Summary

Mastceller i mikromiljøet til hepatocellulært karsinom gir gunstig prognose: En retrospektiv studie ved bruk av QuPath bildeanalyseprogramvare

Published: April 12, 2024
doi:

Summary

Tilstedeværelsen av mastceller i den indre marginen og peritumorområdene av hepatocellulært karsinom etter reseksjon gir en gunstig prognose. Denne studien støtter QuPath-bildeanalyseprogramvare som en lovende plattform som kan møte behovet for reproduserbarhet, konsistens og nøyaktighet i digital patologi.

Abstract

Innsikten gitt av in-situ deteksjon av immunceller i hepatocellulært karsinom (HCC) kan gi informasjon om pasientutfall. Studier som undersøker uttrykk og lokalisering av immunceller i tumorvev er assosiert med flere utfordringer, inkludert mangel på presis merknad for tumorregioner og tilfeldig utvalg av mikroskopiske synsfelt. QuPath er en åpen kildekode, brukervennlig programvare som kan møte det økende behovet for digital patologi i hellysbildeanalyse (WSI).

Infiltrasjonen av HCC og tilstøtende vev av CD1a+ umodne dendrittiske celler (iDC), CD117+ mastceller og NKp46+ naturlige drepeceller (NKs) celler ble vurdert immunhistokjemisk i representative prøver av 67 pasienter med HCC som gjennomgikk kurativ reseksjon. Arealfraksjonen (AF) av positivt fargede celler ble vurdert automatisk i WSI-er ved bruk av QuPath i tumorsenteret (TC), indre margin (IM), ytre margin (OM) og peritumor (PT) området. Den prognostiske betydningen av immunceller ble evaluert for tid til tilbakefall (TTR), sykdomsfri overlevelse (DFS) og total overlevelse (OS).

AF for mastceller var signifikant større enn AF for NK-er, og AF for iDC-er var signifikant lavere sammenlignet med NK-er i hver region av interesse. Høye AF-er av mastceller i IM- og PT-områdene var assosiert med lengre DFS. I tillegg var høy AF av mastceller i IM assosiert med lengre OS.

Dataassistert analyse ved hjelp av denne programvaren er et egnet verktøy for å innhente prognostisk informasjon for tumorinfiltrerende immunceller (iDC, mastceller og NK) i forskjellige regioner av HCC etter reseksjon. Mastceller viste størst AF i alle interesseområder (ROI). Mastceller i peritumorregionen og IM viste positiv prognostisk signifikans.

Introduction

Den romlige organiseringen og overfloden av tumorinfiltrerende immunceller har vist seg å påvirke overlevelse i forskjellige kreftformer, hepatocellulært karsinom (HCC) inkluderte 1,2,3,4. Den prognostiske betydningen av tumorinfiltrerende lymfocytter i kreft ble først vist på hematoksylin og eosin (H&E) fargede seksjoner 5,6. Deretter viste en pionerstudie av Galon et al. ved bruk av immunhistokjemi (IHC) viste assosiasjoner av tettheten av CD3 + og CD8 + T-celler i tykktarmskreftvev med prognose4.

IHC er en gullstandard for visualisering, kvantifisering og kartlegging av immunceller i tumorvev for videre assosiasjon med kliniske utfall7. IHC gir flere fordeler, som lave kostnader, utbredt tilgjengelighet og kompatibilitet med formalinfiksert parafininnebygd (FFPE) vev8. Nøyaktig vurdering av IHC-fargede immunceller er imidlertid en stor utfordring. Tradisjonell skåring i utvalgte mikroskopiske synsfelt er tidkrevende og ikke lenger tilstrekkelig for å sikre den høykvalitets, reproduserbare, objektive analysen som er avgjørende for kandidatbiomarkørvalg og pålitelig klinisk korrelasjon9. Hellysbildeskanninger kan vurderes som et helt bilde eller etter delsampling10.

Datastyrt kvantitativ vurdering av overfloden av immunceller i vevsprøver kan sikre praktiske, nøyaktige, pålitelige og klinisk relevante data11. QuPath er en gratis programvare med åpen kildekode som muliggjør digital bildeanalyse av IHC-fargede lysbilder og maksimerer mengden informasjon som gis fra individuelle prøver12.

