אנו מציגים פרוטוקול להכנת מעבים ביומולקולריים סינתטיים המורכבים מננו-כוכבים של DNA אמפיפילי החל מהאוליגונוקלאוטידים המרכיבים את הדנ”א שלהם. קונדנסטים מיוצרים מרכיב ננו-כוכב יחיד או משני רכיבים ומותאמים כדי לקיים שעתוק חוץ גופי של RNA מתבנית DNA משובצת.
טיפות ועיבויים סינתטיים הופכים למרכיבים נפוצים יותר ויותר של מערכות ביומימטיות מתקדמות ותאים סינתטיים, שם ניתן להשתמש בהם כדי לבסס מידור ולקיים תגובות דמויות חיים. ננו-מבנים סינתטיים של דנ”א הוכיחו פוטנציאל משמעותי כאבני בניין יוצרות עיבוי בשל צורתם הניתנת לתכנות, תפקודם הכימי והתנהגות ההרכבה העצמית שלהם. לאחרונה הוכחנו כי “ננו-כוכבים” של דנ”א אמפיפילי, המתקבלים על ידי תיוג צמתי דנ”א עם מואיטים הידרופוביים, מהווים פתרון חזק ורב-תכליתי במיוחד. ניתן לתכנת את מעבי הדנ”א האמפיפיליים המתקבלים כך שיציגו ארכיטקטורות פנימיות מורכבות ומרובות תאים, להגיב מבנית לגירויים חיצוניים שונים, לסנתז מקרומולקולות, ללכוד ולשחרר מטע”דים, לעבור טרנספורמציות מורפולוגיות ולקיים אינטראקציה עם תאים חיים. כאן, אנו מדגימים פרוטוקולים להכנת מעבי DNA אמפיפיליים החל מאוליגונוקלאוטידים של DNA מרכיבים. נתייחס (i) למערכות חד-רכיביות היוצרות מעבים אחידים, (ii) למערכות דו-רכיביות היוצרות מעבים של מעטפת הליבה, ו-(iii) למערכות שבהן המעבים מותאמים לתמיכה בשעתוק חוץ גופי של ננו-מבנים של RNA.
תאים סינתטיים הם התקנים בקנה מידה מיקרומטרי (10-50 מיקרומטר) הבנויים מלמטה למעלה כדי לשכפל פונקציות ומבנים של תאים ביולוגיים קיימים 1,2. תאים סינתטיים קשורים לעתים קרובות על ידי ממברנות הבנויות משלפוחיות דו-שכבתיות 3,4,5,6,7, פולימרזומים 8,9, או פרוטאינוזומים10,11, אשר יכולים לשמש גם ליצירת מידור פנימי 12,13. בהשראת אברונים נטולי קרום הידועים כמקיימים תפקודים שונים בתאים חיים14, מבנים כגון קואצ’רבטים פולימריים, עיבויים ביומולקולריים והידרוג’לים צוברים תאוצה כחלופות מגוונות וחזקות לביסוס מידור חיצוני ופנימי בתאים סינתטיים 15,16,17,18.
תוך מינוף ארגז הכלים הרב-תכליתי של ננוטכנולוגיה של דנ”א19, פותחו פתרונות מרובים להנדסה של טיפות ועיבויים סינתטיים מהרכבה עצמית של ננו-מבנים מלאכותיים של דנ”א, שגודלם, צורתם, תפקודם, ערכיותם ואינטראקציות הדדיות שלהם ניתנים לתכנות מדויק20. טיפות דנ”א או מעבים הם בעלי תאימות ביולוגית ויכולים לשמש כפיגומים הן עבור תאים סינתטיים והן עבור אברונים, אירוח תגובות כימיות וביומולקולריות21, מידע חישובי22,23, לכידה ושחרור של מטענים24,25, ושמירה על תגובות מבניות26.
בין העיצובים המגוונים של ננו-מבנים יוצרי דנ”א יוצרי עיבוי, ננו-כוכבים של דנ”א אמפיפילי – המכונים כוכבי C – הוכיחו את עצמם כחזקים ורב-תכליתיים27. כוכבי C הם מוטיבים מסועפים פשוטים המורכבים מצומת דנ”א קבוע (בדרך כלל ארבע-כיווני), שממנו יוצאות זרועות דנ”א דו-גדיליות (ds)28. לאחר מכן הזרועות מכוסות במויאטים הידרופוביים, בדרך כלל כולסטרול, מה שהופך את הננו-מבנים לאמפיפיליים ומניע את העיבוי שלהם בעקבות חישול פשוט של סיר אחד. עיבוי C-star מאפשר יכולת תכנות מבנית ותפקודית מדויקת, כולל האפשרות להקים ארכיטקטורות מרובות תאים29,30, להגיב מבנית לטריגרים של DNA וקטיון31, לסנתז מקרומולקולות29, ללכוד ולשחרר מטענים32, ואינטראקציה עם תאים חיים33. להלן, נתאר ונדון בפרוטוקולים לייצור מעבים של כוכב C החל מהאוליגונוקלאוטידים המרכיבים אותם.
