Summary

Blodprøvetagning og hormonmåling til bestemmelse af stadiet i æggestokkecyklussen hos silkeaber

Published: July 05, 2024
doi:

Summary

Denne protokol beskriver blod- og urinprøvetagning til måling af progesteron/østradiol og choriongonadotropinniveauer for at bestemme ovariecyklusstadiet. Hormonniveauerne bruges til at forudsige og bestemme tidspunktet for ægløsning, og hormoner injiceres for at regulere æggestokkenes cyklus og oocytvækst.

Abstract

Silkeaber er små aber fra den nye verden. Da mange af deres biologiske mekanismer ligner menneskers, er silkeaber potentielt nyttige til medicinsk og menneskelig biologisk forskning på tværs af en række områder, såsom neurovidenskab, regenerativ medicin og udvikling. Der mangler dog litteratur, der beskriver metoder til mange grundlæggende eksperimenter og procedurer. Her beskrives detaljerede metoder til bestemmelse af niveauerne af kønshormoner (progesteron, østradiol og choriongonadotropin) i silkeaber. Målingen af disse hormoner gør det muligt at forudsige stadiet i æggestokkenes cyklus, som typisk er 26-30 dage hos silkeaber; Nøjagtig bestemmelse er afgørende for høsten af oocytter/zygoter på det korrekte tidspunkt og for forberedelsen af værtshunnerne til generering af genetisk modificerede silkeaber.

Derudover er måling af kønshormonniveauer nyttig til endokrinologi, etologi, tidlig udvikling og reproduktionsbiologiske undersøgelser. Denne protokol giver en detaljeret beskrivelse af metoderne til blodprøvetagning fra lårbensvenen, adskillelse af plasma til hormonmåling, måling af choriongonadotropinniveauer ved hjælp af urin og plasma, nulstilling af ovariecyklussen ved hjælp af injektioner af en prostaglandin F2α-analog for at forkorte og synkronisere cyklussen og fremme follikulær vækst og ægløsning ved at injicere follikelstimulerende hormon og choriongonadotropin. Ved hjælp af disse protokoller kan stadierne i ovariecyklussen bestemmes for rettidig indsamling af oocytter/zygoter.

Introduction

Den almindelige silkeabe (Callithrix jacchus) er en lille abe fra den nye verden med mange egenskaber, der ligner menneskers, og varigheden af dens ovariecyklus er 26-30 dage 1,2. Undersøgelser af den tidlige udvikling og generering af genetisk modificerede silkeaber kræver høst af oocytter og zygoter på bestemte stadier i ovariecyklussen. Således er nøjagtig bestemmelse af stadiet afgørende og kan estimeres ved at måle blodniveauerne af hormonerne progesteron (P4) og østradiol (E2)2,3. Disse hormoner fremmer endometrievækst, hvilket er nødvendigt for implantation. P4 produceres af corpus luteum, som dannes i æggestokkene umiddelbart efter ægløsning. E2 udskilles af æggestokkenes follikler som reaktion på follikelstimulerende hormon (FSH) fra hypothalamus-hypofysekomplekset i hjernen. E2-niveauer stiger, efterhånden som folliklen modnes, og topper før ægløsning3. Høje E2-niveauer forårsager pulserende frigivelse af luteiniserende hormon (LH) via hypothalamus-hypofysekomplekset hos mennesker; denne LH-stigning inducerer ægløsning. Men hos silkeaber gennemgik LH-genet degeneration under evolutionen, og ægløsning induceres i stedet af frigivelsen af choriongonadotropin (CG), som har en lignende struktur som LH’s, fra hypofysen 4,5.

Æggestokkenes cyklus kan kontrolleres ved hormoninjektioner. FSH-injektioner hos mennesker virker på FSH-receptorer i æggestokkene og bruges til at fremme østrogensyntese og follikelvækst6. Injektion af human CG (hCG) som erstatning for LH i slutningen af follikulærfasen bruges til at stimulere ægløsning hos mennesker7. CG-injektioner bruges også til at behandle human infertilitet, fordi CG stimulerer corpus luteum tidligt i graviditeten, hvilket resulterer i øget P4-produktion. Prostaglandin F2α (PGF2α) injektioner nulstiller ovariecyklussen8. Hos tamkvæg bruges PGF2α-injektion til at forkorte lutealfasen og synkronisere brunstcyklussen til reproduktiv styring.

