Aquí, presentamos un protocolo que demuestra el uso del hidrogel como un marco de cultivo celular tridimensional (3D) para el cultivo de células madre derivadas de tejido adiposo (ADSC) e introduce la fotobiomodulación (PBM) para mejorar la proliferación de ADSC dentro del entorno de cultivo 3D.
Las células madre derivadas del tejido adiposo (ADSC), que poseen características mesenquimales multipotentes similares a las células madre, se emplean con frecuencia en medicina regenerativa debido a su capacidad para una amplia gama de diferenciación celular y su capacidad para mejorar la migración, la proliferación y mitigar la inflamación. Sin embargo, las ADSC a menudo enfrentan desafíos en la supervivencia y el injerto dentro de las heridas, principalmente debido a condiciones inflamatorias desfavorables. Para abordar este problema, se han desarrollado hidrogeles para mantener la viabilidad de ADSC en heridas y acelerar el proceso de cicatrización de heridas. Aquí, nuestro objetivo fue evaluar el impacto sinérgico de la fotobiomodulación (PBM) en la proliferación y citotoxicidad de ADSC dentro de un marco de cultivo celular en 3D. Las ADSC inmortalizadas se sembraron en hidrogeles de 10 μL a una densidad de 2,5 x 103 células y se sometieron a irradiación utilizando diodos de 525 nm y 825 nm a fluencias de 5 J/cm2 y 10 J/cm2. Se evaluaron los cambios morfológicos, la citotoxicidad y la proliferación a las 24 h y 10 días después de la exposición a PBM. Las ADSC exhibieron una morfología redondeada y se dispersaron por todo el gel como células individuales o agregados esferoides. Es importante destacar que tanto el PBM como el marco de cultivo 3D no mostraron efectos citotóxicos en las células, mientras que el PBM mejoró significativamente las tasas de proliferación de ADSC. En conclusión, este estudio demuestra el uso del hidrogel como un entorno 3D adecuado para el cultivo de ADSC e introduce el PBM como una estrategia de aumento significativa, abordando particularmente las tasas de proliferación lenta asociadas con el cultivo celular 3D.
Las ADSC son células progenitoras mesenquimales multipotentes con la capacidad de autorrenovarse y diferenciarse en varios linajes celulares. Estas células pueden extraerse de la fracción vascular estromal (FSV) del tejido adiposo durante un procedimiento de lipoaspiración1. Las ADSC se han convertido en un tipo de célula madre ideal para su uso en medicina regenerativa porque estas células son abundantes, mínimamente invasivas para la recolección, de fácil acceso ybien caracterizadas. La terapia con células madre ofrece una posible vía para la cicatrización de heridas al estimular la migración celular, la proliferación, la neovascularización y la reducción de la inflamación dentro de las heridas 3,4. Aproximadamente el 80% de la capacidad regenerativa de las ADSC es atribuible a la señalización paracrina a través de su secretoma5. Anteriormente, se sugirió que una inyección local directa de células madre o factores de crecimiento en el tejido dañado podría provocar suficientes mecanismos de reparación in vivo 6,7,8. Sin embargo, este enfoque enfrentó varios desafíos, como la baja supervivencia y la reducción del injerto de células madre dentro de los tejidos dañados como resultado del ambiente inflamatorio 9. Además, una de las razones citadas fue la falta de una matriz extracelular que apoyara la supervivencia y funcionalidad de las células trasplantadas10. Para superar estos desafíos, ahora se está haciendo hincapié en el desarrollo de portadores de biomateriales para apoyar la viabilidad y función de las células madre.
El cultivo celular tridimensional (3D) mejora la interacción célula a célula y célula a matriz in vitro para proporcionar un entorno que se asemeje mejor al entorno in vivo 11. Los hidrogeles se han estudiado ampliamente como una clase de portadores de biomateriales que proporcionan un entorno 3D para el cultivo de células madre. Estas estructuras están hechas de agua y polímeros reticulados12. La encapsulación de ADSC en hidrogel prácticamente no tiene ningún efecto citotóxico sobre las células durante el cultivo, manteniendo la viabilidad de las células6. Las células madre cultivadas en 3D demuestran una mayor retención de su madre y una mayor capacidad de diferenciación13. Del mismo modo, las ADSC sembradas con hidrogel demostraron una mayor viabilidad y un cierre acelerado de la herida en modelos animales14. Además, la encapsulación de hidrogel aumenta significativamente el injerto y la retención de ADSC en heridas15,16. TrueGel3D está hecho de un polímero, ya sea alcohol polivinílico o dextrano, solidificado por un reticulante, ya sea ciclodextrina o polietilenglicol17. El gel es un hidrogel sintético que no contiene ningún producto animal que pueda interferir con los experimentos o desencadenar una reacción inmune durante el trasplante del gel en un paciente, al tiempo que imita eficazmente una matriz extracelular18. El gel es totalmente personalizable modificando la composición y los componentes individuales. Puede albergar diferentes células madre y apoyar la diferenciación de varios tipos de células ajustando la rigidez del gel19. Los sitios de unión se pueden crear mediante la adición de péptidos20. El gel es degradable por la secreción de metaloproteasas, lo que permite la migración celular21. Por último, es transparente y permite realizar técnicas de imagen.