Siden umodne dendrittiske celler (iDC), naturlige drepeceller (NK) og mastceller er involvert i antitumorimmunresponser og ble vist å korrelere med pasientenes utfall 13,14,15, presenterer vi her en trinn-for-trinn-protokoll for å vurdere deres romlige fordeling i FFPE HCC-vev og utforske deres prognostiske innvirkning. CD1a uttrykkes hovedsakelig på membranen til umodne dendrittiske celler, hvis tetthet har vært assosiert med kliniske utfall i en rekke humane svulster16,17. Mastceller kan spille en protumor- eller antitumorrolle i tumormikromiljøet (TME)18. De kan støtte angiogenese og lette metastase19. Omvendt har det blitt rapportert at mastceller kan formidle tumorcelleapoptose gjennom produksjon av IL-420. Anti-CD117-farging brukes ofte til å visualisere og kvantifisere mastceller i tumorvevet21. NK-celler antas å bidra til overvåking og kontroll av HCC22 ved å drepe kreftceller23. NKp46-ekspresjon av NK er en avgjørende parameter for deres antitumoraktivitet24. Imidlertid korrelerte NKp46+ NK-celler positivt med tumordiameter hos HCC-pasienter25. Til tross for dette er lite kjent om deres sammenheng med pasientoverlevelse.

Vi hadde som mål å kvantitativt vurdere overfloden av CD1a+ iDC, CD117+ mastceller og NKp46+ NK-celler i forskjellige regioner av HCC og fremheve deres prognostiske betydning. Totalt 70 påfølgende pasienter med patologisk bekreftet stadium I-IV HCC, som var kvalifisert for reseksjon i henhold til BCLC-retningslinjene og gjennomgikk kurativ leverreseksjon ved Pilsen universitetssykehus mellom 1997 og 2019, ble inkludert i den nåværende retrospektive studien. Patologirapporter fra pasientene ble gjennomgått. Ingen av pasientene som ble inkludert i denne studien hadde fjernmetastaser og hadde heller ikke fått neoadjuvant behandling som kjemoterapi eller strålebehandling før operasjonen. Totalt 3 pasienter med histologiske prøver av dårlig kvalitet ble ekskludert, og de resterende 67 pasientene ble inkludert i studien (tab 1).

