Vi presenterer en protokoll for høykapasitetsproduksjon av vaskulære kanaler med fleksible størrelser og ønskede mønstre på en standard seks-brønns plate ved hjelp av 3D-bioprintteknologi, referert til som vessels-on-a-plate (VOP). Denne plattformen har potensial til å fremme utviklingen av terapier for lidelsene forbundet med kompromittert endotel.
Vaskulær permeabilitet er en nøkkelfaktor i utviklingen av terapier for lidelser assosiert med kompromittert endotel, som endoteldysfunksjon i koronararterier og nedsatt funksjon av blod-hjerne-barrieren. Eksisterende fabrikasjonsteknikker replikerer ikke tilstrekkelig den geometriske variasjonen i vaskulære nettverk i menneskekroppen, noe som i vesentlig grad påvirker sykdomsprogresjonen; Dessuten involverer disse teknikkene ofte flertrinns fabrikasjonsprosedyrer som hindrer produksjonen med høy gjennomstrømning som er nødvendig for farmakologisk testing. Denne artikkelen presenterer en bioprinting-protokoll for å lage flere vaskulære vev med ønskede mønstre og størrelser direkte på standard seks-brønns plater, og overvinne eksisterende oppløsnings- og produktivitetsutfordringer innen bioprintteknologi. En forenklet fabrikasjonstilnærming ble etablert for å konstruere seks hule, perfusable kanaler i en hydrogel, som deretter ble foret med humane navleveneendotelceller for å danne et funksjonelt og modent endotel. Den datastyrte naturen til 3D-bioprinting sikrer høy reproduserbarhet og krever færre manuelle fabrikasjonstrinn enn tradisjonelle metoder. Dette fremhever VOPs potensial som en effektiv plattform med høy gjennomstrømning for modellering av vaskulær permeabilitet og fremme legemiddeloppdagelse.
Det vaskulære nettverket i hele menneskekroppen fungerer som en avgjørende transportbarriere ved dynamisk å regulere utvekslingen av molekyler og celler mellom blodet og omkringliggende vev. Denne reguleringen er avgjørende for å forhindre vevsødem og muliggjøre selektiv nærings- og celleutveksling, og dermed støtte vevsmetabolisme og homeostase1. Endret endotelpermeabilitet, en faktor i mange helsetilstander, påvirker både sykdommens alvorlighetsgrad og behandlingseffekt2. Vaskulært endotel fungerer som en selektiv barriere, som letter overføringen mellom kar, vev og organer. Denne reguleringen involverer flere mekanismer, for eksempel grunnleggende filtrering av oppløste stoffer og små molekyler, tilsiktet forstyrrelse av den vaskulære barrieren og påvirkning av molekyler som prostaglandiner og vekstfaktorer på permeabilitetsnivåer3.
Nøkkelfaktorer i denne reguleringen inkluderer endotelcellekryss, migrasjon av leukocytter og funksjonaliteten til blod-hjerne-barrieren4. Gitt kompleksiteten, varierer prosessen på tvers av forskjellige miljøer, involverer ulike blodkartyper og bruker distinkte anatomiske veier. Å forstå det biologiske grunnlaget for vaskulær permeabilitet er avgjørende for å utvikle terapeutiske tilnærminger for å behandle tilstander assosiert med unormal vaskulær permeabilitet. Å opprettholde vaskulær permeabilitet er avgjørende for helsen til det vaskulære systemet og omkringliggende vev; følgelig fører svekkelse av denne funksjonen til endoteldysfunksjon, en tilstand der endotelet mister sin normale funksjonalitet.
