Denne protokol beskriver blod- og urinprøvetagning til måling af progesteron/østradiol og choriongonadotropinniveauer for at bestemme ovariecyklusstadiet. Hormonniveauerne bruges til at forudsige og bestemme tidspunktet for ægløsning, og hormoner injiceres for at regulere æggestokkenes cyklus og oocytvækst.
Silkeaber er små aber fra den nye verden. Da mange af deres biologiske mekanismer ligner menneskers, er silkeaber potentielt nyttige til medicinsk og menneskelig biologisk forskning på tværs af en række områder, såsom neurovidenskab, regenerativ medicin og udvikling. Der mangler dog litteratur, der beskriver metoder til mange grundlæggende eksperimenter og procedurer. Her beskrives detaljerede metoder til bestemmelse af niveauerne af kønshormoner (progesteron, østradiol og choriongonadotropin) i silkeaber. Målingen af disse hormoner gør det muligt at forudsige stadiet i æggestokkenes cyklus, som typisk er 26-30 dage hos silkeaber; Nøjagtig bestemmelse er afgørende for høsten af oocytter/zygoter på det korrekte tidspunkt og for forberedelsen af værtshunnerne til generering af genetisk modificerede silkeaber.
Derudover er måling af kønshormonniveauer nyttig til endokrinologi, etologi, tidlig udvikling og reproduktionsbiologiske undersøgelser. Denne protokol giver en detaljeret beskrivelse af metoderne til blodprøvetagning fra lårbensvenen, adskillelse af plasma til hormonmåling, måling af choriongonadotropinniveauer ved hjælp af urin og plasma, nulstilling af ovariecyklussen ved hjælp af injektioner af en prostaglandin F2α-analog for at forkorte og synkronisere cyklussen og fremme follikulær vækst og ægløsning ved at injicere follikelstimulerende hormon og choriongonadotropin. Ved hjælp af disse protokoller kan stadierne i ovariecyklussen bestemmes for rettidig indsamling af oocytter/zygoter.
Den almindelige silkeabe (Callithrix jacchus) er en lille abe fra den nye verden med mange egenskaber, der ligner menneskers, og varigheden af dens ovariecyklus er 26-30 dage 1,2. Undersøgelser af den tidlige udvikling og generering af genetisk modificerede silkeaber kræver høst af oocytter og zygoter på bestemte stadier i ovariecyklussen. Således er nøjagtig bestemmelse af stadiet afgørende og kan estimeres ved at måle blodniveauerne af hormonerne progesteron (P4) og østradiol (E2)2,3. Disse hormoner fremmer endometrievækst, hvilket er nødvendigt for implantation. P4 produceres af corpus luteum, som dannes i æggestokkene umiddelbart efter ægløsning. E2 udskilles af æggestokkenes follikler som reaktion på follikelstimulerende hormon (FSH) fra hypothalamus-hypofysekomplekset i hjernen. E2-niveauer stiger, efterhånden som folliklen modnes, og topper før ægløsning3. Høje E2-niveauer forårsager pulserende frigivelse af luteiniserende hormon (LH) via hypothalamus-hypofysekomplekset hos mennesker; denne LH-stigning inducerer ægløsning. Men hos silkeaber gennemgik LH-genet degeneration under evolutionen, og ægløsning induceres i stedet af frigivelsen af choriongonadotropin (CG), som har en lignende struktur som LH’s, fra hypofysen 4,5.
Æggestokkenes cyklus kan kontrolleres ved hormoninjektioner. FSH-injektioner hos mennesker virker på FSH-receptorer i æggestokkene og bruges til at fremme østrogensyntese og follikelvækst6. Injektion af human CG (hCG) som erstatning for LH i slutningen af follikulærfasen bruges til at stimulere ægløsning hos mennesker7. CG-injektioner bruges også til at behandle human infertilitet, fordi CG stimulerer corpus luteum tidligt i graviditeten, hvilket resulterer i øget P4-produktion. Prostaglandin F2α (PGF2α) injektioner nulstiller ovariecyklussen8. Hos tamkvæg bruges PGF2α-injektion til at forkorte lutealfasen og synkronisere brunstcyklussen til reproduktiv styring.
Selvom silkeaber og mennesker har lignende biologiske mekanismer, hvilket gør dem til ideelle modeldyr, mangler der litteratur, der beskriver grundlæggende metoder for mange ofte anvendte teknikker. Blodprøvetagning er en af de mest anvendte teknikker 9,10,11,12. Begyndere har dog nogle gange problemer med at finde venen. Derfor udførte denne undersøgelse anatomiske analyser af lårbensveneregionen. Baseret på anatomiske observationer introducerer denne protokol den proksimale region af lårbenstrekanten som et let sted for venepunktur.
