35. Bogacheva, M. S., et al. Differentiation of human pluripotent stem cells into definitive endoderm cells in various flexible three-dimensional cell culture systems: Possibilities and limitations. Front Cell Dev Biol. 9, 726499 (2021).
  36. Chen, X., Thibeault, S. L. Biocompatibility of a synthetic extracellular matrix on immortalized vocal fold fibroblasts in 3-d culture. Acta Biomater. 6 (8), 2940-2948 (2010).
  37. Crous, A., Van Rensburg, M. J., Abrahamse, H. Single and consecutive application of near-infrared and green irradiation modulates adipose derived stem cell proliferation and affect differentiation factors. Biochimie. 196, 225-233 (2022).

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Cite This Article
Roets, B., Abrahamse, H., Crous, A. Three-Dimensional Cell Culture of Adipose-Derived Stem Cells in a Hydrogel with Photobiomodulation Augmentation. J. Vis. Exp. (206), e66616, doi:10.3791/66616 (2024).

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