ייצוב אוסטאוטומיה של עצם הירך עם קיבוע פלטה באמביסטומה מקסיקנית
Summary
מוצג פרוטוקול לניתוח אוסטאוטומיה של עצם הירך עם שימוש בקיבוע לוחית פנימית באקסולוטלים בוגרים. ההליך יכול לשמש לביצוע מחקרים השוואתיים על התחדשות גפיים וריפוי שברים בדו-חיים ימיים.
Abstract
האקסולוטל (Ambystoma mexicanum) הוא אורגניזם מודל מבטיח לרפואה רגנרטיבית בשל יכולתו יוצאת הדופן לחדש איברים שאבדו או ניזוקו, כולל גפיים, מוח, לב, זנב ועוד. מחקרים על אקסולוטל שופכים אור על מסלולים תאיים ומולקולריים השולטים בהפעלת אבות ושיקום רקמות לאחר פציעה. ידע זה יכול להיות מיושם כדי להקל על ריפוי של פציעות regeneration-incompetent, כגון עצם לא איחוד. בפרוטוקול הנוכחי מתואר ייצוב אוסטאוטומיה של עצם הירך באמצעות מערכת קיבוע לוחית פנימית. ההליך הותאם לשימוש בבעלי חיים ימיים (axolotl, Ambystoma mexicanum). נעשה שימוש באקסולוטלים של ≥20 ס”מ מקצה חוטם לזנב עם עצם הירך המקבילה בגודל עכבר מלא, ותשומת לב מיוחדת הוקדשה למיקום הצלחת וקיבועה, כמו גם לטיפול שלאחר הניתוח. טכניקה כירורגית זו מאפשרת קיבוע עצם סטנדרטי ומיוצב ויכולה להיות שימושית להשוואה ישירה להתחדשות גפיים אקסולוטליות ולמחקרים מקבילים של ריפוי עצם בקרב דו-חיים ויונקים.
Introduction
האקסולוטל (Ambystoma mexicanum) הוא מודל חשוב להתחדשות איברים, כולל הזנב, חוט השדרה, המוח, הלב, הזימים והגפיים 1,2,3,4,5. מחקרים מפורטים של התחדשות גפיים אקסולוטליות חשפו מנגנונים של התמיינות תאים והיווצרות מאגר תאי גזע, בלסטמה, באתר הקטיעה. בשל יכולתם של תאי הבלסטמה לשחזר את כל חלקי הגפיים החסרים, כולל שלד בדוגמת 6,7, האקסולוטל נראה כאורגניזם מודל אטרקטיבי למחקרי ריפוי עצם. לאחרונה, מספר מחקרים התמקדו יותר בביולוגיה של העצם באקסולוטלים, ותיארו מורפולוגיה של השלד, הרכב התא ודינמיקת אוסיפיקציה.
נמצא ביונקים כי תהליך ריפוי העצם בעצמות ארוכות מתרחש באמצעות אוסיפיקציה אנדוכונדרלית ומורכב ממספר שלבים: המטומה, רקמת גרגיר והיווצרות יבלות רכות, אוסיפיקציה של יבלות קשות ועצם ארוגה, ועיצוב מחדש של עצם8. מחקר שנערך לאחרונה הראה כי ניתן לראות שלבים דומים בריפוי עצם אקסולוטלית9.
עד כה, שברים אקסולוטליים נחקרו במערכת לא מיוצבת, שבה עצם פשוט נחתכת עם מספריים iridectomy. השברים הגדולים נוצרו בזאוגופוד, שם מבוצעת אוסטאוטומיה על אחת העצמות, ואילו השנייה משמשת כתמיכה10,11. לעומת זאת, שברים נחקרים באופן שגרתי ביונקים, כולל חולדות ועכברים, באמצעות מערכות קיבוע אמינות, כגון סיכות תוך מדולריות ולוחות יישור עצם, כדי לשלוט בגודל השבר ולהבטיח את יישור העצם.
