Isolering og dyrkning af primære humane brystepitelceller
Summary
Denne undersøgelse rapporterer en lettere, tidsbesparende og økonomisk protokol til effektivt at isolere og dyrke primære humane brystepitelceller (HMEC’er) fra små mængder brystvæv. Denne protokol er velegnet til hurtig produktion af primære HMEC’er både til laboratorie- og kliniske anvendelser.
Abstract
Brystkirtlen er en grundlæggende struktur i brystet og spiller en væsentlig rolle i reproduktionen. Humane brystepitelceller (HMEC’er), som er oprindelsescellerne til brystkræft og andre brystrelaterede inflammatoriske sygdomme, har fået betydelig opmærksomhed. Det har dog været en udfordring at isolere og dyrke primære HMEC’er in vitro til forskningsformål på grund af deres meget differentierede, keratiniserede natur og deres korte levetid. Derfor er udvikling af en enkel og effektiv metode til at isolere og dyrke HMEC’er af stor videnskabelig værdi for studiet af brystbiologi og brystrelaterede sygdomme. I denne undersøgelse isolerede vi med succes primære HMEC’er fra små mængder brystvæv ved fordøjelse med en blanding af enzymer kombineret med en indledende kultur i 5 % føtal bovin serum-DMEM indeholdende den Rho-associerede kinase (ROCK) hæmmer Y-27632, efterfulgt af dyrkningsudvidelse i serumfrit keratinocytmedium. Denne tilgang fremmer selektivt væksten af epitelceller, hvilket resulterer i et optimeret celleudbytte. Enkelheden og bekvemmeligheden ved denne metode gør den velegnet til både laboratorie- og klinisk forskning, hvilket skulle give værdifuld indsigt i disse vigtige undersøgelsesområder.
Introduction
Brystkræft er den primære type kræft, der diagnosticeres hos kvinder globalt, og er den primære dødsårsag fra kræft1. Patogenesen af brystkræft er kompleks og involverer flere faktorer såsom genetik, miljø og livsstil. HMEC’er, aktive mælkeproducerende celler, er en af de vigtigste komponenter i brystvæv og er sandsynligvis de oprindelige celler, der er involveret i brystkræftkræft. Derfor har HMEC’er fået mest opmærksomhed fra forskere til undersøgelsen af brystkræft2. Desuden har primære celler evnen til at give en biologisk relevant karakterisering af komplekse cellulære processer på grund af deres bevarelse af genetisk stabilitet, normal morfologi og et mere komplet sæt af grundlæggende cellulære funktioner, der ikke kan opnås med udødeliggjorte cellelinjer3. Derfor er isolering og dyrkning af primære HMEC’er et vigtigt skridt for undersøgelsen af de fleste brystrelaterede sygdomme såsom brystkræft og brystinflammatoriske sygdomme.
På nuværende tidspunkt er der etableret et stabilt og reproducerbart system til isolering, dyrkning og identifikation af brystepitelceller fra rotter, køer, svin og geder 4,5,6,7. Isolering og dyrkning af primære HMEC’er er imidlertid udfordrende på grund af det komplekse mikromiljø og det lave udbytte af celler. I årtier har forskere søgt efter den mest effektive metode til at isolere og dyrke HMEC’er, selvom et dyrkningssystem til HMEC’er blev etableret for næsten 20 år siden. For eksempel udviklede Hammond et al. et serumfrit dyrkningsmedium, hvor HMEC’er voksede effektivt8. For nylig testede Zubeldia-Plazaola et al. fire forskellige isoleringsmetoder ved hjælp af hurtige/langsomme enzymfordøjelsesprocedurer kombineret med sekventiel filtrering eller differentiel centrifugering trin for at opnå HMEC’er9. De fandt ud af, at den langsomme fordøjelsesmetode sammen med differentiel centrifugering er den mest effektive metode til at isolere HMEC’er fra frisk brystvæv. Denne isoleringsmetode kræver dog store stykker væv (40-75 g) og bruger større mængder fordøjelsesenzymer. Deres procedure er kompliceret (mindst tre forskellige centrifugeringer for at opnå forskellige cellefraktioner) samt tidskrævende. Derfor er der stadig behov for en enkel og hurtig metode til effektivt at opnå populationer af HMEC’er fra små mængder brystvæv til forskning og kliniske anvendelser9.
