Summary

Condensados sintéticos y arquitecturas similares a células a partir de nanoestructuras de ADN anfifílico

Published: May 31, 2024
doi:

Summary

Presentamos un protocolo para la preparación de condensados biomoleculares sintéticos consistentes en nanoestrellas de ADN anfifílico a partir de sus oligonucleótidos de ADN constituyentes. Los condensados se producen a partir de un solo componente de nanoestrella o de dos componentes y se modifican para mantener la transcripción in vitro de ARN a partir de una plantilla de ADN incrustada.

Abstract

Las gotas y condensados sintéticos se están convirtiendo en constituyentes cada vez más comunes de los sistemas biomiméticos avanzados y las células sintéticas, donde se pueden utilizar para establecer la compartimentación y mantener respuestas similares a las de la vida. Las nanoestructuras de ADN sintético han demostrado un potencial significativo como bloques de construcción formadores de condensado debido a su forma programable, funcionalización química y comportamiento de autoensamblaje. Recientemente hemos demostrado que las “nanoestrellas” de ADN anfifílico, obtenidas mediante el marcaje de uniones de ADN con fracciones hidrofóbicas, constituyen una solución particularmente robusta y versátil. Los condensados de ADN anfifílico resultantes pueden programarse para mostrar arquitecturas internas complejas de múltiples compartimentos, responder estructuralmente a diversos estímulos externos, sintetizar macromoléculas, capturar y liberar cargas útiles, sufrir transformaciones morfológicas e interactuar con células vivas. Aquí, demostramos protocolos para la preparación de condensados de ADN anfifílico a partir de oligonucleótidos de ADN constituyentes. Abordaremos (i) sistemas de un solo componente que forman condensados uniformes, (ii) sistemas de dos componentes que forman condensados de núcleo y (iii) sistemas en los que los condensados se modifican para soportar la transcripción in vitro de nanoestructuras de ARN.

Introduction

Las células sintéticas son dispositivos a escala micrométrica (10-50 μm) construidos de abajo hacia arriba para replicar funciones y estructuras de las células biológicas existentes 1,2. Las células sintéticas a menudo están unidas por membranas construidas a partir de vesículas bicapa lipídica 3,4,5,6,7, polimerosomas 8,9 o proteinosomas10,11, que también se pueden utilizar para establecer la compartimentación interna12,13. Inspiradas en los orgánulos sin membrana que se sabe que sostienen diversas funcionalidades en las células vivas14, estructuras como los coacervados poliméricos, los condensados biomoleculares y los hidrogeles están ganando terreno como alternativas versátiles y robustas para establecer la compartimentación externa e interna en las células sintéticas 15,16,17,18.

Aprovechando el versátil conjunto de herramientas de la nanotecnología de ADN19, se han desarrollado múltiples soluciones para diseñar gotas y condensados sintéticos a partir del autoensamblaje de nanoestructuras artificiales de ADN, cuyo tamaño, forma, funcionalidad, valencia e interacciones mutuas se pueden programar con precisión20. Las gotas o condensados de ADN son biocompatibles y pueden actuar como andamios tanto para las células sintéticas como para los orgánulos, albergando reacciones químicas y biomoleculares21, computando información22,23, capturando y liberando cargas24,25 y sosteniendo respuestas estructurales26.

Entre los diversos diseños de nanoestructuras de ADN formadoras de condensado, las nanoestrellas de ADN anfifílicas, denominadas estrellas C, han demostrado ser robustas y versátiles27. Las estrellas C son motivos ramificados simples que consisten en una unión de ADN fija (generalmente de cuatro vías), de la cual emergen brazos de ADN de doble cadena (ds)28. Luego, los brazos se llenan de fracciones hidrofóbicas, generalmente colesterol, lo que hace que las nanoestructuras sean anfifílicas e impulsan su condensación después de un recocido sencillo de una sola olla. Los condensados C-star ofrecen una programabilidad estructural y funcional precisa, incluida la posibilidad de establecer arquitecturas multicompartimentales29,30, responder estructuralmente a los desencadenantes de ADN y cationes31, sintetizar macromoléculas29, capturar y liberar cargas útiles32 e interactuar con células vivas33. A continuación, describiremos y discutiremos los protocolos para producir condensados de estrellas C a partir de sus oligonucleótidos constituyentes.