Protocol

Denne protokollen var en del av en studie utført i samsvar med de etiske standardene fastsatt i Helsinki-erklæringen (2013-versjonen); den ble godkjent av Etisk komité ved Det medisinske fakultet og Universitetssykehuset i Pilsen (118/2021, 11. mars 2021). Figur 1 viser en oppsummering av metodene som er benyttet. 1. Valg av FFPE-vevsblokker Hent FFPE-blokkidentifikatorer fra pasientfiler ved hjelp av behandlende leger eller patologer. Be om FFPE-blokkene fra det lokale patologiarkivet. For hver pasient, velg 2-3 FFPE-blokker som inneholder levedyktig tumorvev, fortrinnsvis med det omkringliggende peritumorområdet og ikke-tumorleveren.MERK: Det anbefales å innhente en ekspertpatologs uttalelse for dette valget. Histologisk vurdering av ikke-tumorleveren, sammen med anamutestiske, kliniske og laboratoriedata ble brukt til å definere den underliggende etiologien til HCC. 2. Avparafinisering og rehydrering av FFPE-vev Skjær en eller to vevsseksjoner med 4 μm tykkelse fra hver av FFPE-vevsblokkene på et mikrotom.NOTAT: Tykkelsen på seksjonene kan være mellom 3 μm og 5 μm uten merkbar flekkpåvirkning; en tykkelse på 4 μm er imidlertid standarden. Legg seksjonene i vannbad (42 °C) for å fjerne rynker. Monter objektglassene ved å plukke dem opp og plassere dem på et positivt ladet glassmikroskopisklie. Påfør deretter objektglassene for tørking ved omgivelsestemperatur (AT) i 24 timer. Plasser objektglassene i en termostat (56 °C) i 1 time. Bruk en autofarginger til å avparafinisere seksjonene i avvoksløsning-1 (30 s ved 72 °C), dewax solution-2 (10 s ved 72 °C), dewax solution-3 (10 s ved AT), etanol 96%-1 (10 s), etanol 96%-2 (10 s) og etanol 96%-3 (10 s). Bruk en autofarginger til å rehydrere seksjonene i vaskeløsning-1 (10 s, AT), vaskeløsning-2 (10 s, AT) og vaskeløsning-3 (5 min, AT). 3. Utføre IHC i en helautomatisk farging NOTAT: IHC utføres i henhold til produsentens protokoll. Trinnene er kort forklart nedenfor. Metode for uthenting av antigenHent antigen ved hjelp av prosedyren for varmeindusert epitophenting (ER) i en ER-løsning med høy pH (f.eks. Tris-EDTA): ER-løsning-1 (10 s, AT), ER-løsning-2 (10 s, AT), ER-løsning-3 (20 min ved 100 °C), ER-løsning-4 (12 min, AT). Skyll objektglasset i en vaskeløsning i 3x (30 s hver) og 1x (3 min). Blokker endogen peroksidase ved hjelp av peroksidblokkløsningen i 5 minutter ved AT. Skyll i en vaskeløsning i 3x (30 s hver). Blokker uspesifikk binding av antistoffer med en proteinblokk for NKp46 kun i 30 min. ved AT. Binding med primære antistoffer: Inkuber med primære antistoffer i 15 minutter ved AT, skyll deretter med en vaskeløsning i 3x (30 s hver). For sekundær antistoffbinding, følg trinnene beskrevet nedenfor.Inkuber med pepperrotperoksidase-konjugerte sekundære antistoffer i 8 minutter ved AT. Skyll med en vaskeløsning i 2x (2 min hver) og 1x med avionisert vann. Visualiser reaksjonen ved å skylle objektglassene med diaminobenzidin (DAB) løsning og deretter inkubere dem med DAB-løsningen i 10 minutter ved AT. Skyll i 3x (30 s) med avionisert vann. Motbeis seksjonene med Mayers hematoksylin. Skyll med avionisert vann i 1x (30 s), vaskeløsning i 1x (30 s) og avionisert vann i 1x (30 s). Bruk en helautomatisk objektglassfarging til å dehydrere seksjonene i etanol 70 % (2 min), etanol 80 % (2 min), etanol 96 %-1 (3 min), etanol 96 %-2 (3 min), etanol 100 % (3 min), xylen-1 (4 min), xylen-2 (4 min) og xylen-3 (4 min). Bruk en helautomatisk glassdekkeenhet til å montere seksjonene på lysbildene i et monteringsmedium.MERK: Negative og positive (mandler) vevskontrollamples ble brukt hele veien. 