Summary

Cultivo Celular Tridimensional de Células Madre Derivadas del Temisio Adiposo en Hidrogel con Aumento de Fotobiomodulación

Published: April 05, 2024
doi:

Summary

Aquí, presentamos un protocolo que demuestra el uso del hidrogel como un marco de cultivo celular tridimensional (3D) para el cultivo de células madre derivadas de tejido adiposo (ADSC) e introduce la fotobiomodulación (PBM) para mejorar la proliferación de ADSC dentro del entorno de cultivo 3D.

Abstract

Las células madre derivadas del tejido adiposo (ADSC), que poseen características mesenquimales multipotentes similares a las células madre, se emplean con frecuencia en medicina regenerativa debido a su capacidad para una amplia gama de diferenciación celular y su capacidad para mejorar la migración, la proliferación y mitigar la inflamación. Sin embargo, las ADSC a menudo enfrentan desafíos en la supervivencia y el injerto dentro de las heridas, principalmente debido a condiciones inflamatorias desfavorables. Para abordar este problema, se han desarrollado hidrogeles para mantener la viabilidad de ADSC en heridas y acelerar el proceso de cicatrización de heridas. Aquí, nuestro objetivo fue evaluar el impacto sinérgico de la fotobiomodulación (PBM) en la proliferación y citotoxicidad de ADSC dentro de un marco de cultivo celular en 3D. Las ADSC inmortalizadas se sembraron en hidrogeles de 10 μL a una densidad de 2,5 x 103 células y se sometieron a irradiación utilizando diodos de 525 nm y 825 nm a fluencias de 5 J/cm2 y 10 J/cm2. Se evaluaron los cambios morfológicos, la citotoxicidad y la proliferación a las 24 h y 10 días después de la exposición a PBM. Las ADSC exhibieron una morfología redondeada y se dispersaron por todo el gel como células individuales o agregados esferoides. Es importante destacar que tanto el PBM como el marco de cultivo 3D no mostraron efectos citotóxicos en las células, mientras que el PBM mejoró significativamente las tasas de proliferación de ADSC. En conclusión, este estudio demuestra el uso del hidrogel como un entorno 3D adecuado para el cultivo de ADSC e introduce el PBM como una estrategia de aumento significativa, abordando particularmente las tasas de proliferación lenta asociadas con el cultivo celular 3D.

Introduction

Las ADSC son células progenitoras mesenquimales multipotentes con la capacidad de autorrenovarse y diferenciarse en varios linajes celulares. Estas células pueden extraerse de la fracción vascular estromal (FSV) del tejido adiposo durante un procedimiento de lipoaspiración1. Las ADSC se han convertido en un tipo de célula madre ideal para su uso en medicina regenerativa porque estas células son abundantes, mínimamente invasivas para la recolección, de fácil acceso ybien caracterizadas. La terapia con células madre ofrece una posible vía para la cicatrización de heridas al estimular la migración celular, la proliferación, la neovascularización y la reducción de la inflamación dentro de las heridas 3,4. Aproximadamente el 80% de la capacidad regenerativa de las ADSC es atribuible a la señalización paracrina a través de su secretoma5. Anteriormente, se sugirió que una inyección local directa de células madre o factores de crecimiento en el tejido dañado podría provocar suficientes mecanismos de reparación in vivo 6,7,8. Sin embargo, este enfoque enfrentó varios desafíos, como la baja supervivencia y la reducción del injerto de células madre dentro de los tejidos dañados como resultado del ambiente inflamatorio 9. Además, una de las razones citadas fue la falta de una matriz extracelular que apoyara la supervivencia y funcionalidad de las células trasplantadas10. Para superar estos desafíos, ahora se está haciendo hincapié en el desarrollo de portadores de biomateriales para apoyar la viabilidad y función de las células madre.

