Summary

עיבויים סינתטיים וארכיטקטורות דמויות תאים מננו-מבנים של DNA אמפיפילי

Published: May 31, 2024
doi:

Summary

אנו מציגים פרוטוקול להכנת מעבים ביומולקולריים סינתטיים המורכבים מננו-כוכבים של DNA אמפיפילי החל מהאוליגונוקלאוטידים המרכיבים את הדנ”א שלהם. קונדנסטים מיוצרים מרכיב ננו-כוכב יחיד או משני רכיבים ומותאמים כדי לקיים שעתוק חוץ גופי של RNA מתבנית DNA משובצת.

Abstract

טיפות ועיבויים סינתטיים הופכים למרכיבים נפוצים יותר ויותר של מערכות ביומימטיות מתקדמות ותאים סינתטיים, שם ניתן להשתמש בהם כדי לבסס מידור ולקיים תגובות דמויות חיים. ננו-מבנים סינתטיים של דנ”א הוכיחו פוטנציאל משמעותי כאבני בניין יוצרות עיבוי בשל צורתם הניתנת לתכנות, תפקודם הכימי והתנהגות ההרכבה העצמית שלהם. לאחרונה הוכחנו כי “ננו-כוכבים” של דנ”א אמפיפילי, המתקבלים על ידי תיוג צמתי דנ”א עם מואיטים הידרופוביים, מהווים פתרון חזק ורב-תכליתי במיוחד. ניתן לתכנת את מעבי הדנ”א האמפיפיליים המתקבלים כך שיציגו ארכיטקטורות פנימיות מורכבות ומרובות תאים, להגיב מבנית לגירויים חיצוניים שונים, לסנתז מקרומולקולות, ללכוד ולשחרר מטע”דים, לעבור טרנספורמציות מורפולוגיות ולקיים אינטראקציה עם תאים חיים. כאן, אנו מדגימים פרוטוקולים להכנת מעבי DNA אמפיפיליים החל מאוליגונוקלאוטידים של DNA מרכיבים. נתייחס (i) למערכות חד-רכיביות היוצרות מעבים אחידים, (ii) למערכות דו-רכיביות היוצרות מעבים של מעטפת הליבה, ו-(iii) למערכות שבהן המעבים מותאמים לתמיכה בשעתוק חוץ גופי של ננו-מבנים של RNA.

Introduction

תאים סינתטיים הם התקנים בקנה מידה מיקרומטרי (10-50 מיקרומטר) הבנויים מלמטה למעלה כדי לשכפל פונקציות ומבנים של תאים ביולוגיים קיימים 1,2. תאים סינתטיים קשורים לעתים קרובות על ידי ממברנות הבנויות משלפוחיות דו-שכבתיות 3,4,5,6,7, פולימרזומים 8,9, או פרוטאינוזומים10,11, אשר יכולים לשמש גם ליצירת מידור פנימי 12,13. בהשראת אברונים נטולי קרום הידועים כמקיימים תפקודים שונים בתאים חיים14, מבנים כגון קואצ’רבטים פולימריים, עיבויים ביומולקולריים והידרוג’לים צוברים תאוצה כחלופות מגוונות וחזקות לביסוס מידור חיצוני ופנימי בתאים סינתטיים 15,16,17,18.

תוך מינוף ארגז הכלים הרב-תכליתי של ננוטכנולוגיה של דנ”א19, פותחו פתרונות מרובים להנדסה של טיפות ועיבויים סינתטיים מהרכבה עצמית של ננו-מבנים מלאכותיים של דנ”א, שגודלם, צורתם, תפקודם, ערכיותם ואינטראקציות הדדיות שלהם ניתנים לתכנות מדויק20. טיפות דנ”א או מעבים הם בעלי תאימות ביולוגית ויכולים לשמש כפיגומים הן עבור תאים סינתטיים והן עבור אברונים, אירוח תגובות כימיות וביומולקולריות21, מידע חישובי22,23, לכידה ושחרור של מטענים24,25, ושמירה על תגובות מבניות26.