4. Innhenting av hellysbildeskanninger Skann de fargede lysbildene ved hjelp av 20x objektivet og moderat-høy tetthet av fokus på en helglassskanner. 5. IHC-analyse ved hjelp av programvaren Lag et prosjekt for IHC-bildene i programvaren.Last ned og åpne QuPath-0.4.3 (eller nyere).exe Opprett en ny mappe med et passende navn. Klikk på Opprett prosjekt knappen i øvre venstre hjørne av programvaren og velg den nyopprettede mappen. Dra skannede bilder inn i programvarevinduet. Når et nytt vindu automatisk dukker opp, velger du Angi bildetype > H-DAB og klikker på Importer (Figur 2). Se listen over bilder i venstre vindu i menyen; Dobbeltklikk for å åpne bildet. Velg fra hovedmenyen øverst Fil for å lagre bildene som et prosjekt.MERK: Programvaren kan håndtere et bredt spekter av bildeformater, inkludert mange hele lysbildeformater. Tiff-format foretrekkes imidlertid for å forhindre tap av rådata og tilhørende metadata. Kommentere interesseområderVelg børsteverktøyet eller tryllestavverktøyet fra hovedmenyen øverst for å kommentere tumorområdet. For diskontinuerlige områder av svulsten, følg trinn 5.2.1.1-5.2.1.3.Kommenter dem separat. Trykk og hold inne Ctrl-tasten mens du velger alle tumorregioner Høyreklikk og velg Rediger flere > Slå sammen valgt. Forsikre deg om at tumormerknaden er valgt (kanter har en gul farge). Klikk på Automatiser i hovedmenyen og velg Vis Script Editor. Kopier skriptet som er tilgjengelig i tilleggsfil 1 eller https://petebankhead.github.io/qupath/scripts/2018/08/08/three-regions.htmls og lim det inn i Skriptredigering, og klikk deretter på Kjør. ROI-ene: tumorsenter (TC), indre margin (IM), ytre margin (OM) og peritumorområde (PT) vil bli opprettet og merket automatisk. Hvis du vil ha en alternativ måte å opprette områder av interesse på, følger du trinn 5.2.5.1-5.2.5.5.Velg Polyline-verktøyet fra hovedmenyen øverst for å tegne en kant som skiller de ondartede cellereirene og tilstøtende ikke-tumorvev. Velg den resulterende kantlinjen. Velg fra hovedmenyen øverst Objekter > Merknad > Utvid merknader > 500 μm for Ekspansjonsradius > Flatt for linjehette. Aktiver Fjern interiør og aktiver Begrens til overordnet. Høyreklikk på den resulterende merknaden, Rediger enkelt > del. To separate merknader utvides automatisk som 500 μm brede områder på hver side av grensen. Gi de kommenterte områdene riktig navn for direktemeldinger og OM ved å høyreklikke merknaden i listen til venstre, velge Angi egenskaper og skrive inn navnet. TC representerer det gjenværende tumorområdet. Utvid det 500 μm brede PT-området ved siden av OM ved hjelp av samme prosedyre.MERK: Kommenterte lysbilder og QuPath AF-deteksjoner ble gjennomgått av en eksperthistopatolog. Optimalisering av pikselklassifiseringVelg