Selvom silkeaber og mennesker har lignende biologiske mekanismer, hvilket gør dem til ideelle modeldyr, mangler der litteratur, der beskriver grundlæggende metoder for mange ofte anvendte teknikker. Blodprøvetagning er en af de mest anvendte teknikker 9,10,11,12. Begyndere har dog nogle gange problemer med at finde venen. Derfor udførte denne undersøgelse anatomiske analyser af lårbensveneregionen. Baseret på anatomiske observationer introducerer denne protokol den proksimale region af lårbenstrekanten som et let sted for venepunktur.

Protocol

Alle metoder, der involverer silkeaber, anvendte høje etiske og velfærdsstandarder og blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee ved National Center for Child Health and Development. Dyr, der blev brugt her, var enkelt- eller parhusede (en hun og en han) med 12 timers lys om dagen. 1. Blodprøvetagning af lårbensvenen Forbered en 1 ml sprøjte (den korte type er nem at bruge) med en 25 G kanyle fastgjort med blad…

Representative Results

Detaljer relateret til de dyr, der blev brugt i denne undersøgelse, er anført i tabel 1. Anatomiske analyser af lårbensvenenAnatomiske analyser af lårbensvenen blev udført med en 2-årig hansilkeabe (I 7713M), der blev aflivet. Lårbensvenerne og arterierne er placeret i lårbenstrekanten. Lårbenstrekanten dannes ved grænserne mellem bugvæggen og lårmusklerne (figur 1B-D</stro…

Discussion

Lokalisering af venen er det mest kritiske trin i blodopsamlingen. Baseret på anatomiske observationer introducerer denne protokol det proksimale område i lårbenstrekanten som et let sted for blodopsamling hos silkeaber. Ved hjælp af dette område kan blodprøvetagning fra en stor vene let udføres. Men selv ved hjælp af denne protokol opstår der undertiden skade på en arterie. Når du skader en arterie, foreslås fuldstændig stop af blødning ved at påføre tryk i >5 minutter f…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi vil gerne takke Chunshen Shen, Hiroko Akutsu, Fumiyo Sugiki, Yuuna Hashimoto, Hina Naritomi, Yuuki Sakamoto og Mikiko Horigome for deres støtte til at etablere denne protokol og i den daglige pleje af silkeaber; Takayuki Mineshige for kommentarer til manuskriptet; Yukiko Abe og medlemmerne af Aiba lab for at dele zygoteindsamlingsteknikker; CIEA for at dele oplysninger om silkeaber og eksperimenter, som de har dyrket gennem 40 år. Denne forskning blev støttet af AMED, JST og KAKENHI under bevillingsnr. JP19gm6310010, JP20gm6310010, JP21gm6310010 og JP22gm6310010 (AMED), JPMJPR228B (JST), 20H05764, 20H03177 og 22K18356 (KAKENHI).

