Denne protokollen beskriver en metodikk for å transfektere Naegleria gruberi trofozoitter med en konstruksjon som opprettholdes gjennom passerende trofozoitter in vitro, så vel som gjennom encystment og ekscystment.
Alle ribosomale gener av Naegleria trophozoites opprettholdes i et lukket sirkulært ekstrakromosomal ribosomalt DNA (rDNA) som inneholder element (CERE). Selv om lite er kjent om CERE, viser en fullstendig genomsekvensanalyse av tre Naegleria-arter tydelig at det ikke er noen rDNA-cistroner i kjernegenomet. Videre har en enkelt DNA-opprinnelse til replikasjon blitt kartlagt i N. gruberi CERE, noe som støtter hypotesen om at CERE replikerer uavhengig av kjernegenomet. Denne CERE-karakteristikken antyder at det kan være mulig å bruke konstruert CERE for å introdusere fremmede proteiner i Naegleria-trofozoitter . Som det første trinnet i å utforske bruken av en CERE som vektor i Naegleria, utviklet vi en protokoll for å transfektere N. gruberi med en molekylær klon av N. gruberi CERE klonet til pGEM7zf+ (pGRUB). Etter transfeksjon ble pGRUB lett påvist i N. gruberi trophozoites i minst syv passasjer, samt gjennom encystment og ekscystment. Som en kontroll ble trofozoitter transfektert med ryggradsvektoren, pGEM7zf+, uten N. gruberi-sekvensene (pGEM). pGEM ble ikke påvist etter den første passasjen etter transfeksjon til N. gruberi, noe som indikerer dens manglende evne til å replikere i en eukaryot organisme. Disse studiene beskriver en transfeksjonsprotokoll for Naegleria-trofozoitter og viser at den bakterielle plasmidsekvensen i pGRUB ikke hemmer vellykket transfeksjon og replikasjon av den transfekterte CERE-klonen. Videre vil denne transfeksjonsprotokollen være avgjørende for å forstå den minimale sekvensen av CERE som driver replikasjonen i trofozoitter, samt identifisere regulatoriske regioner i den ikke-ribosomale sekvensen (NRS).
Naegleria-slekten inneholder over 45 arter, selv om det er usannsynlig at alle medlemmer av arten har blitt identifisert1. Naegleria kan eksistere i forskjellige former: som trofozoitter (amøber), som flagellater, eller, når ressursene er sterkt begrenset, som cyster 1,2,3,4. Naegleria-slekten er anerkjent for sin ene spesielt farlige art, Naegleria fowleri, kjent som ‘den hjernespisende amøben’ (gjennomgått i 1,2,3,4,5,6,7), som er årsaken til den nesten universelt dødelige primære amøbemeningoencefalitten.
Naegleria koder for deres rDNA på CERE som ligger i kjernen. Fullstendig sekvensering av tre Naegleria-arters genomer bekrefter fraværet av rDNA i kjernegenomet 8,9,10,11. Basert på de begrensede CERE-sekvensene i full lengde, varierer CERE fra omtrent 10 kbp til 18 kbp i lengde. CERE for hver art av Naegleria bærer en enkelt rDNA-sistron (som inneholder 5.8, 18 og 28S ribosomal DNA) på hver av omtrent 4,000 CERE per celle 12,13,14. Bortsett fra rDNA, har hver CERE en stor ikke-rDNA-sekvens (NRS). CERE-størrelser varierer mellom arter; forskjellene skyldes hovedsakelig den varierende lengden på NRS, ettersom rDNA-sekvensene er svært bevart på tvers av slekten 1,15,16,17,18,19,20. Kartleggingen av en enkelt opprinnelse til DNA-replikasjon i N. gruberi CERE NRS21 gir sterk støtte for hypotesen om at Naegleria CERE replikerer uavhengig av kjernegenomet.