Vores tidligere undersøgelser viste, at tilføjelse af den Rho-associerede kinase (ROCK) hæmmer Y-27632 i det oprindelige dyrkningsmedium kan forenkle processen med at isolere humane hudepidermale celler10, som også med succes er blevet brugt til isolering af tandkødsepitelceller11. Derudover har tidligere forskning udført af Zubeldia-Plazaolas gruppe og Jins gruppe indikeret, at Y-27632 har evnen til at stimulere hurtig og ubegrænset in vitro-vækst af primære epitelceller afledt af brystvæv 9,12. Denne undersøgelse havde til formål at teste, om brug af Y-27632 ville forenkle isoleringen og dyrkningen af HMEC’er, og vi etablerede med succes en enkel og let udført metode til at isolere HMEC’er fra små stykker (1 g) mælkevæv.
Protocol
Representative Results
Discussion
HMEC’er er afgørende for at bevare den anatomiske og funktionelle integritet af brystvæv, og de er nyttige i videnskabelige undersøgelser, kliniske implementeringer og tilknyttede domæner15. Primære epitelceller er en type specialiserede celler, der har begrænsede passager og kortere levetid. Væksten af HMEC’er er imidlertid blevet hæmmet af tekniske begrænsninger, som følgelig har hindret forskningsfremskridt inden for brystkræft og andre inflammatoriske sygdomme relateret til brystet<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra TCM Science and Technology Program i Zhejiang-provinsen, Kina (2017ZA055; 2018ZA036) og videnskabs- og teknologiprojektet i Zunyi, Guizhou-provinsen, Kina (Zunyi City Kehe Support NS (2020) nr. 18) til X. Xu. Forfatterne takker Molecular Biology Laboratory of Youjia (Hangzhou) Biomedical Technology Company for at tilbyde cellekulturtræning.
Materials
| 0.05% Trypsin | Basalmedia | K431010 | For HMECs dissociation |
| 1.5 mL microcentrifuge Tubes | NEST | 081722CK01 | For cell digestion |
| 100 µm mesh filter | Solarbio | 431752 | For HMECs filtration |
| 100 mm Cell Culture Dish | Corning | 430167 | For cell culture |
| 4% paraformaldehyde | solarbio | P1110-100ml | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HMECs |
| 50 mL Centrifuge Tube | Corning | 430829 | For cell centrifugation |
| Cell Strainer | Solarbio | 431752 | Cell filtration |
| Centrifuge | Eppendorf | 5404HN133048 | Cell centrifuge |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 42820906 | For cell incubation |
| Collagenase Type I | Merck | SKU:SCR103 | For HMECs isolation |
| Dispase | Solarbio | CAS:42613-33-2 | For HMECs isolation |
| DMEM | Gibco | 8122622 | Component of neutralization medium |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 2556132P | Component of neutralization medium |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Scientific | 15140-122 | Antibiotics |
| Phosphate buffered solution | Tecono | 20201033 | Washing solution |
| rabbit anti CK7 | abcam | ab68459 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HMECs |
| rabbit anti GATA3 | abcam | ab199428 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HMECs |
| Y-27632 | Solarbio | IY0040 | ROCK inhibitor |
References
- Smolarz, B., Nowak, A. Z., Romanowicz, H. Breast cancer-epidemiology, classification, pathogenesis and treatment (review of literature). Cancers (Basel). 14 (10), 2569 (2022).
- Gudjonsson, T., Adriance, M. C., Sternlicht, M. D., Petersen, O. W., Bissell, M. J. Myoepithelial cells: Their origin and function in breast morphogenesis and neoplasia. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 10 (3), 261-272 (2005).
- Faridi, N., et al. Isolation and characterization of the primary epithelial breast cancer cells and the adjacent normal epithelial cells from iranian women’s breast cancer tumors. Cytotechnology. 70 (2), 625-639 (2018).
