Presentamos un protocolo para la preparación de condensados biomoleculares sintéticos consistentes en nanoestrellas de ADN anfifílico a partir de sus oligonucleótidos de ADN constituyentes. Los condensados se producen a partir de un solo componente de nanoestrella o de dos componentes y se modifican para mantener la transcripción in vitro de ARN a partir de una plantilla de ADN incrustada.
Las gotas y condensados sintéticos se están convirtiendo en constituyentes cada vez más comunes de los sistemas biomiméticos avanzados y las células sintéticas, donde se pueden utilizar para establecer la compartimentación y mantener respuestas similares a las de la vida. Las nanoestructuras de ADN sintético han demostrado un potencial significativo como bloques de construcción formadores de condensado debido a su forma programable, funcionalización química y comportamiento de autoensamblaje. Recientemente hemos demostrado que las “nanoestrellas” de ADN anfifílico, obtenidas mediante el marcaje de uniones de ADN con fracciones hidrofóbicas, constituyen una solución particularmente robusta y versátil. Los condensados de ADN anfifílico resultantes pueden programarse para mostrar arquitecturas internas complejas de múltiples compartimentos, responder estructuralmente a diversos estímulos externos, sintetizar macromoléculas, capturar y liberar cargas útiles, sufrir transformaciones morfológicas e interactuar con células vivas. Aquí, demostramos protocolos para la preparación de condensados de ADN anfifílico a partir de oligonucleótidos de ADN constituyentes. Abordaremos (i) sistemas de un solo componente que forman condensados uniformes, (ii) sistemas de dos componentes que forman condensados de núcleo y (iii) sistemas en los que los condensados se modifican para soportar la transcripción in vitro de nanoestructuras de ARN.
Las células sintéticas son dispositivos a escala micrométrica (10-50 μm) construidos de abajo hacia arriba para replicar funciones y estructuras de las células biológicas existentes 1,2. Las células sintéticas a menudo están unidas por membranas construidas a partir de vesículas bicapa lipídica 3,4,5,6,7, polimerosomas 8,9 o proteinosomas10,11, que también se pueden utilizar para establecer la compartimentación interna12,13. Inspiradas en los orgánulos sin membrana que se sabe que sostienen diversas funcionalidades en las células vivas14, estructuras como los coacervados poliméricos, los condensados biomoleculares y los hidrogeles están ganando terreno como alternativas versátiles y robustas para establecer la compartimentación externa e interna en las células sintéticas 15,16,17,18.
Aprovechando el versátil conjunto de herramientas de la nanotecnología de ADN19, se han desarrollado múltiples soluciones para diseñar gotas y condensados sintéticos a partir del autoensamblaje de nanoestructuras artificiales de ADN, cuyo tamaño, forma, funcionalidad, valencia e interacciones mutuas se pueden programar con precisión20. Las gotas o condensados de ADN son biocompatibles y pueden actuar como andamios tanto para las células sintéticas como para los orgánulos, albergando reacciones químicas y biomoleculares21, computando información22,23, capturando y liberando cargas24,25 y sosteniendo respuestas estructurales26.
Entre los diversos diseños de nanoestructuras de ADN formadoras de condensado, las nanoestrellas de ADN anfifílicas, denominadas estrellas C, han demostrado ser robustas y versátiles27. Las estrellas C son motivos ramificados simples que consisten en una unión de ADN fija (generalmente de cuatro vías), de la cual emergen brazos de ADN de doble cadena (ds)28. Luego, los brazos se llenan de fracciones hidrofóbicas, generalmente colesterol, lo que hace que las nanoestructuras sean anfifílicas e impulsan su condensación después de un recocido sencillo de una sola olla. Los condensados C-star ofrecen una programabilidad estructural y funcional precisa, incluida la posibilidad de establecer arquitecturas multicompartimentales29,30, responder estructuralmente a los desencadenantes de ADN y cationes31, sintetizar macromoléculas29, capturar y liberar cargas útiles32 e interactuar con células vivas33. A continuación, describiremos y discutiremos los protocolos para producir condensados de estrellas C a partir de sus oligonucleótidos constituyentes.