בין העיצובים המגוונים של ננו-מבנים יוצרי דנ”א יוצרי עיבוי, ננו-כוכבים של דנ”א אמפיפילי – המכונים כוכבי C הוכיחו את עצמם כחזקים ורב-תכליתיים27. כוכבי C הם מוטיבים מסועפים פשוטים המורכבים מצומת דנ”א קבוע (בדרך כלל ארבע-כיווני), שממנו יוצאות זרועות דנ”א דו-גדיליות (ds)28. לאחר מכן הזרועות מכוסות במויאטים הידרופוביים, בדרך כלל כולסטרול, מה שהופך את הננו-מבנים לאמפיפיליים ומניע את העיבוי שלהם בעקבות חישול פשוט של סיר אחד. עיבוי C-star מאפשר יכולת תכנות מבנית ותפקודית מדויקת, כולל האפשרות להקים ארכיטקטורות מרובות תאים29,30, להגיב מבנית לטריגרים של DNA וקטיון31, לסנתז מקרומולקולות29, ללכוד ולשחרר מטענים32, ואינטראקציה עם תאים חיים33. להלן, נתאר ונדון בפרוטוקולים לייצור מעבים של כוכב C החל מהאוליגונוקלאוטידים המרכיבים אותם.

הפרוטוקול מסכם את ההכנה של מעבים אונאריים (רכיב אחד) ובינארי (שני רכיבים), תוך שימוש בשלושה עיצובים שונים של כוכבי C (איור 1) -“לא מגיב”, “מגיב TMSD” ו-“RNA-טמפלציה”. כוכב C “שאינו מגיב” (לוח A) מורכב מארבעה “גדילי ליבה” עם רצפים נפרדים היוצרים את צומת ארבעת הכיוונים. ארבעה אוליגונוקלאוטידים זהים מהונדסים בכולסטרול מחוברים לצומת, ומבטיחים שמולקולת כולסטרול נמצאת בקצה כל זרוע. כוכבי C שאינם מגיבים מהווים פיגומים פשוטים ואינרטיים עבור עיבויים אונאריים ובינאריים. בכוכב C “מגיב TMSD” (לוח B), החיבור בין גדילי הכולסטרול לבין הצומת מובטח על ידי גדיל “גשר אחיזת אצבעות”, הכולל תחום “אחיזת בוהן” חד-גדילי (ss)DNA משתלשל. בנוכחות גדיל דנ”א פולש בעל תחום אחיזת אצבעות משלים, יכולה להיווצר תגובת תזוזה של גדיל בתיווך הבוהן34, שבה הפולש עוקר את גשר אחיזת הבהונות, מנתק את הקשר בין הצומת לבין המויאטים ההידרופוביים וגורם לפירוק רשת הדנ”א32. לבסוף, כוכב C “RNA templating” (לוח C) כולל שינוי “בסיס” המשלים גדיל “גשר”, האחרון מקשר את תבנית ssDNA המתעתקת עבור ברוקולי aptamer29. פירוט הרצף של האוליגונוקלאוטידים המרכיבים את שלושת סוגי העיצובים של כוכבי C שהוזכרו כאן ניתן למצוא בטבלה משלימה 1 ובעבודות קודמות 29,30,32.