Materials

AIA-360 Tosoh Corporation 0019945 Hormone measurement (P4/E2)
AIA-PACK DILUENT CONCENTRATE Tosoh Corporation 0020956 Hormone measurement (P4/E2)
AIA-PACK SUBSTRATE SET II Tosoh Corporation 0020968 Hormone measurement (P4/E2)
AIA-PACK WASH CONCENTRATE Tosoh Corporation 0020955 Hormone measurement (P4/E2)
CMS-1 CLEA Japan Marmoset food
Estrumate MSD Animal Health PGF2alpha analog (cloprostenol)
Gonal-f Subcutaneous Injection 150 Merck Biopharma Co., Ltd. FSH
Gonatropin for intramuscular injection 1000 ASKA Pharmaceutical Co., Ltd. 872413 hCG
Heparin sodium injection solution 5,000 units/5 mL Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. 224122458 Blood collection
Immunochromatographic Test Kit for Detection of Common Marmoset Chorionic Gonadotropin (Dual Checker) CLEA Japan, Inc. Determining CG level
Low-profile double-arm microscope illumination LPF-SD SHIOKAZE GIKEN Desk lamp for blood collection
Marmoset blood collection restraint device JIC Japan JM-1006 Blood collection
http://www.jic-japan.jp/prd/marmoset/prd016.html
email: vi@jic-japan.jp
Metacam 0.05% Boehringer Ingelheim Animal Health Japan Co., Ltd. Hematoma treatment
Sample Cup, 3 mL, PS, for Tosoh 360 and AIA-600 II, 1000/Bag Globe Scientific 110913 Hormone measurement (P4/E2)
ST AIA-PACK iE2 Tosoh Corporation 0025224 Hormone measurement (P4/E2)
ST AIA-PACK iE2 CALIBRATOR SET Tosoh Corporation 0025324 Hormone measurement (P4/E2)
ST AIA-PACK iE2 SAMPLE DILUTING SOLUTION Tosoh Corporation 0025524 Hormone measurement (P4/E2)
ST AIA-PACK PROGIII Tosoh Corporation 0025240 Hormone measurement (P4/E2)
ST AIA-PACK PROGIII CALIBRATOR SET Tosoh Corporation 0025340 Hormone measurement (P4/E2)
ST AIA-PACK PROGIII SAMPLE DILUTING SOLUTION Tosoh Corporation  0025540 Hormone measurement (P4/E2)
Syringe with 25 G (0.50 x 25 mm) needle TERUMO SS-01T2525 Blood collection
Tensolvet 5.000 I.E. gel. Dechra Pharmaceuticals 14033492 Hematoma treatment
TOSOH MULTI-CONTROL SET Tosoh Corporation 0015965 Hormone measurement (P4/E2)