El cultivo celular tridimensional (3D) mejora la interacción célula a célula y célula a matriz in vitro para proporcionar un entorno que se asemeje mejor al entorno in vivo 11. Los hidrogeles se han estudiado ampliamente como una clase de portadores de biomateriales que proporcionan un entorno 3D para el cultivo de células madre. Estas estructuras están hechas de agua y polímeros reticulados12. La encapsulación de ADSC en hidrogel prácticamente no tiene ningún efecto citotóxico sobre las células durante el cultivo, manteniendo la viabilidad de las células6. Las células madre cultivadas en 3D demuestran una mayor retención de su madre y una mayor capacidad de diferenciación13. Del mismo modo, las ADSC sembradas con hidrogel demostraron una mayor viabilidad y un cierre acelerado de la herida en modelos animales14. Además, la encapsulación de hidrogel aumenta significativamente el injerto y la retención de ADSC en heridas15,16. TrueGel3D está hecho de un polímero, ya sea alcohol polivinílico o dextrano, solidificado por un reticulante, ya sea ciclodextrina o polietilenglicol17. El gel es un hidrogel sintético que no contiene ningún producto animal que pueda interferir con los experimentos o desencadenar una reacción inmune durante el trasplante del gel en un paciente, al tiempo que imita eficazmente una matriz extracelular18. El gel es totalmente personalizable modificando la composición y los componentes individuales. Puede albergar diferentes células madre y apoyar la diferenciación de varios tipos de células ajustando la rigidez del gel19. Los sitios de unión se pueden crear mediante la adición de péptidos20. El gel es degradable por la secreción de metaloproteasas, lo que permite la migración celular21. Por último, es transparente y permite realizar técnicas de imagen.

La PBM es una forma mínimamente invasiva y fácil de realizar de terapia con láser de bajo nivel que se utiliza para estimular los cromóforos intracelulares. Diferentes longitudes de onda provocan diferentes efectos en las células22. La luz en el rango del rojo al infrarrojo cercano estimula el aumento de la producción de trifosfato de adenosina (ATP) y especies reactivas de oxígeno (ROS) al mejorar el flujo a través de la cadena de transporte de electrones23. La luz en los rangos azul y verde estimula los canales iónicos activados por la luz, lo que permite la afluencia inespecífica de cationes, como el calcio y el magnesio, en las células, lo que se sabe que mejora la diferenciación24. El efecto neto es la generación de mensajeros secundarios que estimulan la transcripción de factores que desencadenan procesos celulares posteriores como la migración, la proliferación y la diferenciación25. El PBM se puede utilizar para preacondicionar las células para que proliferen o se diferencien antes de trasplantarlas a un entorno adverso, por ejemplo, tejido dañado26. La exposición a PBM antes y después del trasplante (630 nm y 810 nm) de ADSC mejoró significativamente la viabilidad y la función de estas células in vivo en un modelo de rata diabética27. La medicina regenerativa requiere un número adecuado de células para la reparación efectiva de los tejidos28. En el cultivo celular 3D, las ADSC se han asociado con tasas de proliferación más lentas en comparación con el cultivo celular bidimensional6. Sin embargo, el PBM se puede utilizar para aumentar el proceso de cultivo celular 3D de las ADSC al mejorar la viabilidad, la proliferación, la migración y la diferenciación29,30.

Protocol

NOTA: Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles relacionados con todos los materiales, reactivos y software utilizados en este protocolo. El protocolo se ha resumido gráficamente en la Figura 1. 1. Cultivo celular bidimensional (2D) NOTA: Los ADSC inmortalizados (1 x106 células) se almacenan a -195,8 °C en nitrógeno líquido en un vial de criopreservación que contiene 1 ml de m…

Representative Results

Para evaluar la morfología e inspeccionar visualmente la densidad celular de los hidrogeles, se utilizó microscopía inversa (Figura 2). Los ADSC conservaron una morfología redondeada 24 h después de la siembra y la exposición a PBM. Las células se dispersaron por todo el gel como células individuales o en racimos similares a uvas. La morfología se mantuvo sin cambios después de 10 días en cultivo 3D. No se observaron diferencias definitivas en la morfología entre los grupos exper…