Endoteldysfunksjon er en forløper til flere utbredte menneskelige sykdommer, inkludert hypertensjon, koronarsykdom, diabetes og kreft 5,6,7. Denne tilstanden kan presentere seg på flere måter, inkludert redusert vasodilatasjon, økt karpermeabilitet og en tendens til en pro-inflammatorisk tilstand. Denne patologiske tilstanden er det tidligste stadiet av flere kritiske kardiovaskulære problemer, som koronararteriesykdom, hjerneslag og perifer arteriesykdom8, som fortsetter å være de viktigste årsakene til dødelighet i USA1. Endoteldysfunksjon påvirker kardiovaskulær helse så vel som blod-hjerne-barrieren (BBB) og spiller en viktig rolle i utviklingen av ulike nevrologiske lidelser. Dysfunksjon kan øke BBB-permeabiliteten, og dermed tillate giftstoffer, patogener og immunceller å infiltrere i sentralnervesystemet og bidra til nevrologiske lidelser som hjerneslag, Alzheimers sykdom, multippel sklerose og hjerneinfeksjoner9.
Endoteldysfunksjon ved diabetes er preget av endotelets kompromitterte evne til å regulere vaskulær tone og produsere vasodilatatormediatorer, slik som nitrogenoksid, noe som fører til nedsatt vasodilatasjon10. Denne tilstanden forverres av hyperglykemi-induserte veier som proteinkinase C-aktivering og oksidativt stress, noe som bidrar betydelig til progresjonen av diabetisk vaskulær sykdom11. Videre har et inflammatorisk miljø vist seg å forbedre tumorcelleadhesjon til hjernens mikrovaskulære endotelceller, mens et lekk endotel har blitt rapportert å være en viktig faktor i kreftmetastase12,13. Geometrien til blodkar har vist seg å direkte påvirke metastaser av hjernekreft. Tumorceller fester seg fortrinnsvis til områder med større blodkarkrumning7. Dette funnet understreker viktigheten av vaskulær geometri i kreftmetastaser. Enda viktigere, ved tilstander som fibrose og kreft, spiller forstyrret endotelbarrierefunksjon ikke bare en rolle i sykdomsutviklingen, men hindrer også behandlingseffektiviteten ved å hindre tilstrekkelig medikamentlevering14. Forskning på vaskulær permeabilitet er avgjørende for å fremme behandling av hjerte- og karsykdommer og gi innsikt i håndtering av andre sykdommer som involverer kompromittert vaskulær funksjon.
Gitt den avgjørende rollen til vaskulær permeabilitet i helse og sykdom, har betydelig forskning fokusert på å undersøke den selektive naturen til endotelbarrieren for terapeutisk utvikling ved å bruke dyremodeller, sammen med tradisjonelle 2D- og 3D in vitro-testplattformer. Dyremodeller har imidlertid begrensninger på grunn av artsspesifikke forskjeller og etiske problemstillinger, samt høye kostnader15,16. For eksempel uttalte Pfizer i 2004 at de i løpet av de siste 10 årene hadde brukt over 2 milliarder dollar på legemiddelutvikling som viste lovende effekter i dyremodeller, men til slutt mislyktes i avanserte menneskelige testtrinn17. Dessuten etterligner ikke tradisjonelle 2D-modeller nøyaktig den tredimensjonale (3D) arkitekturen og den komplekse geometriske strukturen til vaskulære kanaler.
Med fremskritt innen biofabrikasjonsteknologier har omfattende innsats vært rettet mot å produsere vaskulære kanaler samtidig som 3D-arkitektur rekapituleres. Vaskulære kanaler i mikroskala kan effektivt produseres i mikrofluidiske brikker ved å bruke myk litografi, og gir dermed en fordel med sanntidsanalyse18,19. Alternative metoder, som hydrogelstøping eller innpakning av celleark rundt en form eller dorn, kan brukes til å lage frittstående rørformede strukturer med ønsket diameter20,21. Disse metodene har imidlertid begrensninger; For eksempel er mikrofluidiske brikker begrenset til mikrokanalkonfigurasjoner, og hydrogelstøping rundt en form replikerer ikke effektivt flere geometrier.