הפרוטוקול מסכם את ההכנה של מעבים אונאריים (רכיב אחד) ובינארי (שני רכיבים), תוך שימוש בשלושה עיצובים שונים של כוכבי C (איור 1) -“לא מגיב”, “מגיב TMSD” ו-“RNA-טמפלציה”. כוכב C “שאינו מגיב” (לוח A) מורכב מארבעה “גדילי ליבה” עם רצפים נפרדים היוצרים את צומת ארבעת הכיוונים. ארבעה אוליגונוקלאוטידים זהים מהונדסים בכולסטרול מחוברים לצומת, ומבטיחים שמולקולת כולסטרול נמצאת בקצה כל זרוע. כוכבי C שאינם מגיבים מהווים פיגומים פשוטים ואינרטיים עבור עיבויים אונאריים ובינאריים. בכוכב C “מגיב TMSD” (לוח B), החיבור בין גדילי הכולסטרול לבין הצומת מובטח על ידי גדיל “גשר אחיזת אצבעות”, הכולל תחום “אחיזת בוהן” חד-גדילי (ss)DNA משתלשל. בנוכחות גדיל דנ”א פולש בעל תחום אחיזת אצבעות משלים, יכולה להיווצר תגובת תזוזה של גדיל בתיווך הבוהן34, שבה הפולש עוקר את גשר אחיזת הבהונות, מנתק את הקשר בין הצומת לבין המויאטים ההידרופוביים וגורם לפירוק רשת הדנ”א32. לבסוף, כוכב C “RNA templating” (לוח C) כולל שינוי “בסיס” המשלים גדיל “גשר”, האחרון מקשר את תבנית ssDNA המתעתקת עבור ברוקולי aptamer29. פירוט הרצף של האוליגונוקלאוטידים המרכיבים את שלושת סוגי העיצובים של כוכבי C שהוזכרו כאן ניתן למצוא בטבלה משלימה 1 ובעבודות קודמות 29,30,32.
איור 1. סכמות של שלושה עיצובים שונים של ננו-כוכבים אמפיופיליים של דנ”א (C-stars). רצפי אוליגונוקלאוטידים עבור דוגמאות שונות של כוכבי C המתוארים כאן ניתן למצוא בטבלה משלימה 1. (A) סכמטי של כוכב C שנועד ליצור עיבויים שאינם מגיבים, עם גדילי האוליגונוקלאוטידים המרכיבים “Core 1”, “Core 2”, “Core 3”, “Core 4”, (צבועים בגוונים של ורוד) ו-“Terminal cholesterol” (צבועים בכחול). כל צבע ייחודי מייצג גדיל אוליגונוקלאוטיד בעל רצף ייחודי. “Core 1” ו-“Core 3” משלימים חלקית כל אחד את “Core 2” ו-“Core 4”, אך אינם משלימים זה את זה. (B) סכמטי של כוכב C שנועד להתפרק עם הוספת גדיל פולש באמצעות תזוזת גדיל בתיווך אצבע, כמתואר בעבודה קודמת32. כוכב C זה מורכב מגדילים “Core” ו-“Terminal cholesterol” (צבועים באפור), כמו גם גדיל “Terminal complement” (מוצג בכתום) וגדיל “Toeholding bridge” (מוצג בצבע כחול כהה). האחרון מכיל תליה של שישה נוקלאוטידים שאליהם גדיל פולש מתוכנן כראוי יכול להיקשר ולאחר מכן להחליף לחלוטין את גדיל “גשר אחיזת האצבעות”, מה שגורם לדיסוציאציה של צומת הננו-כוכבים המרכזי (המורכב מ”ליבה 1, 2, 3 ו-4″) מהדופלקסים המורכבים מגדילים “משלים טרמינלי” ו”כולסטרול טרמינלי”. (C) סכמה של כוכב C המתפקד עם תבנית DNA עבור אפטמר RNA. גם זה מורכב מגדיל “כולסטרול טרמינלי” ו”ליבה 2, 3 ו-4″ (כולם מוצגים באפור), כמו גם גרסה מורחבת של גדיל “ליבה 1” (מוצג בוורוד), גדיל “בסיס” (חום), גדיל “גשר” (צהוב) ו”תבנית אפטמר” (ירוק). דופלקס הדנ”א המורכב משני הגדילים האחרונים יוצר את אזור מקדם T7 פולימראז, המסמן את אתר התחלת השעתוק. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