Figure 1
איור 1. סכמות של שלושה עיצובים שונים של ננו-כוכבים אמפיופיליים של דנ”א (C-stars). רצפי אוליגונוקלאוטידים עבור דוגמאות שונות של כוכבי C המתוארים כאן ניתן למצוא בטבלה משלימה 1. (A) סכמטי של כוכב C שנועד ליצור עיבויים שאינם מגיבים, עם גדילי האוליגונוקלאוטידים המרכיבים “Core 1”, “Core 2”, “Core 3”, “Core 4”, (צבועים בגוונים של ורוד) ו-“Terminal cholesterol” (צבועים בכחול). כל צבע ייחודי מייצג גדיל אוליגונוקלאוטיד בעל רצף ייחודי. “Core 1” ו-“Core 3” משלימים חלקית כל אחד את “Core 2” ו-“Core 4”, אך אינם משלימים זה את זה. (B) סכמטי של כוכב C שנועד להתפרק עם הוספת גדיל פולש באמצעות תזוזת גדיל בתיווך אצבע, כמתואר בעבודה קודמת32. כוכב C זה מורכב מגדילים “Core” ו-“Terminal cholesterol” (צבועים באפור), כמו גם גדיל “Terminal complement” (מוצג בכתום) וגדיל “Toeholding bridge” (מוצג בצבע כחול כהה). האחרון מכיל תליה של שישה נוקלאוטידים שאליהם גדיל פולש מתוכנן כראוי יכול להיקשר ולאחר מכן להחליף לחלוטין את גדיל “גשר אחיזת האצבעות”, מה שגורם לדיסוציאציה של צומת הננו-כוכבים המרכזי (המורכב מ”ליבה 1, 2, 3 ו-4″) מהדופלקסים המורכבים מגדילים “משלים טרמינלי” ו”כולסטרול טרמינלי”. (C) סכמה של כוכב C המתפקד עם תבנית DNA עבור אפטמר RNA. גם זה מורכב מגדיל “כולסטרול טרמינלי” ו”ליבה 2, 3 ו-4″ (כולם מוצגים באפור), כמו גם גרסה מורחבת של גדיל “ליבה 1” (מוצג בוורוד), גדיל “בסיס” (חום), גדיל “גשר” (צהוב) ו”תבנית אפטמר” (ירוק). דופלקס הדנ”א המורכב משני הגדילים האחרונים יוצר את אזור מקדם T7 פולימראז, המסמן את אתר התחלת השעתוק. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

עיבוי כוכב C נוצר על חישול תרמי של האוליגונוקלאוטידים המרכיבים, אשר בפרוטוקול המוצג כאן מתבצע בתוך נימי זכוכית אטומים עם חתך מלבני ביחס גובה-רוחב גבוה. מיכלים אלה מציעים מספר יתרונות מרכזיים: i) איטום מבטיח שהאידוי יימנע לחלוטין בשלבי החישול (לפעמים איטיים); 2) התחתית השטוחה באיכות אופטית של הנימים מאפשרת הדמיה של ארעי ההרכבה העצמית (או הפירוק); 3) יחס הממדים הגבוה של הנימים מבטיח שהמעבים הכבדים ישקעו על פני שטח רחב ושטוח, מה שמקטין את הסיכויים להתלכדות וצבירה בשלבים מאוחרים יותר של ארעי ההרכבה העצמית שיתרחש במיכלים בצורת טריז (למשל, צינורות מיקרוצנטריפוגה), ומייצר אוכלוסיות מעובות חד-פיזוריות יחסית; 4) ביצוע החישול בנימי זכוכית מוארכים ממזער את חשיפת הדגימה לממשקים הידרופוביים (אוויר, פלסטיק או שמן), אשר נצפו כמפריעים להרכבה עצמית על ידי גיוס האוליגונוקלאוטידים האמפיפיליים. לאחר השלמת פרוטוקול ההרכבה, ניתן לחלץ קונדנסטים מנימי זכוכית לניסויים נוספים הכוללים ריאגנטים נוספים.