לפיכך, השיטה נועדה להבטיח קיבוע מיוצב ואחיד של עצם הירך האקסולוטלית לפני אוסטאוטומיה. על מנת להפוך את מחקרי האקסולוטל לדומים יותר ליונקים, כולל עכברים ובני אדם, נלקחו בחשבון פין תוך-מדולרי12, קיבוע לוח חיצוני13,14 וקיבוע לוח יישור עצם פנימי 15,16,17. האחרון הוכח כמבטיח קיבוע עצם תקין ומאפשר יצירת רווח בגודל מסוים באמצעות חתך אחד או שניים עם מסור Gigly בקוטר מסוים. מכיוון שהאקסולוטלים מייצגים את הזחלים הימיים של Ambystoma mexicanum, ייתכן שקיבוע החיצוני גרם לסיבוכים לאחר הניתוח עקב הפצע הפתוח והמגע עם מים. מכיוון שאקסולוטלים אינם מפתחים מרכזי אוסיפיקציה שניוניים אפילו עד שלב מאוחר מאוד בהתפתחותם (גיל20 18), ולכן לא ניתן למנוע מהציפורן התוך-מדולרית הסטנדרטית המשמשת בעכברים לנקב את האפיפיסים, הוחלט ליישם שיטת קיבוע לוחות פנימית על אקסולוטלים גדולים. באקסולוטלים גדולים, גודל עצם הירך ומידת התנודה דומים לאלה של עכבר בוגר, ובכך מאפשרים אוסטאוטומיה דיאפיסיאלית אמצעית עם קיבוע לוחית טיטניום1.
גודל פער השבר קובע במידה רבה את דינמיקת הריפוי ואת תוצאתו. לדוגמה, בעכבר, שברים מיוצבים בקוטר 0.25 מ”מ מתאחים בעיקר באמצעות אוסיפיקציה תוך-ממברנית בשל גודלם הקטן וייצובם הנוקשה; שבר של 0.7 מ”מ מרפא על ידי אוסיפיקציה אנדוכונדרלית, עם היווצרות של יבלת סחוס סביב השבר; פגמים גדולים, כגון פגמים בגודל קריטי של 3.5 מ”מ אינם מחלימים לחלוטין ולכן משמשים למדל שבר עצם ללא איחוד16. במחקר זה, פרוטוקול קיבוע הלוח של עצם הירך האקסולוטלית לפני האוסטאוטומיה באמצעות דוגמה של פער שבר של 0.7 מ”מ נקבע במטרה הסופית להשוות את ריפוי עצם האקסולוטל לזה של עכבר9.
לאחר אוסטאוטומיה עברו השברים תהליך של תנודה אנדוכונדרלית, אם כי איטי יותר מאשר בעכברים, אולי בשל אורח החיים הימי של האקסולוטים וקצב חלוקת התאים האיטי יותר. בשיטה המוצגת כאן, אוסטאוטומיה מרווח 0.7 מ”מ עם קיבוע לוח קשיח מוצג; עם זאת, גדלים מרווחים אחרים וקיבועים גמישים למחצה, כמו גם לוחות מחומרים שונים, אפשריים. בסך הכל, השיטה המוצגת כאן יכולה לשמש לקיבוע עצם סטנדרטי ותהיה מועילה למחקרים המשווים התחדשות גפיים אקסולוטליות לריפוי עצם או לחקר ריפוי עצם באקסולוטלים בתנאים שונים כדי להבטיח קיבוע שבר סטנדרטי.
Protocol
Representative Results
Discussion
השיטה המתוארת כיום של קיבוע לוחית הירך ואוסטאוטומיה מאפשרת את יישומה בבעלי חיים ימיים, כגון Ambystoma mexicanum (axolotl). שיטה כירורגית זו שימשה לאחרונה להשוואת ריפוי שברים והתחדשות גפיים באקסולוטלים לריפוי שברים בעכברים9. כמו בעכברים, ניתן לחבר לוחית קיבוע בעלת 4 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצים להודות לסבין סטומפ על התמיכה הטכנית המצוינת וללידיה גרוסר על הסיוע בניתוחים. מחקר זה מומן על ידי הקרן האוסטרית למדע [מלגת הרטה פירנברג מספר T-1219], ERC [מענק מתקדם, 742046 RegGeneMems], DFG [CRC 1444].