Med fremveksten av 3D-bioutskriftsteknologi22 har det blitt mulig å replikere komplekse geometrier ved nøyaktig å avsette forskjellige ekstracellulære matrisebaserte (ECM)-baserte hydrogelmaterialer 23,24. Noen bioprintingsmetoder, for eksempel de som bruker konsentrisk anordnede dyser, for eksempel koaksial og triaksial25,26, kan ikke lage todelte rør; Imidlertid kan komplekse strukturer oppnås med offermønstermetoder27. Ingen av disse bioprintmetodene har vist seg å muliggjøre in vitro-modellering med høy gjennomstrømning – et avgjørende krav for farmakologisk forskning innen legemiddeloppdagelse. Her presenterer vi en metode for effektiv fremstilling av endoteliserte vaskulære kanaler med effektiv kontroll over dimensjoner.
Vi etablerte en enkel tilnærming ved å bruke kommersielt tilgjengelige seks-brønns plater, kombinert med en offermønstermetode der en bioprinter produserer vaskulære kanaler av ønskede størrelser og mønstre i en ECM-hydrogel. Humane navleveneendotelceller (HUVEC) ble sådd for å endotelisere disse kanalene og evaluere funksjonaliteten til endotel gjennom en permeabilitetsanalyse. Denne designen muliggjør pumpeløs perfusjon ved å lage mediereservoarer på begge sider av kanalen og bruker gravitasjonsdrevet strømning ved hjelp av en ofte brukt 2D-vippe for å etterligne den dynamiske kulturen. Denne tilnærmingen eliminerer behovet for peristaltiske pumper og letter skalerbarheten til denne plattformen for applikasjoner med høy gjennomstrømning. Den datastyrte naturen til 3D-bioprintingsteknologi effektiviserer også fabrikasjonsprosessen, og reduserer dermed sannsynligheten for feil under produksjonen. VOP-modellen viser lovende som et verdifullt verktøy for farmakologisk testing i legemiddeloppdagelse.
Ved å dra nytte av presisjonen, automatiseringen og den datastyrte naturen til 3D-bioutskriftsteknologi, etablerte vi en strømlinjeformet metode for å fremstille vaskulære kanaler i standard seks-brønns plater, som ble valgt for deres kompatibilitet med kommersielle mikroplatelesere og mikroskopavbildningsoppsett. Platens design kan romme kanaler i flere størrelser og et tilstrekkelig volum av medier for vekst av større kanaler samtidig som den reduserer den nødvendige frekvensen…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av National Research Foundation of Korea (NRF) tilskudd finansiert av Koreas regjering (departementet for vitenskap og IKT, MSIT) [nr. NRF-2019R1C1C1009606; Nr. 2020R1A5A8018367; og nei. RS-2024-00423107]. Denne forskningen ble støttet av Bio and Medical Technology Development Program av NRF-tilskuddene finansiert av MSIT [nr. NRF-2022M3A9E4017151 og nr. NRF-2022M3A9E4082654]. Dette arbeidet ble støttet av Technology Innovation Program [nr. 20015148] og Alchemist-prosjektet [nr. 20012378] finansiert av departementet for handel, industri og energi (MOTIE, Korea). Dette arbeidet ble også støttet av Korea Institute of Planning and Evaluation for Technology in Food, Agriculture and Forestry (IPET) gjennom Agriculture and Food Convergence Technologies Program for Research Manpower development, finansiert av departementet for landbruk, mat og landlige anliggender (MAFRA) [nr. RS-2024-00397026].