Discussion

Las ADSC son un tipo de célula ideal para la medicina regenerativa, ya que estimulan varios procesos para ayudar en la cicatrización de heridas 3,4. Sin embargo, hay varios desafíos que deben sortearse, por ejemplo, las bajas tasas de supervivencia y el injerto ineficaz de las células en el sitio de la lesión9. Las células inmortalizadas se utilizaron como una línea celular disponible comercialmente, ya que pueden pasar durante más…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Esta investigación fue financiada por la Fundación Nacional de Investigación de Sudáfrica Thuthuka Instrument, subvención número TTK2205035996; el Centro Africano de Láser (ALC), financiado por el Departamento de Ciencia e Innovación (DSI), número de subvención HLHA23X tarea ALC-R007; el Consejo Universitario de Investigación, subvención número 2022URC00513; la Iniciativa de Cátedras de Investigación de Sudáfrica del Departamento de Ciencia y Tecnología (DST-NRF/SARChI), subvención número 98337. Los organismos financiadores no desempeñaron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación, el análisis, la interpretación de los datos o la redacción del manuscrito. Los autores agradecen a la Universidad de Johannesburgo (UJ) y al Centro de Investigación Láser (LRC) por el uso de las instalaciones y los recursos.

Materials

525 nm diode laser National Laser Centre of South Africa EN 60825-1:2007
825 nm diode laser National Laser Centre of South Africa SN 101080908ADR-1800
96 Well Strip Plates Sigma-Aldrich BR782301
Amphotericin B Sigma-Aldrich A2942 Antibiotic (0.5%; 0.5 mL)
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay Promega G9681 ATP reagent, Proliferation assay Kit
Corning 2 mL External Threaded Polypropylene Cryogenic Vial Corning 430659 cryovial
CryoSOfree Sigma-Aldrich C9249 Cell freezing media
CytoTox96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay Promega G1780 Cytotoxicity reagent
Dulbecco’s Modified Eagle Media Sigma-Aldrich D5796 Basal medium (39 mL/44 mL)
FieldMate Laser Power Meter Coherent 1098297
Flat-bottomed Corning 96 well clear polystyrene plate Sigma-Aldrich CLS3370
Foetal bovine serum Biochrom S0615 Culture medium enrichment (5 mL; 10% / 10 mL; 20%)
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) Sigma-Aldrich H9394 Rinse solution
Heracell 150i CO2 incubator Thermo Scientific 51026280
Heraeus Labofuge 400 Thermo Scientific 75008371 Plate spinner for 96 well plates
Heraeus Megafuge 16R centrifuge ThermoFisher 75004270
Immortalized ADSCs ATCC ASC52Telo hTERT, ATCC SCRC-4000 Passage 37
Invitrogen Countess 3 Invitrogen AMQAX2000 Automated cell counter for Trypan Blue
Julabo TW20 waterbath Sigma-Aldrich Z615501 Waterbath used to warm media to 37 °C
Olympus CellSens Entry Olympus Version 3.2 (23706)  Imaging software: digital image acquisition
Olympus CKX41 Olympus SN9B02019 Inverted light microscope
Olympus SC30 camera Olympus SN57000530 Camera attached to inverted light microscope
Opaque-walled Corning 96 well solid polystyrene microplates Sigma-Aldrich CLS3912 Opaque well used for ATP luminescence
Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich P4333 Antibiotic (0.5%; 0.5 mL)
SigmaPlot 12.0 Systat Software Incorporated
TrueGel3D – True3 Sigma-Aldrich TRUE3-1KT 10 µL
TrueGel3D Enzymatic Cell Recovery Solution Sigma-Aldrich TRUEENZ 01:20
Trypan Blue Stain Thermo Fisher – Invitrogen T10282 0.4% solution
TrypLE Select Enzyme (1x) Gibco 12563029 Cell detachment solution
Victor Nivo Plate Reader Perkin Elmer HH3522019094 Spectrophotometric plate reader