Protocol

הערה: הפרוטוקול מחולק לשלושה חלקים. סעיף 1 מתאר את השלבים המוקדמים, כולל הכנת אוליגונוקלאוטידים DNA ונימי זכוכית. סעיף 2 מתאר את הכנת עיבוי כוכב C בעיצובים שונים, כולל עיצובים של רכיב אחד ושני רכיבים, והוצאתם מנימי הזכוכית. סעיף 3 מתאר את השימוש בעיבוי כוכב C חד-רכיבי של RNA לסינתזה של אפטמר RNA. על …

Representative Results

לאחר החישול, ניתן לצלם עיבוי כוכב C ישירות בצינור הנימים, או לאחר החילוץ, כדי לאשר את היווצרותם. עבור כל וריאציות העיצוב של כוכב C, יש לצפות בעיבויים כדוריים או פוליהדרליים מובהקים בקוטר של כ-10-50 מיקרומטר, כאשר האחרון נוצר כאשר מתרחשת התגבשות28,32. עבור מעבים חד-?…

Discussion

הפרוטוקול המתואר כאן מספק גישה להכנת מעבים של רכיב אחד או שניים מננו-כוכבים של דנ”א אמפיפילי, עם וריאציות תכנון להחדרת תגובות שונות למעבים. הפרוטוקול הנתון מייצר עיבויים בתמיסת חיץ של 0.3 M NaCl ב- TE, אך ניתן לתקן את תנאי המאגר על ידי שינוי מתאים של אמצעי האחסון המפורטים לעיל. עבודות קודמות חקרו …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

LM, LDM ו-DT מאשרים תמיכה ממועצת המחקר האירופית (ERC) במסגרת תוכנית המחקר והחדשנות Horizon 2020 (ERC-STG No 851667 – NANOCELL). LDM מכיר בתמיכה ממענק מחקר של החברה המלכותית לעמיתי מחקר (RGF/R1/180043) ובתמיכה ממלגת מחקר של אוניברסיטת החברה המלכותית (UF160152, URF/R/221009).

Materials

0.22 μm syringe filters Sigma-Aldrich SLGVR33RB
24 x 60 mm #1.5 Rectangular cover glasses, Menzel Gläser VWR 631-0853
2-Propanol Sigma-Aldrich 34683
6 L Ultrasonic Cleaner with Digital Timer and Heat, 230 VAC Cole-Parmer WZ-08895-11
Araldite Rapid Adhesive 2 Part Epoxy Glue RS ARA-400005
Bio-Rad C1000 thermal cycler Bio-Rad 1851197
Brand Microcentrifuge Tube 2 mL with Locking Lid Fisher Scientific 15338665 2 mL microcentrifuge tubes for the extraction of C-star condensates
Diamond Scribing Pen RS 394-217
Difluoro-4-hydroxybenzylidene imidazolidinone (DFHBI) Sigma-Aldrich SML1627
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich 472301
Eppendorf PCR Clean Colorless Safe-Lock Centrifuge Tubes Fisher Scientific 0030123301 0.5 mL microcentrifuge tubes for the preparation of C-star mixtures
Ethanol Absolute 99.8+% Fisher Scientific 10437341 70% ethanol is sufficient for cleaning purposes
Fisherbrand ZX4 IR Vortex Mixer Fisherbrand 13284769
Hellmanex III Hellma 9-307-011-4-507
Hollow Rectangle Capillaries ID 0.40 x 4.00 mm, 50 mm in length CM Scientific 2540-50
Mineral oil Sigma-Aldrich 69794
Mini Centrifuge, 230 V PRISM(TM) Z763128
NaCl Sigma-Aldrich S3014
NanoDrop One Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific ND-ONE-W Used to measure absorbance of oligonucleotides for concentration calculations
Oligonucleotides Integrated DNA Technologies Custom Oligonucleotide sequences are unique to the C-star design required.
ScriptGuard RNase inhibitor CELLSCRIPT C-SRI6310K RNase inhibitor
T7-FlashScribe Transcription Kit Cambio C-ASF3507
Tris-EDTA buffer, 100x stock solution Sigma-Aldrich 574793
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water Invitrogen 10977035
VWR Spec-Wipe 3 Wipers VWR 21914-758