El protocolo resume la preparación de condensados unarios (de un componente) y binarios (de dos componentes), utilizando tres diseños diferentes de estrellas C (Figura 1): “No sensible”, “Sensible a TMSD” y “Plantillas de ARN”. La estrella C “no sensible” (panel A) consta de cuatro “hebras centrales” con secuencias distintas que forman la unión de cuatro vías. Cuatro oligonucleótidos idénticos modificados con colesterol están conectados a la unión, lo que garantiza que una molécula de colesterol esté presente al final de cada brazo. Las estrellas C que no responden constituyen andamios simples e inertes para condensados unarios y binarios. En la estrella C “sensible a TMSD” (panel B), la conexión entre las hebras colesterolizadas y la unión está asegurada por una hebra de “puente de detención”, que presenta un dominio de “toehold” de ADN monocatenario (ss) colgante. En presencia de una hebra de ADN invasora con un dominio de punto de apoyo complementario, se puede desencadenar una reacción de desplazamiento de la hebra mediada por un punto de apoyo34, mediante la cual el invasor desplaza el puente de detención, rompiendo la conexión entre la unión y las partes hidrofóbicas y desencadenando el desmontaje de la red de ADN32. Por último, la estrella C de “plantillas de ARN” (panel C) incluye una modificación de “Base” complementaria a una hebra “puente”, la última de las cuales enlaza la plantilla de ssDNA transcribible para el aptámero de brócoli29. Los detalles de la secuencia de los oligonucleótidos constituyentes para los tres tipos de diseños de estrellas C mencionados aquí se pueden encontrar en la Tabla Suplementaria 1 y en trabajos anteriores 29,30,32.

Figure 1
Figura 1. Esquemas de tres diseños diferentes de nanoestrellas de ADN anfifílico (estrellas C). Las secuencias de oligonucleótidos para varios ejemplos de las estrellas C descritas aquí se pueden encontrar en la Tabla Suplementaria 1. (A) Esquema de una estrella C diseñada para formar condensados que no responden, con las hebras de oligonucleótidos componentes “Core 1”, “Core 2”, “Core 3”, “Core 4” (coloreadas en tonos rosados) y “Colesterol terminal” (coloreadas en azul). Cada color único representa una cadena de oligonucleótidos de secuencia única. “Core 1” y “Core 3” son parcialmente complementarios a “Core 2” y “Core 4”, pero no complementarios entre sí. (B) Esquema de una estrella C diseñada para desmontarse tras la adición de una hebra invasora a través del desplazamiento de la hebra mediada por un punto de apoyo, como se describe en el trabajo anterior32. Esta estrella C está compuesta por las hebras “Core” y “Terminal cholesterol” (coloreadas en gris), así como una hebra “Terminal complemento” (mostrada en naranja) y una hebra “Toeholding bridge” (mostrada en verde azulado oscuro). Este último contiene un saliente de seis nucleótidos al que una hebra invasora adecuadamente diseñada puede unirse y posteriormente desplazar por completo la hebra del “puente de sostenimiento del pie”, lo que provoca la disociación de la unión central de la nanoestrella (compuesta por el “Núcleo 1, 2, 3 y 4”) de los dúplex compuestos por las hebras “Complemento terminal” y “Colesterol terminal”. (C) Esquema de una estrella C funcionalizada con una plantilla de ADN para un aptámero de ARN. Este también está compuesto por la hebra de “colesterol terminal” y el “Núcleo 2, 3 y 4” (todos mostrados en gris), así como una versión extendida de la hebra “Core 1” (mostrada en rosa), una hebra “Base” (marrón), una hebra “Puente” (amarillo) y la “plantilla de aptámero” (verde). El dúplex de ADN compuesto por las dos últimas hebras forma la región promotora de la polimerasa T7, que marca el sitio de inicio de la transcripción. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los condensados de estrella C se forman tras el recocido térmico de los oligonucleótidos constituyentes, que en el protocolo presentado aquí se lleva a cabo dentro de capilares de vidrio sellados con una sección transversal rectangular de alta relación de aspecto. Estos recipientes ofrecen múltiples ventajas clave: i) El sellado garantiza que la evaporación se evite por completo durante las etapas de recocido (a veces lentas); ii) La parte inferior plana de calidad óptica de los capilares permite obtener imágenes del transitorio de autoensamblaje (o desmontaje); iii) la alta relación de aspecto de los capilares asegura que los condensados pesados se depositen en un área amplia y plana, lo que reduce las posibilidades de coalescencia y agregación en etapas posteriores del transitorio de autoensamblaje que ocurriría en contenedores en forma de cuña (por ejemplo, tubos de microcentrífuga), y produce poblaciones de condensado relativamente monodispersas; iv) Realizar el recocido en un capilar de vidrio alargado minimiza la exposición de la muestra a interfaces hidrofóbicas (aire, plástico o aceite), que se ha observado que perturban el autoensamblaje al reclutar los oligonucleótidos colesterolizados anfifílicos. Una vez completado el protocolo de montaje, los condensados pueden extraerse de los capilares de vidrio para realizar experimentos posteriores que impliquen reactivos adicionales.

