Summary

Transfeksjon av en molekylær klon av Naegleria gruberi rDNA til N. gruberi Trophozoites

Published: June 21, 2024
doi:

Summary

Denne protokollen beskriver en metodikk for å transfektere Naegleria gruberi trofozoitter med en konstruksjon som opprettholdes gjennom passerende trofozoitter in vitro, så vel som gjennom encystment og ekscystment.

Abstract

Alle ribosomale gener av Naegleria trophozoites opprettholdes i et lukket sirkulært ekstrakromosomal ribosomalt DNA (rDNA) som inneholder element (CERE). Selv om lite er kjent om CERE, viser en fullstendig genomsekvensanalyse av tre Naegleria-arter tydelig at det ikke er noen rDNA-cistroner i kjernegenomet. Videre har en enkelt DNA-opprinnelse til replikasjon blitt kartlagt i N. gruberi CERE, noe som støtter hypotesen om at CERE replikerer uavhengig av kjernegenomet. Denne CERE-karakteristikken antyder at det kan være mulig å bruke konstruert CERE for å introdusere fremmede proteiner i Naegleria-trofozoitter . Som det første trinnet i å utforske bruken av en CERE som vektor i Naegleria, utviklet vi en protokoll for å transfektere N. gruberi med en molekylær klon av N. gruberi CERE klonet til pGEM7zf+ (pGRUB). Etter transfeksjon ble pGRUB lett påvist i N. gruberi trophozoites i minst syv passasjer, samt gjennom encystment og ekscystment. Som en kontroll ble trofozoitter transfektert med ryggradsvektoren, pGEM7zf+, uten N. gruberi-sekvensene (pGEM). pGEM ble ikke påvist etter den første passasjen etter transfeksjon til N. gruberi, noe som indikerer dens manglende evne til å replikere i en eukaryot organisme. Disse studiene beskriver en transfeksjonsprotokoll for Naegleria-trofozoitter og viser at den bakterielle plasmidsekvensen i pGRUB ikke hemmer vellykket transfeksjon og replikasjon av den transfekterte CERE-klonen. Videre vil denne transfeksjonsprotokollen være avgjørende for å forstå den minimale sekvensen av CERE som driver replikasjonen i trofozoitter, samt identifisere regulatoriske regioner i den ikke-ribosomale sekvensen (NRS).

Introduction

Naegleria-slekten inneholder over 45 arter, selv om det er usannsynlig at alle medlemmer av arten har blitt identifisert1. Naegleria kan eksistere i forskjellige former: som trofozoitter (amøber), som flagellater, eller, når ressursene er sterkt begrenset, som cyster 1,2,3,4. Naegleria-slekten er anerkjent for sin ene spesielt farlige art, Naegleria fowleri, kjent som ‘den hjernespisende amøben’ (gjennomgått i 1,2,3,4,5,6,7), som er årsaken til den nesten universelt dødelige primære amøbemeningoencefalitten.

Naegleria koder for deres rDNA på CERE som ligger i kjernen. Fullstendig sekvensering av tre Naegleria-arters genomer bekrefter fraværet av rDNA i kjernegenomet 8,9,10,11. Basert på de begrensede CERE-sekvensene i full lengde, varierer CERE fra omtrent 10 kbp til 18 kbp i lengde. CERE for hver art av Naegleria bærer en enkelt rDNA-sistron (som inneholder 5.8, 18 og 28S ribosomal DNA) på hver av omtrent 4,000 CERE per celle 12,13,14. Bortsett fra rDNA, har hver CERE en stor ikke-rDNA-sekvens (NRS). CERE-størrelser varierer mellom arter; forskjellene skyldes hovedsakelig den varierende lengden på NRS, ettersom rDNA-sekvensene er svært bevart på tvers av slekten 1,15,16,17,18,19,20. Kartleggingen av en enkelt opprinnelse til DNA-replikasjon i N. gruberi CERE NRS21 gir sterk støtte for hypotesen om at Naegleria CERE replikerer uavhengig av kjernegenomet.

N. gruberi er en ikke-patogen amøbe som ofte brukes til å studere Naegleria-biologi . Vi utviklet en metodikk for å transformere N. gruberi-trofozoitter med en CERE-klon fra samme art for å teste hypotesen om at Naegleria-amøber toler og uavhengig replikerer CERE i trofozoittene. Dette ble oppnådd ved å transformere N. gruberi med en klon i full lengde av N. gruberi CERE til trofozoitter og følge skjebnen til donor-CERE-klonen ved polymerasekjedereaksjon (PCR). En generell oversikt over protokollen er skissert i figur 1. Dataene som presenteres her viser at donorklonen kan påvises gjennom minst syv passasjer i vevskultur, samt opprettholdes gjennom encystment og ekscystment. Disse studiene danner grunnlaget for et middel til å dissekere hvordan CERE replikerer, samt utforske bruken som en vektor for å transfektere Naegleria.