Materials
| 0.66 mm Gigly wire saw | RISystem | RIS.590.120 | |
| 7.0 Optilene suture | Braun | C3090538 | |
| Benzocaine | Sigma-Aldrich | E1501 | dilute to 0.03% prior to using |
| Butorphanol (Butomidor 10 mg/mL) | Richter Pharma AG | – | dilute to 0.5 mg/L prior to using |
| Drill bit 0.30 mm | RISystem | RIS.590.200 | |
| Dumont #5 Forceps – Standard/Inox | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Hand drill | RISystem | RIS.390.130 | better to have at least 3 pieces |
| Micro CT data analyzer | Bruker, Billerica, MA, USA | SkyScan NRecon software | |
| Micro CT specimen scanner | Bruker, Billerica, MA, USA | SkyScan 1172 | |
| Moria MC31b Iris forceps – smooth, curved, 10 cm | Fine Science Tools | 11373-12FST | 2 pieces |
| MouseFix Drill-&Saw guide 1.75 mm, rigid | RISystem | RIS.301.102 | |
| MouseFix plate 4 hole, rigid | RISystem | RIS.401.110 | |
| MouseFix screw, L =2.00 mm | RISystem | RIS.401.100 | need 4 per bone |
| Narrow Pattern Forceps | VWR | FSCI11002-12 | |
| penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Ring forceps | Fine Science Tools | 11103-09 | |
| scalpel #15 | B Braun, Thermo Fischer Scientific | 5518032 | |
| Square box wrench 0.50 mm | RISystem | RIS.590.111 | |
| Sterile bone wax, 2.5 g | Ethicon, Johnson & Johnson | W810 | |
| Student Fine Scissors – Straight/11.5cm | Fine Science Tools | 91460-11 |
References
- Amamoto, R., et al. Adult axolotls can regenerate original neuronal diversity in response to brain injury. Elife. 5, 13998 (2016).
- Butler, E. G., Ward, M. B. Reconstitution of the spinal cord following ablation in urodele larvae. J Exp Zool. 160 (1), 47-65 (1965).
- Echeverri, K., Tanaka, E. M. Ectoderm to mesoderm lineage switching during axolotl tail regeneration. Science. 298 (5600), 1993-1996 (2002).
- Vargas-Gonzalez, A., Prado-Zayago, E., Leon-Olea, M., Guarner-Lans, V., Cano-Martinez, A. Myocardial regeneration in Ambystoma mexicanum after surgical injury. Arch Cardiol Mex. 75 (3), S321-S329 (2005).
- Vieira, W. A., Wells, K. M., McCusker, C. D. Advancements to the axolotl model for regeneration and aging. Gerontology. 66 (3), 212-222 (2020).
- Song, F., Li, B., Stocum, D. L. Amphibians as research models for regenerative medicine. Organogenesis. 6 (3), 141-150 (2010).
- McCusker, C., Bryant, S. V., Gardiner, D. M. The axolotl limb blastema: Cellular and molecular mechanisms driving blastema formation and limb regeneration in tetrapods. Regeneration (Oxf). 2 (2), 54-71 (2015).
- Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. Fracture healing: Mechanisms and interventions). Nat Rev Rheumatol. 11 (1), 45-54 (2015).
- Polikarpova, A., et al. The specialist in regeneration-the Axolotl-a suitable model to study bone healing. NPJ Regen Med. 7 (1), 35 (2022).
- Chen, X., et al. The axolotl fibula as a model for the induction of regeneration across large segment defects in long bones of the extremities. PLoS One. 10 (6), e0130819 (2015).
- Cosden-Decker, R. S., Bickett, M. M., Lattermann, C., MacLeod, J. N. Structural and functional analysis of intra-articular interzone tissue in axolotl salamanders. Osteoarthritis Cartilage. 20 (11), 1347-1356 (2012).
- Williams, J. N., Li, Y., Valiya Kambrath, A., Sankar, U. The generation of closed femoral fractures in mice: A model to study bone healing. J Vis Exp. (138), e58122 (2018).
- Cheung, K. M., et al. An externally fixed femoral fracture model for mice. J Orthop Res. 21 (4), 685-690 (2003).
- Jiang, S., Knapstein, P., Donat, A., Tsitsilonis, S., Keller, J. An optimized protocol for a standardized, femoral osteotomy model to study fracture healing in mice. STAR Protoc. 2 (3), 100798 (2021).
- Matthys, R., Perren, S. M. Internal fixator for use in the mouse. Injury. 40, S103-S109 (2009).
- Manassero, M., et al. Establishment of a segmental femoral critical-size defect model in mice stabilized by plate osteosynthesis. J Vis Exp. (116), e52940 (2016).
- Gunderson, Z. J., Campbell, Z. R., McKinley, T. O., Natoli, R. M., Kacena, M. A. A comprehensive review of mouse diaphyseal femur fracture models. Injury. 51 (7), 1439-1447 (2020).
- Riquelme-Guzman, C., et al. Postembryonic development and aging of the appendicular skeleton in Ambystoma mexicanum. Dev Dyn. 251 (6), 1015-1034 (2022).
- Gentz, E. J., et al. Medicine and surgery of amphibians. ILAR J. 48 (3), 255-259 (2007).
- Lang, A., et al. Collagen I-based scaffolds negatively impact fracture healing in a mouse-osteotomy-model although used routinely in research and clinical application. Acta Biomater. 86, 171-184 (2019).