Protocol

NOTA: El protocolo se divide en tres secciones. En la sección 1 se describen los pasos previos, incluida la preparación de oligonucleótidos de ADN y capilares de vidrio. La sección 2 describe la preparación de condensados de estrella C de varios diseños, incluidos diseños de uno y dos componentes, y su extracción de los capilares de vidrio. En la sección 3 se describe el uso de condensados de estrella C de plantillas de ARN de un componente para la síntesis de un aptámero de ARN. El usuario debe seguir las bue…

Representative Results

Después del recocido, los condensados de estrella C se pueden obtener imágenes directamente en el tubo capilar, o después de la extracción, para confirmar su formación. Para todas las variaciones de diseño de la estrella C, se deben observar distintos condensados esféricos o poliédricos de aproximadamente 10-50 μm de diámetro, este último se forma cuando se produce la cristalización28,32. En el caso de los condensados de un solo componente, los conden…

Discussion

El protocolo descrito aquí proporciona un enfoque para la preparación de condensados de uno o dos componentes a partir de nanoestrellas de ADN anfifílico, con variaciones de diseño para introducir diferentes respuestas en los condensados. El protocolo dado produce condensados en una solución tampón de 0,3 M de NaCl en TE, pero las condiciones tampón pueden modificarse modificando adecuadamente los volúmenes enumerados anteriormente. Trabajos previos han estudiado la formación de condensados de estrella C en 0,2 …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

LM, LDM y DT reconocen el apoyo del Consejo Europeo de Investigación (ERC) en el marco del Programa de Investigación e Innovación Horizonte 2020 (ERC-STG n.º 851667 – NANOCELL). LDM agradece el apoyo de una beca de investigación de la Royal Society para becarios de investigación (RGF/R1/180043) y el apoyo de una beca de investigación de la Royal Society University (UF160152, URF/R/221009).

Materials

0.22 μm syringe filters Sigma-Aldrich SLGVR33RB
24 x 60 mm #1.5 Rectangular cover glasses, Menzel Gläser VWR 631-0853
2-Propanol Sigma-Aldrich 34683
6 L Ultrasonic Cleaner with Digital Timer and Heat, 230 VAC Cole-Parmer WZ-08895-11
Araldite Rapid Adhesive 2 Part Epoxy Glue RS ARA-400005
Bio-Rad C1000 thermal cycler Bio-Rad 1851197
Brand Microcentrifuge Tube 2 mL with Locking Lid Fisher Scientific 15338665 2 mL microcentrifuge tubes for the extraction of C-star condensates
Diamond Scribing Pen RS 394-217
Difluoro-4-hydroxybenzylidene imidazolidinone (DFHBI) Sigma-Aldrich SML1627
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich 472301
Eppendorf PCR Clean Colorless Safe-Lock Centrifuge Tubes Fisher Scientific 0030123301 0.5 mL microcentrifuge tubes for the preparation of C-star mixtures
Ethanol Absolute 99.8+% Fisher Scientific 10437341 70% ethanol is sufficient for cleaning purposes
Fisherbrand ZX4 IR Vortex Mixer Fisherbrand 13284769
Hellmanex III Hellma 9-307-011-4-507
Hollow Rectangle Capillaries ID 0.40 x 4.00 mm, 50 mm in length CM Scientific 2540-50
Mineral oil Sigma-Aldrich 69794
Mini Centrifuge, 230 V PRISM(TM) Z763128
NaCl Sigma-Aldrich S3014
NanoDrop One Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific ND-ONE-W Used to measure absorbance of oligonucleotides for concentration calculations
Oligonucleotides Integrated DNA Technologies Custom Oligonucleotide sequences are unique to the C-star design required.
ScriptGuard RNase inhibitor CELLSCRIPT C-SRI6310K RNase inhibitor
T7-FlashScribe Transcription Kit Cambio C-ASF3507
Tris-EDTA buffer, 100x stock solution Sigma-Aldrich 574793
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water Invitrogen 10977035
VWR Spec-Wipe 3 Wipers VWR 21914-758