References

  1. Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: Implications for cell-based therapies. Tissue Eng. 7 (2), 211-228 (2001).
  2. Yuan, X., et al. Strategies for improving adipose-derived stem cells for tissue regeneration. Burns Trauma. 10, (2022).
  3. Nilforoushzadeh, M. A., et al. Mesenchymal stem cell spheroids embedded in an injectable thermosensitive hydrogel: An in situ drug formation platform for accelerated wound healing. ACS Biomater Sci Eng. 6 (9), 5096-5109 (2020).
  4. Yang, M., et al. Thermosensitive injectable chitosan/collagen/β-glycerophosphate composite hydrogels for enhancing wound healing by encapsulating mesenchymal stem cell spheroids. ACS Omega. 5 (33), 21015-21023 (2020).
  5. Chimenti, I., et al. Relative roles of direct regeneration versus paracrine effects of human cardiosphere-derived cells transplanted into infarcted mice. Circ Res. 106 (5), 971-980 (2010).
  6. Hassan, W., Dong, Y., Wang, W. Encapsulation and 3d culture of human adipose-derived stem cells in an in-situ crosslinked hybrid hydrogel composed of peg-based hyperbranched copolymer and hyaluronic acid. Stem Cell Res Ther. 4 (2), 32 (2013).
  7. Wu, K. H., Mo, X. M., Han, Z. C., Zhou, B. Stem cell engraftment and survival in the ischemic heart. The Ann Thorac Surg. 92 (5), 1917-1925 (2011).
  8. Lee, K., Silva, E. A., Mooney, D. J. Growth factor delivery-based tissue engineering: General approaches and a review of recent developments. J R Soc Interface. 8 (55), 153-170 (2011).
  9. Koivunotko, E., et al. Angiogenic potential of human adipose-derived mesenchymal stromal cells in nanofibrillated cellulose hydrogel. Biomedicines. 10 (10), 2584 (2022).
  10. Dong, Y., et al. Injectable and tunable gelatin hydrogels enhance stem cell retention and improve cutaneous wound healing. Adv Funct Mater. 27 (24), 1606619 (2017).
  11. Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3d cell culture. Biotechnol Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).
  12. Mantha, S., et al. Smart hydrogels in tissue engineering and regenerative medicine. Materials. 12 (20), 3323 (2019).
  13. Sung, T. -. C., et al. 3D culturing of human adipose-derived stem cells enhances their pluripotency and differentiation abilities. J Mater Sci Technol. 63, 9-17 (2021).
  14. Garg, R. K., et al. Capillary force seeding of hydrogels for adipose-derived stem cell delivery in wounds. Stem Cells Transl Med. 3 (9), 1079-1089 (2014).
  15. Kim, Y. M., et al. Adipose-derived stem cell-containing hyaluronic acid/alginate hydrogel improves vocal fold wound healing. Laryngoscope. 124 (3), E64-E72 (2014).
  16. Dong, Y., et al. Conformable hyaluronic acid hydrogel delivers adipose-derived stem cells and promotes regeneration of burn injury. Acta Biomater. 108, 56-66 (2020).
  17. Truegel3d hydrogel for 3d cell culture. Merck Available from: https://www.sigmaaldrich.com/ZA/en/technical-documents/technical-article/cell-culture-and-cell-culture-analysis/3d-cell-culture/truegel3d (2024)
  18. Braccini, S., Tacchini, C., Chiellini, F., Puppi, D. Polymeric hydrogels for in vitro 3d ovarian cancer modeling. Int J Mol Sci. 23 (6), 3265 (2022).
  19. Mashinchian, O., et al. In vivo transcriptomic profiling using cell encapsulation identifies effector pathways of systemic aging. eLife. 11, e57393 (2022).
