Hier stellen wir ein Protokoll vor, das die Verwendung von Hydrogel als dreidimensionales (3D) Zellkulturgerüst für die ADSC-Kultur (Adipose-Derived Stem Cells) demonstriert und Photobiomodulation (PBM) einführt, um die Proliferation von ADSCs innerhalb der 3D-Kulturumgebung zu verbessern.
Aus Fettgewebe gewonnene Stammzellen (ADSCs), die multipotente mesenchymale Eigenschaften ähnlich wie Stammzellen besitzen, werden häufig in der regenerativen Medizin eingesetzt, da sie eine Vielzahl von Zelldifferenzierungen ermöglichen und die Migration und Proliferation verbessern und Entzündungen lindern können. ADSCs stehen jedoch oft vor Herausforderungen beim Überleben und der Transplantation in Wunden, vor allem aufgrund ungünstiger entzündlicher Bedingungen. Um dieses Problem anzugehen, wurden Hydrogele entwickelt, um die Lebensfähigkeit von ADSC in Wunden zu erhalten und den Wundheilungsprozess zu beschleunigen. Hier wollten wir den synergistischen Einfluss der Photobiomodulation (PBM) auf die ADSC-Proliferation und Zytotoxizität innerhalb eines 3D-Zellkulturrahmens bewerten. Immortalisierte ADSCs wurden in 10-μl-Hydrogele mit einer Dichte von 2,5 x 103 Zellen ausgesät und mit 525-nm- und 825-nm-Dioden bei Fluenzen von 5 J/cm2 und 10 J/cm2 bestrahlt. Morphologische Veränderungen, Zytotoxizität und Proliferation wurden 24 Stunden und 10 Tage nach der PBM-Exposition bewertet. Die ADSCs wiesen eine abgerundete Morphologie auf und waren als einzelne Zellen oder Sphäroidaggregate über das Gel verteilt. Wichtig ist, dass sowohl PBM als auch 3D-Kulturrahmen keine zytotoxischen Wirkungen auf die Zellen zeigten, während PBM die Proliferationsraten von ADSCs signifikant erhöhte. Zusammenfassend zeigt diese Studie die Verwendung von Hydrogel als geeignete 3D-Umgebung für die ADSC-Kultur und führt PBM als signifikante Augmentationsstrategie ein, die insbesondere die langsamen Proliferationsraten im Zusammenhang mit 3D-Zellkulturen berücksichtigt.
ADSCs sind mesenchymale multipotente Vorläuferzellen mit der Fähigkeit, sich selbst zu erneuern und in mehrere Zelllinien zu differenzieren. Diese Zellen können während eines Lipoaspirationsverfahrens aus der stromalen vaskulären Fraktion (SVF) des Fettgewebes entnommen werden1. ADSCs haben sich als idealer Stammzelltyp für den Einsatz in der regenerativen Medizin herausgestellt, da diese Zellen reichlich vorhanden, minimalinvasiv zu ernten, leicht zugänglich und gut charakterisiert sind2. Die Stammzelltherapie bietet einen möglichen Weg zur Wundheilung, indem sie die Zellmigration, Proliferation, Neovaskularisation stimuliert und Entzündungen in Wunden reduziert 3,4. Etwa 80 % der Regenerationskapazität von ADSCs sind auf die parakrine Signalübertragung über ihr Sekretomzurückzuführen 5. Zuvor wurde vorgeschlagen, dass eine direkte lokale Injektion von Stammzellen oder Wachstumsfaktoren in geschädigtes Gewebe ausreichende In-vivo-Reparaturmechanismen verhindern könnte 6,7,8. Dieser Ansatz war jedoch mit mehreren Herausforderungen verbunden, wie z. B. einem schlechten Überleben und einer reduzierten Stammzelltransplantation in geschädigtem Gewebe als Folge der entzündlichen Umgebung 9. Darüber hinaus war einer der genannten Gründe das Fehlen einer extrazellulären Matrix, um das Überleben und die Funktionalität der transplantierten Zellen zu unterstützen10. Um diese Herausforderungen zu meistern, liegt der Schwerpunkt nun auf der Entwicklung von Biomaterialträgern zur Unterstützung der Lebensfähigkeit und Funktion von Stammzellen.