References

  1. Buddingh’, B. C., Hest, J. C. M. v. Artificial cells: Synthetic compartments with life-like functionality and adaptivity. Acc Chem Res. 50 (4), 769-777 (2017).
  2. Fanalista, F., et al. Shape and size control of artificial cells for bottom-up biology. ACS Nano. 13 (5), 5439-5450 (2019).
  3. Dora Tang, T. -. Y., et al. Fatty acid membrane assembly on coacervate microdroplets as a step towards a hybrid protocell model. Nat Chem. 6 (6), 527-533 (2014).
  4. Deshpande, S., et al. Spatiotemporal control of coacervate formation within liposomes. Nat Commun. 10 (1), 1800 (2019).
  5. Rubio-Sánchez, R., et al. Thermally driven membrane phase transitions enable content reshuffling in primitive cells. J Am Chem Soc. 143 (40), 16589-16598 (2021).
  6. Jahnke, K., Huth, V., Mersdorf, U., Liu, N., Göpfrich, K. Bottom-up assembly of synthetic cells with a DNA cytoskeleton. ACS Nano. 16 (5), 7233-7241 (2022).
  7. Tran, M. P., et al. A DNA segregation module for synthetic cells. Small. 19 (13), 2202711 (2023).
  8. Mason, A. F., Buddingh’, B. C., Williams, D. S., Hest, J. C. M. v. Hierarchical self-assembly of a copolymer-stabilized coacervate protocell. J Am Chem Soc. 139 (48), 17309-17312 (2017).
  9. Gumz, H., et al. Toward functional synthetic cells: In-depth study of nanoparticle and enzyme diffusion through a cross-linked polymersome membrane. Adv Sci. 6 (7), 1801299 (2019).
  10. Huang, X., Patil, A. J., Li, M., Mann, S. Design and construction of higher-order structure and function in proteinosome-based protocells. J Am Chem Soc. 136 (25), 9225-9234 (2014).
  11. Booth, R., Qiao, Y., Li, M., Mann, S. Spatial positioning and chemical coupling in coacervate-in-proteinosome protocells. Angew Chem Int Ed Engl. 58 (27), 9120-9124 (2019).
  12. Hindley, J. W., et al. Light-triggered enzymatic reactions in nested vesicle reactors. Nat Commun. 9 (1), 1093 (2018).
  13. Zubaite, G., Hindley, J. W., Ces, O., Elani, Y. Dynamic reconfiguration of subcompartment architectures in artificial cells. ACS Nano. 16 (6), 9389-9400 (2022).
  14. Hirose, T., et al. A guide to membraneless organelles and their various roles in gene regulation. Nat Rev Mol Cell Biol. 24 (4), 288-304 (2023).
  15. Guindani, C., Silva, L. C. d., Cao, S., Ivanov, T., Landfester, K. Synthetic cells: From Simple Bio-Inspired Modules to Sophisticated Integrated Systems. Angew Chem Int Ed Engl. 61 (16), e202110855 (2022).
  16. Adamala, K. P., et al. Present and future of synthetic cell development. Nat Rev Mol Cell Biol. 25 (3), 162-167 (2023).
  17. Allen, M. E., et al. Biomimetic behaviors in hydrogel artificial cells through embedded organelles. Proc Natl Acad Sci U S A. 120 (35), e2307772120 (2023).
  18. Cook, A. B., Novosedlik, S., Hest, J. C. M. v. Complex coacervate materials as artificial cells. Acc Mater Res. 4 (3), 287-298 (2023).
  19. Seeman, N. C., Sleiman, H. F. DNA nanotechnology. Nat Rev Mater. 3, 17068 (2018).
  20. Takinoue, M. DNA droplets for intelligent and dynamical artificial cells: from the viewpoint of computation and non-equilibrium systems. Interface Focus. 13 (5), 20230021 (2023).
  21. Liu, W., Lupfer, C., Samanta, A., Sarkar, A., Walther, A. Switchable hydrophobic pockets in DNA protocells enhance chemical conversion. J Am Chem Soc. 145 (13), 7090-7094 (2023).