El protocolo resume la preparación de condensados unarios (de un componente) y binarios (de dos componentes), utilizando tres diseños diferentes de estrellas C (Figura 1): “No sensible”, “Sensible a TMSD” y “Plantillas de ARN”. La estrella C “no sensible” (panel A) consta de cuatro “hebras centrales” con secuencias distintas que forman la unión de cuatro vías. Cuatro oligonucleótidos idénticos modificados con colesterol están conectados a la unión, lo que garantiza que una molécula de colesterol esté presente al final de cada brazo. Las estrellas C que no responden constituyen andamios simples e inertes para condensados unarios y binarios. En la estrella C “sensible a TMSD” (panel B), la conexión entre las hebras colesterolizadas y la unión está asegurada por una hebra de “puente de detención”, que presenta un dominio de “toehold” de ADN monocatenario (ss) colgante. En presencia de una hebra de ADN invasora con un dominio de punto de apoyo complementario, se puede desencadenar una reacción de desplazamiento de la hebra mediada por un punto de apoyo34, mediante la cual el invasor desplaza el puente de detención, rompiendo la conexión entre la unión y las partes hidrofóbicas y desencadenando el desmontaje de la red de ADN32. Por último, la estrella C de “plantillas de ARN” (panel C) incluye una modificación de “Base” complementaria a una hebra “puente”, la última de las cuales enlaza la plantilla de ssDNA transcribible para el aptámero de brócoli29. Los detalles de la secuencia de los oligonucleótidos constituyentes para los tres tipos de diseños de estrellas C mencionados aquí se pueden encontrar en la Tabla Suplementaria 1 y en trabajos anteriores 29,30,32.
Figura 1. Esquemas de tres diseños diferentes de nanoestrellas de ADN anfifílico (estrellas C). Las secuencias de oligonucleótidos para varios ejemplos de las estrellas C descritas aquí se pueden encontrar en la Tabla Suplementaria 1. (A) Esquema de una estrella C diseñada para formar condensados que no responden, con las hebras de oligonucleótidos componentes “Core 1”, “Core 2”, “Core 3”, “Core 4” (coloreadas en tonos rosados) y “Colesterol terminal” (coloreadas en azul). Cada color único representa una cadena de oligonucleótidos de secuencia única. “Core 1” y “Core 3” son parcialmente complementarios a “Core 2” y “Core 4”, pero no complementarios entre sí. (B) Esquema de una estrella C diseñada para desmontarse tras la adición de una hebra invasora a través del desplazamiento de la hebra mediada por un punto de apoyo, como se describe en el trabajo anterior32. Esta estrella C está compuesta por las hebras “Core” y “Terminal cholesterol” (coloreadas en gris), así como una hebra “Terminal complemento” (mostrada en naranja) y una hebra “Toeholding bridge” (mostrada en verde azulado oscuro). Este último contiene un saliente de seis nucleótidos al que una hebra invasora adecuadamente diseñada puede unirse y posteriormente desplazar por completo la hebra del “puente de sostenimiento del pie”, lo que provoca la disociación de la unión central de la nanoestrella (compuesta por el “Núcleo 1, 2, 3 y 4”) de los dúplex compuestos por las hebras “Complemento terminal” y “Colesterol terminal”. (C) Esquema de una estrella C funcionalizada con una plantilla de ADN para un aptámero de ARN. Este también está compuesto por la hebra de “colesterol terminal” y el “Núcleo 2, 3 y 4” (todos mostrados en gris), así como una versión extendida de la hebra “Core 1” (mostrada en rosa), una hebra “Base” (marrón), una hebra “Puente” (amarillo) y la “plantilla de aptámero” (verde). El dúplex de ADN compuesto por las dos últimas hebras forma la región promotora de la polimerasa T7, que marca el sitio de inicio de la transcripción. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Los condensados de estrella C se forman tras el recocido térmico de los oligonucleótidos constituyentes, que en el protocolo presentado aquí se lleva a cabo dentro de capilares de vidrio sellados con una sección transversal rectangular de alta relación de aspecto. Estos recipientes ofrecen múltiples ventajas clave: i) El sellado garantiza que la evaporación se evite por completo durante las etapas de recocido (a veces lentas); ii) La parte inferior plana de calidad óptica de los capilares permite obtener imágenes del transitorio de autoensamblaje (o desmontaje); iii) la alta relación de aspecto de los capilares asegura que los condensados pesados se depositen en un área amplia y plana, lo que reduce las posibilidades de coalescencia y agregación en etapas posteriores del transitorio de autoensamblaje que ocurriría en contenedores en forma de cuña (por ejemplo, tubos de microcentrífuga), y produce poblaciones de condensado relativamente monodispersas; iv) Realizar el recocido en un capilar de vidrio alargado minimiza la exposición de la muestra a interfaces hidrofóbicas (aire, plástico o aceite), que se ha observado que perturban el autoensamblaje al reclutar los oligonucleótidos colesterolizados anfifílicos. Una vez completado el protocolo de montaje, los condensados pueden extraerse de los capilares de vidrio para realizar experimentos posteriores que impliquen reactivos adicionales.