La PBM es una forma mínimamente invasiva y fácil de realizar de terapia con láser de bajo nivel que se utiliza para estimular los cromóforos intracelulares. Diferentes longitudes de onda provocan diferentes efectos en las células22. La luz en el rango del rojo al infrarrojo cercano estimula el aumento de la producción de trifosfato de adenosina (ATP) y especies reactivas de oxígeno (ROS) al mejorar el flujo a través de la cadena de transporte de electrones23. La luz en los rangos azul y verde estimula los canales iónicos activados por la luz, lo que permite la afluencia inespecífica de cationes, como el calcio y el magnesio, en las células, lo que se sabe que mejora la diferenciación24. El efecto neto es la generación de mensajeros secundarios que estimulan la transcripción de factores que desencadenan procesos celulares posteriores como la migración, la proliferación y la diferenciación25. El PBM se puede utilizar para preacondicionar las células para que proliferen o se diferencien antes de trasplantarlas a un entorno adverso, por ejemplo, tejido dañado26. La exposición a PBM antes y después del trasplante (630 nm y 810 nm) de ADSC mejoró significativamente la viabilidad y la función de estas células in vivo en un modelo de rata diabética27. La medicina regenerativa requiere un número adecuado de células para la reparación efectiva de los tejidos28. En el cultivo celular 3D, las ADSC se han asociado con tasas de proliferación más lentas en comparación con el cultivo celular bidimensional6. Sin embargo, el PBM se puede utilizar para aumentar el proceso de cultivo celular 3D de las ADSC al mejorar la viabilidad, la proliferación, la migración y la diferenciación29,30.
Las ADSC son un tipo de célula ideal para la medicina regenerativa, ya que estimulan varios procesos para ayudar en la cicatrización de heridas 3,4. Sin embargo, hay varios desafíos que deben sortearse, por ejemplo, las bajas tasas de supervivencia y el injerto ineficaz de las células en el sitio de la lesión9. Las células inmortalizadas se utilizaron como una línea celular disponible comercialmente, ya que pueden pasar durante más…
The authors have nothing to disclose.
Esta investigación fue financiada por la Fundación Nacional de Investigación de Sudáfrica Thuthuka Instrument, subvención número TTK2205035996; el Centro Africano de Láser (ALC), financiado por el Departamento de Ciencia e Innovación (DSI), número de subvención HLHA23X tarea ALC-R007; el Consejo Universitario de Investigación, subvención número 2022URC00513; la Iniciativa de Cátedras de Investigación de Sudáfrica del Departamento de Ciencia y Tecnología (DST-NRF/SARChI), subvención número 98337. Los organismos financiadores no desempeñaron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación, el análisis, la interpretación de los datos o la redacción del manuscrito. Los autores agradecen a la Universidad de Johannesburgo (UJ) y al Centro de Investigación Láser (LRC) por el uso de las instalaciones y los recursos.
525 nm diode laser | National Laser Centre of South Africa | EN 60825-1:2007 | |
825 nm diode laser | National Laser Centre of South Africa | SN 101080908ADR-1800 | |
96 Well Strip Plates | Sigma-Aldrich | BR782301 | |
Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2942 | Antibiotic (0.5%; 0.5 mL) |
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | G9681 | ATP reagent, Proliferation assay Kit |
Corning 2 mL External Threaded Polypropylene Cryogenic Vial | Corning | 430659 | cryovial |
CryoSOfree | Sigma-Aldrich | C9249 | Cell freezing media |
CytoTox96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay | Promega | G1780 | Cytotoxicity reagent |
Dulbecco’s Modified Eagle Media | Sigma-Aldrich | D5796 | Basal medium (39 mL/44 mL) |
FieldMate Laser Power Meter | Coherent | 1098297 | |
Flat-bottomed Corning 96 well clear polystyrene plate | Sigma-Aldrich | CLS3370 | |
Foetal bovine serum | Biochrom | S0615 | Culture medium enrichment (5 mL; 10% / 10 mL; 20%) |
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Sigma-Aldrich | H9394 | Rinse solution |
Heracell 150i CO2 incubator | Thermo Scientific | 51026280 | |
Heraeus Labofuge 400 | Thermo Scientific | 75008371 | Plate spinner for 96 well plates |
Heraeus Megafuge 16R centrifuge | ThermoFisher | 75004270 | |
Immortalized ADSCs | ATCC | ASC52Telo hTERT, ATCC SCRC-4000 | Passage 37 |
Invitrogen Countess 3 | Invitrogen | AMQAX2000 | Automated cell counter for Trypan Blue |
Julabo TW20 waterbath | Sigma-Aldrich | Z615501 | Waterbath used to warm media to 37 °C |
Olympus CellSens Entry | Olympus | Version 3.2 (23706) | Imaging software: digital image acquisition |
Olympus CKX41 | Olympus | SN9B02019 | Inverted light microscope |
Olympus SC30 camera | Olympus | SN57000530 | Camera attached to inverted light microscope |
Opaque-walled Corning 96 well solid polystyrene microplates | Sigma-Aldrich | CLS3912 | Opaque well used for ATP luminescence |
Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | Antibiotic (0.5%; 0.5 mL) |
SigmaPlot 12.0 | Systat Software Incorporated | ||
TrueGel3D – True3 | Sigma-Aldrich | TRUE3-1KT | 10 µL |
TrueGel3D Enzymatic Cell Recovery Solution | Sigma-Aldrich | TRUEENZ | 01:20 |
Trypan Blue Stain | Thermo Fisher – Invitrogen | T10282 | 0.4% solution |
TrypLE Select Enzyme (1x) | Gibco | 12563029 | Cell detachment solution |
Victor Nivo Plate Reader | Perkin Elmer | HH3522019094 | Spectrophotometric plate reader |