Dreidimensionale (3D) Zellkulturen verbessern die Zell-zu-Zell- und Zell-zu-Matrix-Interaktion in vitro, um eine Umgebung zu schaffen, die der In-vivo-Umgebung besser ähnelt11. Hydrogele wurden ausgiebig als eine Klasse von Biomaterialträgern untersucht, die eine 3D-Umgebung für die Stammzellkultur bieten. Diese Strukturen bestehen aus Wasser und vernetzten Polymeren12. Die Verkapselung von ADSCs in Hydrogel hat während der Kultur praktisch keine zytotoxische Wirkung auf die Zellen, während die Lebensfähigkeit der Zellen erhaltenbleibt 6. In 3D kultivierte Stammzellen zeigen eine verbesserte Beibehaltung ihrer Stammzellen und eine verbesserte Differenzierungsfähigkeit13. In ähnlicher Weise zeigten Hydrogel-ausgesäte ADSCs in Tiermodellen eine erhöhte Lebensfähigkeit und einen beschleunigten Wundverschluss14. Darüber hinaus erhöht die Hydrogelverkapselung die Transplantation und Retention von ADSCs in Wunden signifikant15,16. TrueGel3D besteht aus einem Polymer, entweder Polyvinylalkohol oder Dextran, das durch einen Vernetzer, entweder Cyclodextrin oder Polyethylenglykol17, verfestigt wird. Das Gel ist ein synthetisches Hydrogel, das keine tierischen Produkte enthält, die die Experimente stören oder eine Immunreaktion während der Transplantation des Gels in einen Patienten auslösen könnten, während es effektiv eine extrazelluläre Matrix nachahmt18. Das Gel ist vollständig anpassbar, indem die Zusammensetzung und die einzelnen Komponenten geändert werden. Es kann verschiedene Stammzellen beherbergen und die Differenzierung mehrerer Zelltypen unterstützen, indem es die Steifigkeit des Gels19 anpasst. Bindungsstellen können durch Zugabe von Peptiden20 erzeugt werden. Das Gel ist durch die Sekretion von Metalloproteasen abbaubar, was eine Zellmigration ermöglicht21. Schließlich ist es klar und ermöglicht bildgebende Verfahren.
PBM ist eine minimalinvasive und einfach durchzuführende Form der Low-Level-Lasertherapie zur Stimulation intrazellulärer Chromophore. Unterschiedliche Wellenlängen erzeugen unterschiedliche Wirkungen auf Zellen22. Licht im roten bis nahen Infrarotbereich stimuliert eine erhöhte Produktion von Adenosintriphosphat (ATP) und reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), indem es den Fluss durch die Elektronentransportkette erhöht23. Licht im blauen und grünen Bereich stimuliert lichtgesteuerte Ionenkanäle und ermöglicht den unspezifischen Einstrom von Kationen wie Kalzium und Magnesium in die Zellen, was bekanntermaßen die Differenzierung verbessert24. Der Nettoeffekt ist die Erzeugung von sekundären Botenstoffen, die die Transkription von Faktoren stimulieren, die nachgelagerte zelluläre Prozesse wie Migration, Proliferation und Differenzierung auslösen25. PBM kann verwendet werden, um Zellen für die Proliferation oder Differenzierung vorzukonditionieren, bevor die Zellen in eine ungünstige Umgebung, z. B. beschädigtes Gewebe, transplantiert werden26. Die PBM-Exposition vor und nach der Transplantation (630 nm und 810 nm) von ADSCs verbesserte die Lebensfähigkeit und Funktion dieser Zellen in vivo in einem diabetischen Rattenmodell signifikant27. Die regenerative Medizin benötigt eine ausreichende Anzahl von Zellen für eine effektive Reparatur von Geweben28. In der 3D-Zellkultur wurden ADSCs mit langsameren Proliferationsraten im Vergleich zu zweidimensionalen Zellkulturen in Verbindung gebracht6. PBM kann jedoch verwendet werden, um den 3D-Zellkulturprozess von ADSCs zu verbessern, indem es die Lebensfähigkeit, Proliferation, Migration und Differenzierung verbessert29,30.