N. gruberi er en ikke-patogen amøbe som ofte brukes til å studere Naegleria-biologi . Vi utviklet en metodikk for å transformere N. gruberi-trofozoitter med en CERE-klon fra samme art for å teste hypotesen om at Naegleria-amøber toler og uavhengig replikerer CERE i trofozoittene. Dette ble oppnådd ved å transformere N. gruberi med en klon i full lengde av N. gruberi CERE til trofozoitter og følge skjebnen til donor-CERE-klonen ved polymerasekjedereaksjon (PCR). En generell oversikt over protokollen er skissert i figur 1. Dataene som presenteres her viser at donorklonen kan påvises gjennom minst syv passasjer i vevskultur, samt opprettholdes gjennom encystment og ekscystment. Disse studiene danner grunnlaget for et middel til å dissekere hvordan CERE replikerer, samt utforske bruken som en vektor for å transfektere Naegleria.
Protokollen som er skissert her er veldig grei, selv om hver konstruksjon sannsynligvis vil kreve en viss grad av optimalisering, spesielt av DNA-transfeksjonsreagensforholdet, avhengig av konstruksjonens art og arten av Naegleria som brukes. Vi har bare testet ett kommersielt tilgjengelig transfeksjonsreagens ved hjelp av denne protokollen, men det er sannsynlig at flere andre kan være effektive. Gitt at en klon av CERE i full lengde brukes, som inneholder en funksjonell replikasjonsopprinnelse og dermed repli…
The authors have nothing to disclose.
Disse studiene ble delvis finansiert av et stipend fra George F. Haddix Fund ved Creighton University (KMD). Figur 1 genereres i biorender.com, og figur 3 genereres i benchling.com.
Agarose | Bio Rad | 161-3102 | |
Ammonium Acetate | Sigma Aldrich | A-7330 | |
Calcium Chloride | Sigma Aldrich | C-4901 | |
Crushed ice | |||
Culture Flasks, T-75 | Thermo Scientific | 130190 | |
Culture Plate, 6-well | Corning | 3506 | |
DNAse | Sigma Aldrich | D-4527 | |
EDTA, 0.5 M | Affymetrix | 15694 | |
Electropheresis Gel Apparatus | Amersham Biosciences | 80-6052-45 | |
Eppendorf Tubes, 1.5 mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
Eppendorf Tubes, 2 mL | Fisher Scientific | 05-408-138 | |
Ethanol, 100% | Decon Laboratories | 2716 | |
Ethidium Bromide | Sigma Aldrich | E-8751 | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140 | |
Folic Acid | Sigma Aldrich | F7876-25G | |
GeneRuler 1 kb Plus Ladder | Thermo Scientific | SM1331 | |
Glacial Acetic Acid | Fisher Scientific | UN2789 | |
GoTaq Green PCR Master Mix | Promega | M7122 | |
Heating Block | Thermo Scientific | 88871001 | |
Hemacytometer | Hausser Scientific | 1483 | |
Hemin | Sigma Aldrich | 51280 | |
Iron Chloride | Sigma Aldrich | 372870-256 | |
Ligase | NEB | M2200S | |
Magneisum Chloride | Fisher Scientific | M33-500 | |
Microfuge | Thermo Scientific | MySpin 12 | |
Microscope | Nikon | TMS | |
N. gruberi | ATCC | 30224 | |
Nucleic Acid | Chem Impex Int’l | #01625 | |
Peptone | Gibco | 211677 | |
pGEM | Promega | P2251 | |
Potassium Phosphate | Sigma Aldrich | P0662-500G | |
PowerPac HC Electropharesis Power Supply Unit | Bio Rad | 1645052 | |
Sodium Chloride | MCB Reagents | SX0420 | |
Sodium Phosphate, dibasic | Sigma Aldrich | S2554 | |
Tabletop Centrifuge | eppendorf | 5415R | |
Tris, base | Sigma Aldrich | T1503-1KG | |
Trypan Blue, 0.4% | Gibco | 15250-061 | |
ViaFect Reagent | Promega | E4981 | |
Weigh Scale | Denver Instruments | APX-60 | |
Yeast Extract | Gibco | 212750 |