Protocol

Detaljene om artene, reagensene og utstyret som ble brukt i denne studien er oppført i materialtabellen. Sekvensen til pGRUB-konstruksjonen på 17 004 basepar er gitt i tilleggsfil 1. 1. Dyrking av trofozoitter Tin frosne N. gruberi-trofozoitter ved 37 °C i 3 min. Inokuler trofozoitter i T25-kolber i modifisert pepton/gjærekstrakt/nukleinsyre/folsyre/hemin med 10 % føtalt kalveserum (PYNFH) medium pluss 2 % buf…

Representative Results

PCR av trofozoitter som er transfektert med pGRUB viser at den transfekterte CERE påvises gjennom minst syv passasjer av trofozoittene, samt encystment og ekscystment (figur 4). Primere som brukes i PCR-glødningen til både pGEM-vektoren og CERE-sekvensen, og sikrer dermed at PCR ikke oppdager native CERE. PCR etter transfeksjon av pGEM til trofozoitter indikerte at pGEM var negativ (figur 4), noe som indikerer at det tomme plasmidet ikke ble beholdt av amøbe…

Discussion

Protokollen som er skissert her er veldig grei, selv om hver konstruksjon sannsynligvis vil kreve en viss grad av optimalisering, spesielt av DNA-transfeksjonsreagensforholdet, avhengig av konstruksjonens art og arten av Naegleria som brukes. Vi har bare testet ett kommersielt tilgjengelig transfeksjonsreagens ved hjelp av denne protokollen, men det er sannsynlig at flere andre kan være effektive. Gitt at en klon av CERE i full lengde brukes, som inneholder en funksjonell replikasjonsopprinnelse og dermed repli…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Disse studiene ble delvis finansiert av et stipend fra George F. Haddix Fund ved Creighton University (KMD). Figur 1 genereres i biorender.com, og figur 3 genereres i benchling.com.

Materials

Agarose Bio Rad 161-3102
Ammonium Acetate Sigma Aldrich A-7330
Calcium Chloride Sigma Aldrich C-4901
Crushed ice
Culture Flasks, T-75 Thermo Scientific 130190
Culture Plate, 6-well Corning 3506
DNAse Sigma Aldrich D-4527
EDTA, 0.5 M Affymetrix 15694
Electropheresis Gel Apparatus Amersham Biosciences 80-6052-45
Eppendorf Tubes, 1.5 mL Fisher Scientific 05-408-129
Eppendorf Tubes, 2 mL Fisher Scientific 05-408-138
Ethanol, 100% Decon Laboratories 2716
Ethidium Bromide Sigma Aldrich E-8751
Fetal Bovine Serum Gibco 26140
Folic Acid Sigma Aldrich F7876-25G
GeneRuler 1 kb Plus Ladder Thermo Scientific SM1331
Glacial Acetic Acid Fisher Scientific UN2789
GoTaq Green PCR Master Mix Promega M7122
Heating Block Thermo Scientific 88871001
Hemacytometer Hausser Scientific 1483
Hemin Sigma Aldrich 51280
Iron Chloride Sigma Aldrich 372870-256
Ligase NEB M2200S
Magneisum Chloride Fisher Scientific M33-500
Microfuge Thermo Scientific MySpin 12
Microscope Nikon TMS
N. gruberi ATCC 30224
Nucleic Acid Chem Impex Int’l #01625
Peptone Gibco 211677
pGEM Promega P2251
Potassium Phosphate Sigma Aldrich P0662-500G
PowerPac HC Electropharesis Power Supply Unit Bio Rad 1645052
Sodium Chloride MCB Reagents SX0420
Sodium Phosphate, dibasic Sigma Aldrich S2554
Tabletop Centrifuge eppendorf 5415R
Tris, base Sigma Aldrich T1503-1KG
Trypan Blue, 0.4% Gibco 15250-061
ViaFect Reagent Promega E4981
Weigh Scale Denver Instruments APX-60
Yeast Extract Gibco 212750