  20. Matsushige, C., Xu, X., Miyagi, M., Zuo, Y. Y., Yamazaki, Y. Rgd-modified dextran hydrogel promotes follicle growth in three-dimensional ovarian tissue culture in mice. Theriogenology. 183, 120-131 (2022).
  21. Marx, V. How some labs put more bio into biomaterials. Nat Methods. 16 (5), 365-368 (2019).
  22. Marques, M. M. Photobiomodulation therapy weaknesses. Laser Dent Sci. 6 (3), 131-132 (2022).
  23. Hamblin, M. R. Mechanisms and mitochondrial redox signaling in photobiomodulation. Photochem Photobiol. 94 (2), 199-212 (2018).
  24. Chen, J., et al. Low-level controllable blue LEDs irradiation enhances human dental pulp stem cells osteogenic differentiation via transient receptor potential vanilloid 1. J Photochem Photobiol B. 233, 112472 (2022).
  25. Chang, S. -. Y., Carpena, N. T., Kang, B. J., Lee, M. Y. Effects of photobiomodulation on stem cells important for regenerative medicine. Med Lasers. 9 (2), 134-141 (2020).
  26. Bikmulina, P. Y., et al. Beyond 2d: Effects of photobiomodulation in 3d tissue-like systems. J Biomed Opt. 25 (4), 048001 (2020).
  27. Ahmadi, H., et al. Transplantation of photobiomodulation-preconditioned diabetic stem cells accelerates ischemic wound healing in diabetic rats. Stem Cell Res Ther. 11 (1), 494 (2020).
  28. Mao, A. S., Mooney, D. J. Regenerative medicine: Current therapies and future directions. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (47), 14452-14459 (2015).
  29. De Andrade, A. L. M., et al. Effect of photobiomodulation on the behaviour of mesenchymal stem cells in three-dimensional cultures. Lasers Med Sci. 38 (1), 221 (2023).
  30. Diniz, I. M., et al. Photobiomodulation of mesenchymal stem cells encapsulated in an injectable rhbmp4-loaded hydrogel directs hard tissue bioengineering. J Cell Physiol. 233 (6), 4907-4918 (2018).
  31. Carter, M., Shieh, J. C. . Guide to Research Techniques in Neuroscience. , (2015).
  32. Lutolf, M. P., et al. Synthetic matrix metalloproteinase-sensitive hydrogels for the conduction of tissue regeneration: Engineering cell-invasion characteristics. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (9), 5413-5418 (2003).
  33. Robledo, F., et al. Spheroids derived from the stromal vascular fraction of adipose tissue self-organize in complex adipose organoids and secrete leptin. Stem Cell Res Ther. 14 (1), 70 (2023).
  34. Landry, J., Freyer, J. P., Sutherland, R. M. Shedding of mitotic cells from the surface of multicell spheroids during growth. J Cell Physiol. 106 (1), 23-32 (1981).
  35. Bogacheva, M. S., et al. Differentiation of human pluripotent stem cells into definitive endoderm cells in various flexible three-dimensional cell culture systems: Possibilities and limitations. Front Cell Dev Biol. 9, 726499 (2021).
  36. Chen, X., Thibeault, S. L. Biocompatibility of a synthetic extracellular matrix on immortalized vocal fold fibroblasts in 3-d culture. Acta Biomater. 6 (8), 2940-2948 (2010).
  37. Crous, A., Van Rensburg, M. J., Abrahamse, H. Single and consecutive application of near-infrared and green irradiation modulates adipose derived stem cell proliferation and affect differentiation factors. Biochimie. 196, 225-233 (2022).

Play Video

Cite This Article
Roets, B., Abrahamse, H., Crous, A. Three-Dimensional Cell Culture of Adipose-Derived Stem Cells in a Hydrogel with Photobiomodulation Augmentation. J. Vis. Exp. (206), e66616, doi:10.3791/66616 (2024).

View Video