עיבוי כוכב C נוצר על חישול תרמי של האוליגונוקלאוטידים המרכיבים, אשר בפרוטוקול המוצג כאן מתבצע בתוך נימי זכוכית אטומים עם חתך מלבני ביחס גובה-רוחב גבוה. מיכלים אלה מציעים מספר יתרונות מרכזיים: i) איטום מבטיח שהאידוי יימנע לחלוטין בשלבי החישול (לפעמים איטיים); 2) התחתית השטוחה באיכות אופטית של הנימים מאפשרת הדמיה של ארעי ההרכבה העצמית (או הפירוק); 3) יחס הממדים הגבוה של הנימים מבטיח שהמעבים הכבדים ישקעו על פני שטח רחב ושטוח, מה שמקטין את הסיכויים להתלכדות וצבירה בשלבים מאוחרים יותר של ארעי ההרכבה העצמית שיתרחש במיכלים בצורת טריז (למשל, צינורות מיקרוצנטריפוגה), ומייצר אוכלוסיות מעובות חד-פיזוריות יחסית; 4) ביצוע החישול בנימי זכוכית מוארכים ממזער את חשיפת הדגימה לממשקים הידרופוביים (אוויר, פלסטיק או שמן), אשר נצפו כמפריעים להרכבה עצמית על ידי גיוס האוליגונוקלאוטידים האמפיפיליים. לאחר השלמת פרוטוקול ההרכבה, ניתן לחלץ קונדנסטים מנימי זכוכית לניסויים נוספים הכוללים ריאגנטים נוספים.
הפרוטוקול המתואר כאן מספק גישה להכנת מעבים של רכיב אחד או שניים מננו-כוכבים של דנ”א אמפיפילי, עם וריאציות תכנון להחדרת תגובות שונות למעבים. הפרוטוקול הנתון מייצר עיבויים בתמיסת חיץ של 0.3 M NaCl ב- TE, אך ניתן לתקן את תנאי המאגר על ידי שינוי מתאים של אמצעי האחסון המפורטים לעיל. עבודות קודמות חקרו …
The authors have nothing to disclose.
LM, LDM ו-DT מאשרים תמיכה ממועצת המחקר האירופית (ERC) במסגרת תוכנית המחקר והחדשנות Horizon 2020 (ERC-STG No 851667 – NANOCELL). LDM מכיר בתמיכה ממענק מחקר של החברה המלכותית לעמיתי מחקר (RGF/R1/180043) ובתמיכה ממלגת מחקר של אוניברסיטת החברה המלכותית (UF160152, URF/R/221009).
0.22 μm syringe filters | Sigma-Aldrich | SLGVR33RB | |
24 x 60 mm #1.5 Rectangular cover glasses, Menzel Gläser | VWR | 631-0853 | |
2-Propanol | Sigma-Aldrich | 34683 | |
6 L Ultrasonic Cleaner with Digital Timer and Heat, 230 VAC | Cole-Parmer | WZ-08895-11 | |
Araldite Rapid Adhesive 2 Part Epoxy Glue | RS | ARA-400005 | |
Bio-Rad C1000 thermal cycler | Bio-Rad | 1851197 | |
Brand Microcentrifuge Tube 2 mL with Locking Lid | Fisher Scientific | 15338665 | 2 mL microcentrifuge tubes for the extraction of C-star condensates |
Diamond Scribing Pen | RS | 394-217 | |
Difluoro-4-hydroxybenzylidene imidazolidinone (DFHBI) | Sigma-Aldrich | SML1627 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 472301 | |
Eppendorf PCR Clean Colorless Safe-Lock Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 0030123301 | 0.5 mL microcentrifuge tubes for the preparation of C-star mixtures |
Ethanol Absolute 99.8+% | Fisher Scientific | 10437341 | 70% ethanol is sufficient for cleaning purposes |
Fisherbrand ZX4 IR Vortex Mixer | Fisherbrand | 13284769 | |
Hellmanex III | Hellma | 9-307-011-4-507 | |
Hollow Rectangle Capillaries ID 0.40 x 4.00 mm, 50 mm in length | CM Scientific | 2540-50 | |
Mineral oil | Sigma-Aldrich | 69794 | |
Mini Centrifuge, 230 V | PRISM(TM) | Z763128 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
NanoDrop One Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | Used to measure absorbance of oligonucleotides for concentration calculations |
Oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | Custom | Oligonucleotide sequences are unique to the C-star design required. |
ScriptGuard RNase inhibitor | CELLSCRIPT | C-SRI6310K | RNase inhibitor |
T7-FlashScribe Transcription Kit | Cambio | C-ASF3507 | |
Tris-EDTA buffer, 100x stock solution | Sigma-Aldrich | 574793 | |
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | Invitrogen | 10977035 | |
VWR Spec-Wipe 3 Wipers | VWR | 21914-758 |