rektangelverktøyet fra hovedmenyen. Kommenter deretter et område, som inneholder alle typer piksler som skal skilles (f.eks. hematoksylin, DAB og bakgrunn). Fra hovedmenyen velger du Analyser > forbehandling > estimer flekkvektor. Når vinduet Visual Stain Editor dukker opp automatisk, velger du Auto > OK og angir H-DAB estimert som navnet på flekkvektoren. For en alternativ metode, følg trinn 5.3.4.1-5.3.4.3.Velg rektangelverktøyet fra hovedmenyen og kommenter et lite område av en typisk kjerne farget med hematoksylin. Velg Bilde fra menyen til venstre og dobbeltklikk på Flekk 1 > Ja. Velg rektangelverktøyet fra hovedmenyen og kommenter et lite område med positiv farging med DAB. Velg Bilde fra menyen til venstre og dobbeltklikk på Flekk 2 > Ja. Vurdering av arealfraksjon av positive immunceller ved hjelp av alternativet Pikselklassifisering .Fra hovedmenyen klikker du på Klassifiser > pikselklassifisering > Opprett terskel. Velg Høy for oppløsningen > kanal: DAB > Forfilter: Gaussisk > Sigma: 0.5 > (Figur 3) Terskel: (0.2-0.3) > Over terskel: Positiv > Under terskel: Negativ. Velg Enhver merknad for området, skriv inn et navn for klassifisereren > Lagre > mål > OK. De DAB-positive cellene vil bli endret til rød farge (figur 4). Kopier resultatene fra menyen til venstre til et regneark. Eller åpne Mål i den øvre hovedmenyen, velg Vis merknadsmålinger > Kopier til utklippstavlen, og lim inn resultatene i et regneark. Hvis du vil lukke bildet, høyreklikker du > Multi View > Close Viewer.MERK: Før kvantifisering ble alle artefakter eliminert. Terskelen ble justert for hvert tilfelle med en svak spesifikk positiv farging. Riktigheten av merknader og pikselklassifisering ble først kryssjekket og deretter gjennomgått av en senior histopatolog. Alle analyser ble gjort på en blind måte. Mer informasjon om analysen av IHC ved hjelp av programvaren finner du på https://forum.image.sc/tag/QP. 6. Statistiske metoder og dataanalyse Studiens endepunkter var tid til tilbakefall (TTR), sykdomsfri overlevelse (DFS) og total overlevelse (OS). Pasienter uten tilbakefall eller død ble sensurert ved siste oppfølging.MERK: Kontinuerlige ikke-normalfordelte data uttrykkes som median (min-maks). Andeler uttrykkes som rådata (prosent). Arealfraksjoner av immunceller i forskjellige interesseområder (ROI) ble sammenlignet av Friedman ANOVA, etterfulgt av Wilcoxon-matchet partest med Bonferroni-korreksjon. På grunn av den ikke-parametriske fordelingen av de fleste variablene, ble Spearman-korrelasjonen brukt til å evaluere assosiasjonene mellom par av ordinære eller kvantitative variabler. For å bestemme den prognostiske verdien av individuelle prediktorer for endepunkter, ble det utført en univariabel etterfulgt av multivariabel Cox-regresjonsanalyse. Hazard ratios (HR) ble beregnet. HR viste den relative risikoen for den kombinerte middels høye gruppen sammenlignet med 1 for den lave gruppen. Alle overlevelsesestimater ble beregnet med Kaplan-Meier-metoden og sammenlignet mellom gruppene med log-rank-testen. GraphPad Prism 9.0 (GraphPad Software LLC) ble brukt til de statistiske analysene. En 2-sidig p-verdi < 0,05 ble ansett som statistisk signifikant.