References

  1. Kholkute, S. D. Plasma progesterone levels throughout the ovarian cycle of the common marmoset (Callithrix jacchus). Primates. 25 (1), 123-126 (1984).
  2. Harding, R. D., Hulme, M. J., Lunn, S. F., Henderson, C., Aitken, R. J. Plasma progesterone levels throughout the ovarian cycle of the common marmoset (Callithrix jacchus). J Med Primatol. 11 (1), 43-51 (1982).
  3. Gilchrist, R. B., Wicherek, M., Heistermann, M., Nayudu, P. L., Hodges, J. K. Changes in follicle-stimulating hormone and follicle populations during the ovarian cycle of the common marmoset. Biol Reprod. 64 (1), 127-135 (2001).
  4. Gromoll, J., et al. A new subclass of the luteinizing hormone/chorionic gonadotropin receptor lacking exon 10 messenger RNA in the New World monkey (Platyrrhini) lineage. Biol Reprod. 69 (1), 75-80 (2003).
  5. Müller, T., et al. Chorionic gonadotrophin beta subunit mRNA but not luteinising hormone beta subunit mRNA is expressed in the pituitary of the common marmoset (Callithrix jacchus). J Mol Endocrinol. 32 (1), 115-128 (2004).
  6. Pacchiarotti, A., et al. Ovarian stimulation protocol in IVF: an up-to-date review of the literature. Curr Pharm Biotechnol. 17 (4), 303-315 (2016).
  7. Ezcurra, D., Humaidan, P. A review of luteinising hormone and human chorionic gonadotropin when used in assisted reproductive technology. Reprod Biol Endocrinol. 12, 95 (2014).
  8. Lopez-Gatius, F. Ovarian response to prostaglandin F(2alpha) in lactating dairy cows: A clinical update. J Reprod Dev. 68 (2), 104-109 (2022).
  9. Marini, R. P., Wachtman, L. M., Tardif, S. D., Mansfield, K., Fox, J. G. . The Common Marmoset in Captivity and Biomedical Research. , (2018).
  10. Schultz-Darken, N. J. Sample collection and restraint techniques used for common marmosets (Callithrix jacchus). Comp Med. 53 (4), 360-363 (2003).
  11. Hopper, J., Kubik, M. Common marmosets. Handbook of Exotic Pet. , 27-42 (2020).
  12. Harlow, C. R., Hearn, J. P., Hodges, J. K. Ovulation in the marmoset monkey: endocrinology, prediction and detection. J Endocrinol. 103 (1), 17-24 (1984).
  13. Ludlage, E., Mansfield, K. Clinical care and diseases of the common marmoset (Callithrix jacchus). Comp Med. 53 (4), 369-382 (2003).
  14. Summers, P. M., Wennink, C. J., Hodges, J. K. Cloprostenol-induced luteolysis in the marmoset monkey (Callithrix jacchus). J Reprod Fertil. 73 (1), 133-138 (1985).
  15. Takahashi, T., et al. Birth of healthy offspring following ICSI in in vitro-matured common marmoset (Callithrix jacchus) oocytes. PLoS One. 9 (4), e95560 (2014).
  16. Tomioka, I., Takahashi, T., Shimada, A., Yoshioka, K., Sasaki, E. Birth of common marmoset (Callithrix jacchus) offspring derived from in vitro-matured oocytes in chemically defined medium. Theriogenology. 78 (7), 1487-1493 (2012).
  17. Abe, Y., et al. Efficient marmoset genome engineering by autologous embryo transfer and CRISPR/Cas9 technology. Sci Rep. 11 (1), 20234 (2021).
  18. Summers, P. M., Shephard, A. M., Taylor, C. T., Hearn, J. P. The effects of cryopreservation and transfer on embryonic development in the common marmoset monkey, Callithrix jacchus. J Reprod Fertil. 79 (1), 241-250 (1987).
  19. Thomson, J. A., Kalishman, J., Hearn, J. P. Nonsurgical uterine stage preimplantation embryo collection from the common marmoset. J Med Primatol. 23 (6), 333-336 (1994).
  20. Hanazawa, K., et al. Minimally invasive transabdominal collection of preimplantation embryos from the common marmoset monkey (Callithrix jacchus). Theriogenology. 78 (4), 811-816 (2012).
  21. Ishibashi, H., et al. Efficient embryo transfer in the common marmoset monkey (Callithrix jacchus) with a reduced transfer volume: a non-surgical approach with cryopreserved late-stage embryos. Biol Reprod. 88 (5), 115 (2013).
  22. Kishimoto, K., et al. Establishment of novel common marmoset embryonic stem cell lines under various conditions. Stem Cell Res. 53, 102252 (2021).
  23. Diehl, K. H., et al. A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. J Appl Toxicol. 21 (1), 15-23 (2001).
  24. Daskalaki, M., Drummer, C., Behr, R., Heistermann, M. The use of alfaxalone for short-term anesthesia can confound serum progesterone measurements in the common marmoset: a case report. Primate Biol. 9 (2), 23-28 (2022).
  25. Hodges, J. K., Cottingham, P. G., Summers, P. M., Liang, Y. N. Controlled ovulation in the marmoset monkey (Callithrix jacchus) with human chorionic gonadotropin following prostaglandin-induced luteal regression. Fertil Steril. 48 (2), 299-305 (1987).
  26. Barrett, J., Abbott, D. H., George, L. M. Extension of reproductive suppression by pheromonal cues in subordinate female marmoset monkeys, Callithrix jacchus. J Reprod Fertil. 90 (2), 411-418 (1990).
  27. Barrett, J., Abbott, D. H., George, L. M. Sensory cues and the suppression of reproduction in subordinate female marmoset monkeys, Callithrix jacchus. J Reprod Fertil. 97 (1), 301-310 (1993).

Play Video

Cite This Article
Takahashi, S., Watanabe, T. Blood Sampling and Hormone Measurement for Determining the Stage in the Ovarian Cycle in Marmosets. J. Vis. Exp. (209), e66691, doi:10.3791/66691 (2024).

View Video