El protocolo descrito aquí proporciona un enfoque para la preparación de condensados de uno o dos componentes a partir de nanoestrellas de ADN anfifílico, con variaciones de diseño para introducir diferentes respuestas en los condensados. El protocolo dado produce condensados en una solución tampón de 0,3 M de NaCl en TE, pero las condiciones tampón pueden modificarse modificando adecuadamente los volúmenes enumerados anteriormente. Trabajos previos han estudiado la formación de condensados de estrella C en 0,2 …
The authors have nothing to disclose.
LM, LDM y DT reconocen el apoyo del Consejo Europeo de Investigación (ERC) en el marco del Programa de Investigación e Innovación Horizonte 2020 (ERC-STG n.º 851667 – NANOCELL). LDM agradece el apoyo de una beca de investigación de la Royal Society para becarios de investigación (RGF/R1/180043) y el apoyo de una beca de investigación de la Royal Society University (UF160152, URF/R/221009).
0.22 μm syringe filters | Sigma-Aldrich | SLGVR33RB | |
24 x 60 mm #1.5 Rectangular cover glasses, Menzel Gläser | VWR | 631-0853 | |
2-Propanol | Sigma-Aldrich | 34683 | |
6 L Ultrasonic Cleaner with Digital Timer and Heat, 230 VAC | Cole-Parmer | WZ-08895-11 | |
Araldite Rapid Adhesive 2 Part Epoxy Glue | RS | ARA-400005 | |
Bio-Rad C1000 thermal cycler | Bio-Rad | 1851197 | |
Brand Microcentrifuge Tube 2 mL with Locking Lid | Fisher Scientific | 15338665 | 2 mL microcentrifuge tubes for the extraction of C-star condensates |
Diamond Scribing Pen | RS | 394-217 | |
Difluoro-4-hydroxybenzylidene imidazolidinone (DFHBI) | Sigma-Aldrich | SML1627 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 472301 | |
Eppendorf PCR Clean Colorless Safe-Lock Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 0030123301 | 0.5 mL microcentrifuge tubes for the preparation of C-star mixtures |
Ethanol Absolute 99.8+% | Fisher Scientific | 10437341 | 70% ethanol is sufficient for cleaning purposes |
Fisherbrand ZX4 IR Vortex Mixer | Fisherbrand | 13284769 | |
Hellmanex III | Hellma | 9-307-011-4-507 | |
Hollow Rectangle Capillaries ID 0.40 x 4.00 mm, 50 mm in length | CM Scientific | 2540-50 | |
Mineral oil | Sigma-Aldrich | 69794 | |
Mini Centrifuge, 230 V | PRISM(TM) | Z763128 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
NanoDrop One Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | Used to measure absorbance of oligonucleotides for concentration calculations |
Oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | Custom | Oligonucleotide sequences are unique to the C-star design required. |
ScriptGuard RNase inhibitor | CELLSCRIPT | C-SRI6310K | RNase inhibitor |
T7-FlashScribe Transcription Kit | Cambio | C-ASF3507 | |
Tris-EDTA buffer, 100x stock solution | Sigma-Aldrich | 574793 | |
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | Invitrogen | 10977035 | |
VWR Spec-Wipe 3 Wipers | VWR | 21914-758 |