  22. Wilner, O. I., Willner, I. Functionalized DNA nanostructures. Chem Rev. 112 (4), 2528-2556 (2012).
  23. Gong, J., Tsumura, N., Sato, Y., Takinoue, M. Computational DNA droplets recognizing miRNA sequence inputs based on liquid-liquid phase separation. Adv Funct Mater. 32, 2202322 (2022).
  24. Jeon, B. -. J., Nguyen, D. T., Saleh, O. A. Sequence-controlled adhesion and microemulsification in a two-phase system of DNA liquid droplets. J Phys Chem. 124 (40), 8888-8895 (2020).
  25. Sato, Y., Sakamoto, T., Takinoue, M. Sequence-based engineering of dynamic functions of micrometer-sized DNA droplets. Sci Adv. 6 (23), 3471 (2020).
  26. Saleh, O. A., et al. Vacuole dynamics and popping-based motility in liquid droplets of DNA. Nat Commun. 14 (1), 3574 (2023).
  27. Rubio-Sánchez, R., Fabrini, G., Cicuta, P., Michele, L. D. Amphiphilic DNA nanostructures for bottom-up synthetic biology. Chem Commun. 57 (95), 12725-12740 (2021).
  28. Brady, R. A., Brooks, N. J., Cicuta, P., Di Michele, L. Crystallization of amphiphilic DNA C-Stars. Nano Lett. 17 (5), 3276-3281 (2017).
  29. Leathers, A., et al. Reaction-diffusion patterning of DNA-based artificial cells. J Am Chem Soc. 144 (38), 17468-17476 (2022).
  30. Malouf, L., et al. Sculpting DNA-based synthetic cells through phase separation and phase-targeted activity. Chem. 9 (11), 3347-3364 (2023).
  31. Fabrini, G., Minard, A., Brady, R. A., Antonio, M. D., Michele, L. D. Cation-responsive and photocleavable hydrogels from noncanonical amphiphilic DNA nanostructures. Nano Lett. 22 (2), 602-611 (2022).
  32. Brady, R. A., Brooks, N. J., Foderà, V., Cicuta, P., Di Michele, L. Amphiphilic-DNA platform for the design of crystalline frameworks with programmable structure and functionality. J Am Chem Soc. 140 (45), 15384-15392 (2018).
  33. Walczak, M., et al. Responsive core-shell DNA particles trigger lipid-membrane disruption and bacteria entrapment. Nat Commun. 12 (1), 4743 (2021).
  34. Zhang, D. Y., Winfree, E. Control of DNA strand displacement kinetics using Toehold exchange. J Am Chem Soc. 131 (47), 17303-17314 (2009).
  35. . Integrated DNA Technologies OligoAnalyzer Tool Available from: https://www.idtdna.com/pages/products/custom-dna-rna/dna-oligos/custom-dna-oligos (2024)
  36. Cavaluzzi, M. J., Borer, P. N. Revised UV extinction coefficients for nucleoside-5′-monophosphates and unpaired DNA and RNA. Nucleic Acids Res. 32 (1), e13 (2004).
  37. Lattuada, E., Caprara, D., Piazza, R., Sciortino, F. Spatially uniform dynamics in equilibrium colloidal gels. Sci Adv. 7 (49), (2021).
  38. . T7-FlashScribeTM Transcription Kit Available from: https://www.cellscript.com/products/018pl0617CS.pdf (2017)
  39. Zadeh, J. N., et al. NUPACK: Analysis and design of nucleic acid systems. J Comput Chem. 32 (1), 170-173 (2011).
  40. Walczak, M., Brady, R. A., Leathers, A., Kotar, J., Di Michele, L. Influence of hydrophobic moieties on the crystallization of amphiphilic DNA nanostructures. The Journal of Chemical Physics. 158 (8), 084501 (2023).

Play Video

Cite This Article
Malouf, L., Tanase, D. A., Di Michele, L. Synthetic Condensates and Cell-Like Architectures from Amphiphilic DNA Nanostructures. J. Vis. Exp. (207), e66738, doi:10.3791/66738 (2024).

View Video