References

  1. De Jonckheere, J. F. What do we know by now about the genus Naegleria. Exp Parasitol. 145 (Suppl), S2-S9 (2014).
  2. De Jonckheere, J. F. A century of research on the Amoeboflagellate genus Naegleria. Acta Protozool. 41, 309-342 (2002).
  3. Fulton, C. Cell differentiation in Naegleria gruberi. Annu Rev Microbiol. 31, 597-629 (1977).
  4. Grace, E., Asbill, S., Virga, K. Naegleria fowleri: Pathogenesis, diagnosis, and treatment options. AAC. 59 (11), 6677-6681 (2015).
  5. Moseman, E. A. Battling brain-eating amoeba: enigmas surrounding immunity to Naegleria fowleri. PLOS Pathog. 16 (4), e1008406 (2020).
  6. Marciano-Cabral, F. Biology of Naegleria spp. Microbiol Rev. 52 (1), 114-133 (1988).
  7. Piñero, J. E., Omaña-Molina, M., Chávez-Munguía, B., Lorenzo-Morales, J. Naegleria fowleri. Trends Parasitol. 35 (10), 848-849 (2019).
  8. Zysset-Burri, D. C., et al. Genome-wide identification of pathogenicity factors of the free-living amoeba Naegleria fowleri. BMC Genomics. 15, 496-510 (2014).
  9. Liechti, N., Schürch, N., Bruggmann, R., Wittwer, M. The genome of Naegleria lovaniensis, the basis for a comparative approach to unravel pathogenicity factors of the human pathogenic amoeba N. fowleri. BMC Genom. 19, 654-665 (2018).
  10. Liechti, N., Schürch, N., Bruggmann, R., Wittwer, M. Nanopore sequencing improves the draft genome of the human pathogenic amoeba Naegleria fowleri. Sci Reports. 9, 16040-16049 (2019).
  11. Fritz-Laylin, L. K., Ginger, M. L., Walsh, C., Dawson, S. C., Fulton, C. The Naegleria genome: A free-living microbial eukaryote lends unique insights into core eukaryotic cell biology. Res Microbiol. 162, 607-618 (2011).
  12. Clark, C. G., Cross, G. A. M. rRNA genes of Naegleria gruberi are carried exclusively on a 14-kilobase-pair plasmid. Mol Cell Biol. 7 (9), 3027-3031 (1987).
  13. Clark, C. G., Cross, G. A. M. Circular ribosomal RNA genes are a general feature of schizopyrenid amoebae. J Protozool. 35 (2), 326-329 (1988).
  14. Dao, F. Y., et al. Identify origin of replication in Saccharomyces cerevisiae using two-step feature selection technique. Bioinformatics. 35 (12), 2075-2083 (2019).
  15. Mullican, J. C., Chapman, N. M., Tracy, S. Complete genome sequence of the circular extrachromosomal element of Naegleria gruberi strain EGB ribosomal DNA. Genome Announc. 6 (6), e00020-e00021 (2018).
  16. Mullican, J. C., Drescher, K. M., Chapman, N. M., Tracy, S. Complete genome sequence of the Naegleria fowleri (strain LEE) closed circular extrachromosomal ribosomal DNA element. Microbiol Resource Announce. 9 (49), e01055-e01020 (2020).
  17. Nguyen, B. T., Chapman, N. M., Tracy, S., Drescher, K. M. The extrachromosomal elements of the Naegleria amoebae: How little we know. Plasmid. 115, 102567 (2021).
  18. Nguyen, B. T., et al. Complete sequence of the closed circular extrachromosomal element (CERE) of Naegleria australiensis De Jonckheere (strain PP 397). Microbiol Resource Announce. 12, e0032123 (2023).
  19. Nguyen, B. T., Chapman, N. M., Stessman, H. A. F., Tracy, S., Drescher, K. M. Complete sequence of the closed circular extrachromosomal element of Naegleria jadini Willaert and Ray (Strain ITMAP400). Microbiol Resource Announce. 12 (4), e0006123 (2023).
  20. Nguyen, B. T., et al. Complete sequence of the closed circular extrachromosomal element (CERE) of Naegleria pringsheimi De Jonckheere (strain Singh). Microbiol Resource Announce. 13 (4), (2024).
  21. Mullican, J. C., Chapman, N. M., Tracy, S. Mapping the single origin of replication in the Naegleria gruberi extrachromosomal DNA element. Protist. 170, 141-152 (2019).
  22. Sohn, H. J., et al. Efficient liquid media for encystation of pathogenic free-living amoebae. Korean J Parasitol. 55 (3), 233-238 (2017).
  23. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. 111, A3.B.1-A3.B.3 (2001).
  24. Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis Exp. 63, e3998 (2012).
  25. Jeong, S. R., et al. Expression of the nfa1 gene cloned from pathogenic Naegleria fowleri in non-pathogenic N. gruberi enhances cytotoxicity against CHO target cells in vitro. Infect Immun. 73 (7), 4098-4105 (2005).
  26. Clark, C. G., Cross, G. A. M., De Jonckheere, J. F. Evaluation of evolutionary divergence in the genus Naegleria by analysis of ribosomal DNA plasmid restriction patterns. Mol Biochem Parasitol. 34 (3), 281-296 (1989).
  27. De Jonckheere, J. F. Sequence variation in the ribosomal internal transcribed spacers, including the 5.8S rDNA, of Naegleria spp. Protist. 149 (3), 221-228 (1998).
  28. Rawal, P., et al. Genome-wide prediction of G4 DNA as regulatory motifs: Role in Escherichia coli global regulation. Genome Res. 16 (5), 644-655 (2006).
  29. Yadav, V. K., Abraham, J. K., Mani, P., Kulshrestha, R., Chowdhury, S. QuadBase: Genome-wide database of G4 DNA – occurrence and conservation in human, chimpanzee, mouse and rat promoters and 146 microbes. Nucleic Acids Res. 36, D381-D385 (2007).

Play Video

Cite This Article
Nguyen, B. T., Chapman, N. M., Mullican, J. C., Drescher, K. M. Transfection of a Molecular Clone of Naegleria gruberi rDNA into N. gruberi Trophozoites. J. Vis. Exp. (208), e66726, doi:10.3791/66726 (2024).

View Video