Lokalisering af venen er det mest kritiske trin i blodopsamlingen. Baseret på anatomiske observationer introducerer denne protokol det proksimale område i lårbenstrekanten som et let sted for blodopsamling hos silkeaber. Ved hjælp af dette område kan blodprøvetagning fra en stor vene let udføres. Men selv ved hjælp af denne protokol opstår der undertiden skade på en arterie. Når du skader en arterie, foreslås fuldstændig stop af blødning ved at påføre tryk i >5 minutter f…
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke Chunshen Shen, Hiroko Akutsu, Fumiyo Sugiki, Yuuna Hashimoto, Hina Naritomi, Yuuki Sakamoto og Mikiko Horigome for deres støtte til at etablere denne protokol og i den daglige pleje af silkeaber; Takayuki Mineshige for kommentarer til manuskriptet; Yukiko Abe og medlemmerne af Aiba lab for at dele zygoteindsamlingsteknikker; CIEA for at dele oplysninger om silkeaber og eksperimenter, som de har dyrket gennem 40 år. Denne forskning blev støttet af AMED, JST og KAKENHI under bevillingsnr. JP19gm6310010, JP20gm6310010, JP21gm6310010 og JP22gm6310010 (AMED), JPMJPR228B (JST), 20H05764, 20H03177 og 22K18356 (KAKENHI).
AIA-360 | Tosoh Corporation | 0019945 | Hormone measurement (P4/E2) |
AIA-PACK DILUENT CONCENTRATE | Tosoh Corporation | 0020956 | Hormone measurement (P4/E2) |
AIA-PACK SUBSTRATE SET II | Tosoh Corporation | 0020968 | Hormone measurement (P4/E2) |
AIA-PACK WASH CONCENTRATE | Tosoh Corporation | 0020955 | Hormone measurement (P4/E2) |
CMS-1 | CLEA Japan | Marmoset food | |
Estrumate | MSD Animal Health | PGF2alpha analog (cloprostenol) | |
Gonal-f Subcutaneous Injection 150 | Merck Biopharma Co., Ltd. | FSH | |
Gonatropin for intramuscular injection 1000 | ASKA Pharmaceutical Co., Ltd. | 872413 | hCG |
Heparin sodium injection solution 5,000 units/5 mL | Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. | 224122458 | Blood collection |
Immunochromatographic Test Kit for Detection of Common Marmoset Chorionic Gonadotropin (Dual Checker) | CLEA Japan, Inc. | Determining CG level | |
Low-profile double-arm microscope illumination LPF-SD | SHIOKAZE GIKEN | Desk lamp for blood collection | |
Marmoset blood collection restraint device | JIC Japan | JM-1006 | Blood collection http://www.jic-japan.jp/prd/marmoset/prd016.html email: vi@jic-japan.jp |
Metacam 0.05% | Boehringer Ingelheim Animal Health Japan Co., Ltd. | Hematoma treatment | |
Sample Cup, 3 mL, PS, for Tosoh 360 and AIA-600 II, 1000/Bag | Globe Scientific | 110913 | Hormone measurement (P4/E2) |
ST AIA-PACK iE2 | Tosoh Corporation | 0025224 | Hormone measurement (P4/E2) |
ST AIA-PACK iE2 CALIBRATOR SET | Tosoh Corporation | 0025324 | Hormone measurement (P4/E2) |
ST AIA-PACK iE2 SAMPLE DILUTING SOLUTION | Tosoh Corporation | 0025524 | Hormone measurement (P4/E2) |
ST AIA-PACK PROGIII | Tosoh Corporation | 0025240 | Hormone measurement (P4/E2) |
ST AIA-PACK PROGIII CALIBRATOR SET | Tosoh Corporation | 0025340 | Hormone measurement (P4/E2) |
ST AIA-PACK PROGIII SAMPLE DILUTING SOLUTION | Tosoh Corporation | 0025540 | Hormone measurement (P4/E2) |
Syringe with 25 G (0.50 x 25 mm) needle | TERUMO | SS-01T2525 | Blood collection |
Tensolvet 5.000 I.E. gel. | Dechra Pharmaceuticals | 14033492 | Hematoma treatment |
TOSOH MULTI-CONTROL SET | Tosoh Corporation | 0015965 | Hormone measurement (P4/E2) |