References

  1. Buddingh’, B. C., Hest, J. C. M. v. Artificial cells: Synthetic compartments with life-like functionality and adaptivity. Acc Chem Res. 50 (4), 769-777 (2017).
  2. Fanalista, F., et al. Shape and size control of artificial cells for bottom-up biology. ACS Nano. 13 (5), 5439-5450 (2019).
  3. Dora Tang, T. -. Y., et al. Fatty acid membrane assembly on coacervate microdroplets as a step towards a hybrid protocell model. Nat Chem. 6 (6), 527-533 (2014).
  4. Deshpande, S., et al. Spatiotemporal control of coacervate formation within liposomes. Nat Commun. 10 (1), 1800 (2019).
  5. Rubio-Sánchez, R., et al. Thermally driven membrane phase transitions enable content reshuffling in primitive cells. J Am Chem Soc. 143 (40), 16589-16598 (2021).
  6. Jahnke, K., Huth, V., Mersdorf, U., Liu, N., Göpfrich, K. Bottom-up assembly of synthetic cells with a DNA cytoskeleton. ACS Nano. 16 (5), 7233-7241 (2022).
  7. Tran, M. P., et al. A DNA segregation module for synthetic cells. Small. 19 (13), 2202711 (2023).
  8. Mason, A. F., Buddingh’, B. C., Williams, D. S., Hest, J. C. M. v. Hierarchical self-assembly of a copolymer-stabilized coacervate protocell. J Am Chem Soc. 139 (48), 17309-17312 (2017).
  9. Gumz, H., et al. Toward functional synthetic cells: In-depth study of nanoparticle and enzyme diffusion through a cross-linked polymersome membrane. Adv Sci. 6 (7), 1801299 (2019).
  10. Huang, X., Patil, A. J., Li, M., Mann, S. Design and construction of higher-order structure and function in proteinosome-based protocells. J Am Chem Soc. 136 (25), 9225-9234 (2014).
  11. Booth, R., Qiao, Y., Li, M., Mann, S. Spatial positioning and chemical coupling in coacervate-in-proteinosome protocells. Angew Chem Int Ed Engl. 58 (27), 9120-9124 (2019).
  12. Hindley, J. W., et al. Light-triggered enzymatic reactions in nested vesicle reactors. Nat Commun. 9 (1), 1093 (2018).
  13. Zubaite, G., Hindley, J. W., Ces, O., Elani, Y. Dynamic reconfiguration of subcompartment architectures in artificial cells. ACS Nano. 16 (6), 9389-9400 (2022).
  14. Hirose, T., et al. A guide to membraneless organelles and their various roles in gene regulation. Nat Rev Mol Cell Biol. 24 (4), 288-304 (2023).
  15. Guindani, C., Silva, L. C. d., Cao, S., Ivanov, T., Landfester, K. Synthetic cells: From Simple Bio-Inspired Modules to Sophisticated Integrated Systems. Angew Chem Int Ed Engl. 61 (16), e202110855 (2022).
  16. Adamala, K. P., et al. Present and future of synthetic cell development. Nat Rev Mol Cell Biol. 25 (3), 162-167 (2023).
  17. Allen, M. E., et al. Biomimetic behaviors in hydrogel artificial cells through embedded organelles. Proc Natl Acad Sci U S A. 120 (35), e2307772120 (2023).
  18. Cook, A. B., Novosedlik, S., Hest, J. C. M. v. Complex coacervate materials as artificial cells. Acc Mater Res. 4 (3), 287-298 (2023).
  19. Seeman, N. C., Sleiman, H. F. DNA nanotechnology. Nat Rev Mater. 3, 17068 (2018).
  20. Takinoue, M. DNA droplets for intelligent and dynamical artificial cells: from the viewpoint of computation and non-equilibrium systems. Interface Focus. 13 (5), 20230021 (2023).
  21. Liu, W., Lupfer, C., Samanta, A., Sarkar, A., Walther, A. Switchable hydrophobic pockets in DNA protocells enhance chemical conversion. J Am Chem Soc. 145 (13), 7090-7094 (2023).