ADSCs sind ein idealer Zelltyp für die regenerative Medizin, da sie verschiedene Prozesse stimulieren, um die Wundheilung zu unterstützen 3,4. Es gibt jedoch mehrere Herausforderungen, die umgangen werden müssen, z. B. schlechte Überlebensraten und eine ineffektive Transplantation der Zellen an einer Verletzungsstelle9. Immortalisierte Zellen wurden als kommerziell erhältliche Zelllinie verwendet, da sie im Vergleich zu Primärzellen …
The authors have nothing to disclose.
Diese Forschung wurde finanziert von der National Research Foundation of South Africa Thuthuka Instrument, Fördernummer TTK2205035996; das vom Ministerium für Wissenschaft und Innovation (DSI) finanzierte African Laser Centre (ALC), Fördernummer HLHA23X Aufgabe ALC-R007; der University Research Council, Fördernummer 2022URC00513; die South African Research Chairs Initiative (DST-NRF/SARChI) des Ministeriums für Wissenschaft und Technologie, Fördernummer 98337. Die Fördergeber spielten keine Rolle bei der Konzeption der Studie, der Sammlung, der Analyse, der Interpretation der Daten oder dem Verfassen des Manuskripts. Die Autoren danken der University of Johannesburg (UJ) und dem Laser Research Centre (LRC) für die Nutzung der Einrichtungen und Ressourcen.
525 nm diode laser | National Laser Centre of South Africa | EN 60825-1:2007 | |
825 nm diode laser | National Laser Centre of South Africa | SN 101080908ADR-1800 | |
96 Well Strip Plates | Sigma-Aldrich | BR782301 | |
Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2942 | Antibiotic (0.5%; 0.5 mL) |
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | G9681 | ATP reagent, Proliferation assay Kit |
Corning 2 mL External Threaded Polypropylene Cryogenic Vial | Corning | 430659 | cryovial |
CryoSOfree | Sigma-Aldrich | C9249 | Cell freezing media |
CytoTox96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay | Promega | G1780 | Cytotoxicity reagent |
Dulbecco’s Modified Eagle Media | Sigma-Aldrich | D5796 | Basal medium (39 mL/44 mL) |
FieldMate Laser Power Meter | Coherent | 1098297 | |
Flat-bottomed Corning 96 well clear polystyrene plate | Sigma-Aldrich | CLS3370 | |
Foetal bovine serum | Biochrom | S0615 | Culture medium enrichment (5 mL; 10% / 10 mL; 20%) |
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Sigma-Aldrich | H9394 | Rinse solution |
Heracell 150i CO2 incubator | Thermo Scientific | 51026280 | |
Heraeus Labofuge 400 | Thermo Scientific | 75008371 | Plate spinner for 96 well plates |
Heraeus Megafuge 16R centrifuge | ThermoFisher | 75004270 | |
Immortalized ADSCs | ATCC | ASC52Telo hTERT, ATCC SCRC-4000 | Passage 37 |
Invitrogen Countess 3 | Invitrogen | AMQAX2000 | Automated cell counter for Trypan Blue |
Julabo TW20 waterbath | Sigma-Aldrich | Z615501 | Waterbath used to warm media to 37 °C |
Olympus CellSens Entry | Olympus | Version 3.2 (23706) | Imaging software: digital image acquisition |
Olympus CKX41 | Olympus | SN9B02019 | Inverted light microscope |
Olympus SC30 camera | Olympus | SN57000530 | Camera attached to inverted light microscope |
Opaque-walled Corning 96 well solid polystyrene microplates | Sigma-Aldrich | CLS3912 | Opaque well used for ATP luminescence |
Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | Antibiotic (0.5%; 0.5 mL) |
SigmaPlot 12.0 | Systat Software Incorporated | ||
TrueGel3D – True3 | Sigma-Aldrich | TRUE3-1KT | 10 µL |
TrueGel3D Enzymatic Cell Recovery Solution | Sigma-Aldrich | TRUEENZ | 01:20 |
Trypan Blue Stain | Thermo Fisher – Invitrogen | T10282 | 0.4% solution |
TrypLE Select Enzyme (1x) | Gibco | 12563029 | Cell detachment solution |
Victor Nivo Plate Reader | Perkin Elmer | HH3522019094 | Spectrophotometric plate reader |