10 mL Serological Pipette | SPL | SPL 91010 | |
10 mL syringe | Shinchang Medical | ||
15 mL conical tube | SPL | 50015 | |
3D Bioprinter | T&R Biofab | 3DX-Printer | |
6-well plate | SPL | 37206 | |
Biological Safety Cabinets | CHC LAB | PCHC-777A2-04, | |
Brightfield Inverted Microscopes | Leica | DMi1 | |
Cell Counting Kit (CCK8) | GlpBio | GK10001 | |
Cell Counting Kit (CCK8) | GlpBio | GK10001 | |
Cell Culture Flask 75T | SPL | 70075 | |
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, LDEV-free, 10 mL | Corning | 354230 | |
Distilled water | |||
DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
DMSO, Cell Culture Grade | Sigma aldrich | D2438 | |
Dow-Corning, PDMS-Sylgard 184a Kit | DOW | DC-184 | |
DOWSIL SE 1700 Clear W/C 1.1 KG Kit | DOW | 2924404 | |
D-PBS – 1x | Welgene | LB001-01 | |
Endothelial Cell Growth Medium MV 2 (Ready to use) | Promocell | C-22022 | |
Eppendorf Micro pipette(1000,200,100,20,10) | eppendorf | ||
Ethyl Alcohol 99.9% | Duksan | D5 | |
Excel | Microsoft | ||
Fibrinogen from bovine plasma | Sigma Aldrich | F8630-1G | |
FITC Dextran 70 kDa | Sigma Aldrich | 46945-100MG-F | |
Fluorescent beads (1.0 μm, green) | Sigma Aldrich | L1030-1ML | |
GelMA-powder (Gelatin methacrylate) 50 g | 3D Materials | 20JT29 | |
Gibco, Recovery Cell Culture Freezing Medium, 50 mL | Gibco | ||
HUVECs (Human Umbillical Vein Endothelial Cells) | Promocell | ||
ImageJ software | NIH | ||
Incubator | Thermo SCIENTIFIC | Forma STERI-CYCLE i160 CO2 Incubator | |
Invitrogen, Live/dead viability/cytotoxicity Kit (for mammalian cells) | Thermo Fisher | L3224 | |
Lithium Phenyl (2,4,6-trimethylbenzoyl) phosphate powder | Tokoyo Chemical Industry CO. | 85073-19-4 | |
Marienfeld Superior, Counting chamber cover | Marienfeld Superior | ||
Marienfeld Superior, Hemocytometer, cell counting chamber | Marienfeld Superior | HSU-0650030 | |
Microcentrifuge | eppendorf | Centrifuge 5920 R | |
NCViewer.com | |||
Nitrogen tank | WORTHINGTON INDUSTRIES | LS750 | |
Omnicure UV Laser | EXCELITAS | SERIES 1500 | |
Parafilm M | amcor | PM-996 | |
Penicillin-Streptomycin Solution (100x) | GenDEPOT | CA005-010 | |
Planetary Mixer | THINKY CORPORATION, japan | ARE-310 | |
Plasma treatment machine | FEMTO SCIENCE | CUTE-1MPR | |
Pluronic F-127 | Sigma aldrich | P2443-250G | |
Pre-made buffer, (P2007-1) 10x PBS | Biosesang | PR4007-100-00 | |
Reagent storage cabinet | ZIO FILTER TECH | SC2-30F-1306D1-BC | |
Real time Live cell Imaging Microscope | Carl ZEISS | ||
Refrigerator | SAMSUNG | RT50K6035SL | |
ROCKER 2D digital | IKA | 4003000 | |
Scoop-Spatula | CacheBy | SL-SCO7001-EA | |
sigma,Trypsin-EDTA solition, 0.25% | Sigma aldrich | T4049-100ML | |
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Thermo Fisher scientific | 151-21-3 | |
Syringe Barrel Tip Cap | FISNAR | 3051806 | |
Tally counter | Control Company | C23-147-050 | |
Tapered Nozzle (18 G) | Mushashi | TPND-18G-U | |
Tapered Nozzle (22 G) | Mushashi | TPND-22G-U | |
Tapered nozzle 20 G | Musashi | TPND-20G-U | |
Thrombin from bovine plasma | Sigma Aldrich | T7326-1KU | |
Timer, 4-channel | ETL | SL.Tim3005 | |
Trypan Blue Solution 0.4% | Gibco | 15250061 | |
Trypsin Neutralizing Solution | Promocell | C-41120 | |
UG 24 mL UG ointment jar | Yamayu | No. 3-53 | |
UG 58 mL UG ointment jar | Yamayu | No. 3-55 | |
Water Bath | DAIHAN Scientific | WB-11 | |
Weight machine | Sartorius | bce2241-1skr |