- Tovar, E. A., et al. Dissecting the rat mammary gland: Isolation, characterization, and culture of purified mammary epithelial cells and fibroblasts. Bio Protoc. 10 (22), e3818 (2020).
- Jiang, X., Yang, H., Jing, Q., He, X. A "selective secondary tissue attachment" method for isolation and purification of mammary epithelial cells. Acta Histochem. 124 (8), 151972 (2022).
- Bernardini, C., et al. Development of a pig mammary epithelial cell culture model as a non-clinical tool for studying epithelial barrier-a contribution from the imi-conception project. Animals (Basel). 11 (7), 2012 (2021).
- Zhang, D., et al. Transdifferentiation of goat ear fibroblasts into lactating mammary epithelial cells induced by small molecule compounds. Biochem Biophys Res Commun. 573, 55-61 (2021).
- Hammond, S. L., Ham, R. G., Stampfer, M. R. Serum-free growth of human mammary epithelial cells: Rapid clonal growth in defined medium and extended serial passage with pituitary extract. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (17), 5435-5439 (1984).
- Zubeldia-Plazaola, A., et al. Comparison of methods for the isolation of human breast epithelial and myoepithelial cells. Front Cell Dev Biol. 3, 32 (2015).
- Liu, Z., et al. A simplified and efficient method to isolate primary human keratinocytes from adult skin tissue. J Vis Exp. (138), e57784 (2018).
- Xie, Z., et al. Isolation and culture of primary human gingival epithelial cells using y-27632. J Vis Exp. (177), e62978 (2021).
- Jin, L., et al. Characterization of primary human mammary epithelial cells isolated and propagated by conditional reprogrammed cell culture. Oncotarget. 9 (14), 11503-11514 (2018).
- Böcker, W., Hungermann, D., Decker, T. Anatomy of the breast. Pathologe. 30 (1), 6-12 (2009).
- Kouros-Mehr, H., Slorach, E. M., Sternlicht, M. D., Werb, Z. Gata-3 maintains the differentiation of the luminal cell fate in the mammary gland. Cell. 127 (5), 1041-1055 (2006).
- Wang, X., Reagan, M. R., Kaplan, D. L. Synthetic adipose tissue models for studying mammary gland development and breast tissue engineering. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 15 (3), 365-376 (2010).
- Ethier, S. P., Mahacek, M. L., Gullick, W. J., Frank, T. S., Weber, B. L. Differential isolation of normal luminal mammary epithelial cells and breast cancer cells from primary and metastatic sites using selective media. Cancer Res. 53 (3), 627-635 (1993).
- Band, V., Sager, R. Distinctive traits of normal and tumor-derived human mammary epithelial cells expressed in a medium that supports long-term growth of both cell types. Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (4), 1249-1253 (1989).
- Taylor-Papadimitriou, J., Shearer, M., Tilly, R. Some properties of cells cultured from early-lactation human milk. J Natl Cancer Inst. 58 (6), 1563-1571 (1977).
- Wen, J., Zu, T., Zhou, Q., Leng, X., Wu, X. Y-27632 simplifies the isolation procedure of human primary epidermal cells by selectively blocking focal adhesion of dermal cells. J Tissue Eng Regen Med. 12 (2), e1251-e1255 (2018).
- Yin, J., Yu, F. S. Rho kinases regulate corneal epithelial wound healing. Am J Physiol Cell Physiol. 295 (2), C378-C387 (2008).
- Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., Mcbride, A. A. Human keratinocytes are efficiently immortalized by a rho kinase inhibitor. J Clin Invest. 120 (7), 2619-2626 (2010).
- Ścieżyńska, A., et al. Isolation and culture of human primary keratinocytes-a methods review. Exp Dermatol. 28 (2), 107-112 (2019).
- Stenn, K. S., Link, R., Moellmann, G., Madri, J., Kuklinska, E. Dispase, a neutral protease from bacillus polymyxa, is a powerful fibronectinase and type IV collagenase. J Invest Dermatol. 93 (2), 287-290 (1989).
- Ren, H. J., et al. Primary cultures of mouse small intestinal epithelial cells using the dissociating enzyme type I collagenase and hyaluronidase. Braz J Med Biol Res. 50 (5), e5831 (2017).