  22. Wilner, O. I., Willner, I. Functionalized DNA nanostructures. Chem Rev. 112 (4), 2528-2556 (2012).
  23. Gong, J., Tsumura, N., Sato, Y., Takinoue, M. Computational DNA droplets recognizing miRNA sequence inputs based on liquid-liquid phase separation. Adv Funct Mater. 32, 2202322 (2022).
  24. Jeon, B. -. J., Nguyen, D. T., Saleh, O. A. Sequence-controlled adhesion and microemulsification in a two-phase system of DNA liquid droplets. J Phys Chem. 124 (40), 8888-8895 (2020).
  25. Sato, Y., Sakamoto, T., Takinoue, M. Sequence-based engineering of dynamic functions of micrometer-sized DNA droplets. Sci Adv. 6 (23), 3471 (2020).
  26. Saleh, O. A., et al. Vacuole dynamics and popping-based motility in liquid droplets of DNA. Nat Commun. 14 (1), 3574 (2023).
  27. Rubio-Sánchez, R., Fabrini, G., Cicuta, P., Michele, L. D. Amphiphilic DNA nanostructures for bottom-up synthetic biology. Chem Commun. 57 (95), 12725-12740 (2021).
  28. Brady, R. A., Brooks, N. J., Cicuta, P., Di Michele, L. Crystallization of amphiphilic DNA C-Stars. Nano Lett. 17 (5), 3276-3281 (2017).
  29. Leathers, A., et al. Reaction-diffusion patterning of DNA-based artificial cells. J Am Chem Soc. 144 (38), 17468-17476 (2022).
  30. Malouf, L., et al. Sculpting DNA-based synthetic cells through phase separation and phase-targeted activity. Chem. 9 (11), 3347-3364 (2023).
  31. Fabrini, G., Minard, A., Brady, R. A., Antonio, M. D., Michele, L. D. Cation-responsive and photocleavable hydrogels from noncanonical amphiphilic DNA nanostructures. Nano Lett. 22 (2), 602-611 (2022).
  32. Brady, R. A., Brooks, N. J., Foderà, V., Cicuta, P., Di Michele, L. Amphiphilic-DNA platform for the design of crystalline frameworks with programmable structure and functionality. J Am Chem Soc. 140 (45), 15384-15392 (2018).
  33. Walczak, M., et al. Responsive core-shell DNA particles trigger lipid-membrane disruption and bacteria entrapment. Nat Commun. 12 (1), 4743 (2021).
  34. Zhang, D. Y., Winfree, E. Control of DNA strand displacement kinetics using Toehold exchange. J Am Chem Soc. 131 (47), 17303-17314 (2009).
  35. . Integrated DNA Technologies OligoAnalyzer Tool Available from: https://www.idtdna.com/pages/products/custom-dna-rna/dna-oligos/custom-dna-oligos (2024)
  36. Cavaluzzi, M. J., Borer, P. N. Revised UV extinction coefficients for nucleoside-5′-monophosphates and unpaired DNA and RNA. Nucleic Acids Res. 32 (1), e13 (2004).
  37. Lattuada, E., Caprara, D., Piazza, R., Sciortino, F. Spatially uniform dynamics in equilibrium colloidal gels. Sci Adv. 7 (49), (2021).
  38. . T7-FlashScribeTM Transcription Kit Available from: https://www.cellscript.com/products/018pl0617CS.pdf (2017)
  39. Zadeh, J. N., et al. NUPACK: Analysis and design of nucleic acid systems. J Comput Chem. 32 (1), 170-173 (2011).
  40. Walczak, M., Brady, R. A., Leathers, A., Kotar, J., Di Michele, L. Influence of hydrophobic moieties on the crystallization of amphiphilic DNA nanostructures. The Journal of Chemical Physics. 158 (8), 084501 (2023).

Play Video

Cite This Article
Malouf, L., Tanase, D. A., Di Michele, L. Synthetic Condensates and Cell-Like Architectures from Amphiphilic DNA Nanostructures. J. Vis. Exp. (207), e66738, doi:10.3791/66738 (2024).

View Video