Representative Results

Demografi og kliniske karakteristika for pasientene er presentert i tabell 1. Median alder for pasientene var 69 år, og de fleste var menn (77,6 %). Når det gjelder etiologien til HCC, var kronisk ikke-viral hepatitt den hyppigste bakgrunnssykdommen, med en prevalens av ikke-alkoholisk steatohepatitt (NASH) (23,9%). Kun 15 pasienter (22,4 %) hadde skrumplever som bakgrunnssykdom. Et flertall av pasientene (68,7 %) hadde TNM stadium I. Mer detaljerte kliniske og patologiske funn ble beskrevet i vårt tidligere publiserte arbeid 2,26. ResultaterVed siste oppfølging ble tumorresidiv observert hos 29 (41,8 %) pasienter, hvorav 89,7 % hadde lokalt residiv og 38 (56,7 %) pasienter var døde. 5 år etter operasjonen var andelen DFS 33,2 %, andelen OS var 49,4 % og den residivfrie andelen (RFP) var 48,7 % (tabell 2). Fordeling av immunceller i ulike regioner av interesseCD117-proteinet ble hovedsakelig funnet i den cytoplasmatiske membranen til avrundede celler (figur 5A). I TC og IM var de for det meste lokalisert i stroma og i det perivaskulære rommet. I OM- og PT-områdene ble CD117+-cellene observert i tumorkapselen og i det perivaskulære rommet. NKp46-proteinet ble hovedsakelig funnet i den cytoplasmatiske membranen til avrundede celler, som var tilstede inne i sinuslignende rom i TC og IM, samt var assosiert med stroma (figur 5B). I OM- og PT-området ble NKp46+-celler observert i kapsler rundt tumorreir og i stroma i portalveier. CD1a-proteinet ble funnet i TC og IM, for det meste i den cytoplasmatiske membranen til avrundede celler (spredt eller i aggregater) i stroma, innenfor og langs grensene til sinuslignende rom (figur 5C). I PT-området ble CD1a+ DC observert innenfor og langs grensene til sinusoider og innenfor galleepitelet i portalkanalene. AF for mastceller var signifikant større enn AF for NKp46+-celler (p < 0,001) (figur 6). CD1a+ iDC-er i hver ROI viste lavest AF sammenlignet med mastceller og NK-celler (p < 0,001) (figur 6). AF av CD117+ og NKp46+ celler i TC eller IM var signifikant mindre enn de i PT-området og OM (p < 0,001) (figur 6). For CD1a+-celler skilte ikke AF seg signifikant mellom regioner. Signifikante assosiasjoner for individuelle immunceller mellom alle ROI er vist i tabell 3. Figur 7 viser varmekartet for signifikante assosiasjoner mellom ulike immunceller innenfor ulike regioner. AF av CD117 + mastceller i TC korrelerte signifikant med AF av CD1a i TC og IM. Prognostisk verdi av kliniske og patologiske variablerBlant de kliniske og patologiske variablene var det kun yngre alder som var assosiert med økt risiko for residiv (HR = 0,96, KI: 0,93-0,99, p = 0,007), mens ingen variabel var assosiert med DFS og OS (tab 4). Prognostiske verdier av infiltrerende immuncellerHøy AF CD117+ mastceller i IM var assosiert med lengre DFS (HR = 0,48, KI: 0,241 – 0,935, p = 0,031) og OS (HR = 0,34, KI: 0,167 – 0,703, p = 0,004) (Figur 8, tabell 5). I tillegg var høy AF CD117+ mastceller i PT-området assosiert med lengre DFS (HR = 0,48, KI: 0,247 – 0,945, p = 0,034) (figur 8, tabell 5). Derimot var ikke AF-ene til iDC- og NK-celler assosiert med noen av utfallene. CD117+ mastceller i indre margin beholdt signifikante assosiasjoner med DFS (HR = 0,46, KI: 0,23-0,91, p = 0,027) og OS (HR = 0,33, KI: 0,16-0,68, p = 0,003) etter justering for TNM-stadium (tabell 6). Når det gjelder mastceller i PT-regionen, var assosiasjonen med DFS også signifikant (HR = 0,47, KI: 0,24-0,93, p = 0,029) (tabell 6). Figur 1: Representativt skjema for metodene. Skjematisk diagram over arbeidsflyten for identifisering av den prognostiske rollen til mastceller, dendrittiske celler og naturlige drepeceller i HCC. Forkortelser: FFPE, formalin-fiksert parafin-innebygd; H&E, hematoksylin og eosin; ROI, regioner av interesse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Figur 2: Skjermbilde av programvarevinduet. Et beskrivende skjermbilde som viser trinnet med å importere bilder til et prosjekt i programvaren. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Figur 3: Skjermbilde av alternativet for arealbrøk. Et skjermbilde fra programvaren som viser de valgte parametrene for å kvantifisere arealfraksjonen av positiv farging. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Figur 4: Skjermbilde av alternativet for pikselklassifisering. Skjermbilde fra programvaren som viser de DAB-positive cellene før og etter pikselklassifisering. Den brunaktige DAB-fargingen har blitt konvertert til rød farge etter pikselklassifisering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Figur 5: Representativ immunfarging av medfødte immunceller hos HCC-pasienter. Representativ immunfarging av (A) CD117+, (B) NKp46+ og (C) CD1a+-celler i TC (400x) og TIM (200x) av HCC. Forkortelser: HCC, hepatocellulært karsinom; TC, tumorsenter; TIM, tumorinvasiv margin, med indre margin (IM) og ytre margin (OM). Den stiplede linjen representerer en grense mellom svulsten og ikke-tumorvev. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Figur 6: Statistikk som beskriver arealfraksjonen av medfødte immunceller hos HCC-pasienter. Statistikk for arealfraksjonen av CD1a+ dendrittiske celler, CD117+ mastceller og NKp46+ NK-celler) i TC-, IM-, OM- og PT-områdene til HCC. Svarte linjer er medianer. Wilcoxon matchet partest med Bonferroni-korreksjon ble brukt for sammenligninger. Forkortelser: HCC, hepatocellulært karsinom; TC, tumorsenter; IM, indre marg; OM, ytre marg; PT, peritumor område. : p <0.001 Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Figur 7: Varmekart over signifikante korrelasjoner mellom arealfraksjoner av mastceller, DC-er og NK-er i forskjellige regioner av interesse. Varmekart over signifikante korrelasjoner mellom arealfraksjoner av CD117+ mastceller, CD1a+ DC-er og NKp46+NK-er i TC, IM, OM og PT (Spearman ρ, p < 0.05). Forkortelser: TC, tumorsenter; IM, indre marg; OM, ytre marg; PT, peritumor område; DC, dendrittiske celler; NK, naturlige drepeceller. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Figur 8: Kaplan-Meier DFS- og OS-kurver for tumorinfiltrerende mastceller hos HCC-pasienter. Kaplan-Meier-analyse av DFS og OS i henhold til lav vs. høy AF tumorinfiltrerende mastceller i indre margin (A, C) og PT (B) av HCC. Forkortelser: HCC, hepatocellulært karsinom; DFS, sykdomsfri overlevelse; IM, indre invasiv; PT, peritumor område. Figuren er tilpasset med tillatelse fra Ali et al.26. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Tabell 1: Klinisk bakgrunn for inkluderte pasienter med hepatocellulært karsinom. Klinisk bakgrunn for registrerte tilfeller av hepatocellulært karsinom. Forkortelser: NAFLD, alkoholfri fettleversykdom. Klikk her for å laste ned denne tabellen. Tabell 2: Estimert sannsynlighet for utfall i Kaplan-Meier-analyse. Den estimerte sannsynligheten for RFP, DFS og OS i Kaplan-Meier-analyse. Forkortelser: RFP, tilbakefallsfri proporsjon; DFS, sykdomsfri overlevelse; OS, total overlevelse. Klikk her for å laste ned denne tabellen. Tabell 3: Korrelasjon mellom arealfraksjonen av tumorinfiltrerende mastceller, dendrittiske celler og naturlige drepeceller i forskjellige ROI. Spearman-korrelasjon (ρ) mellom arealfraksjonen av tumorinfiltrerende mastceller, dendrittiske celler og naturlige drepeceller i forskjellige ROI, p < 0,038. Forkortelser: TC, tumorsenter; IM, indre marg; OM, ytre marg; PT, peritumor område; ROI, regioner av interesse. Klikk her for å laste ned denne tabellen. Tabell 4: Envariabel analyse av kliniske og patologiske variabler assosiert med tid til tilbakefall (TTR), sykdomsfri overlevelse (DFS) og total overlevelse (OS). ” Nei, kvinnelig kjønn eller «A» var referansekategoriene for dikotome variabler. Fet skrift indikerer statistisk signifikans på p < 0,05-nivået. Forkortelser: HR, hazard ratio; CI, konfidensintervall; TTR, tid til gjentakelse; DFS, sykdomsfri overlevelse. Klikk her for å laste ned denne tabellen. Tabell 5: Univariabel analyse av assosiasjonen av arealfraksjon av CD117+ mastceller, CD1a+denderittiske celler og NKp46+naturlige drepeceller med TTR, DFS og OS per individuell region av interesse ved bruk av Cox-regresjonen (67 HCC-pasienter). Arealfraksjonen av immunceller per arealseksjon (mm2) ble omregnet til persentiler og deretter kategorisert i lav (0-25 persentil) vs høy (25-100 persentil). Risikoforhold viser den relative risikoen sammenlignet med 1 for lav AF. Fet skrift indikerer statistisk signifikans på p < 0,05-nivået. Forkortelser: AF, arealfraksjon; DFS, sykdomsfri overlevelse; OS, total overlevelse; HR, fareforhold. Klikk her for å laste ned denne tabellen. Tabell 6: Arealfraksjonen av CD117+ mastceller per individuell ROI assosiert med sykdomsfri overlevelse og total overlevelse (multivariabel analyse). Multivariabel analyse av assosiasjonen av arealfraksjonen av CD117+ mastceller med DFS og OS i IM- og PT-området ved bruk av Cox-regresjon (67 HCC-pasienter). Arealfraksjonen av immunceller per arealsnitt (mm2) ble omregnet til persentiler og deretter kategorisert i lav (0-24 persentil) vs høy (25-100 persentil). Risikoforhold viser den relative risikoen sammenlignet med 1 for lav AF. Fet skrift indikerer statistisk signifikans på p-> 0,05-nivået. Forkortelser: AF, arealfraksjon; DFS, sykdomsfri overlevelse; OS, total overlevelse; HR, fareforhold. Klikk her for å laste ned denne tabellen. Tilleggsfil 1: Skript for å lage avkastning. Klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

Ved hjelp av overvåking av in situ-immunorganisasjonen i TME kan immunonkologifeltet legge til nye kreftprognostiske og prediktive biomarkører. Vår tidligere publiserte artikkel om rollen til adaptive immunceller i TME av HCC viste positive prognostiske assosiasjoner av CD3+ og CD8+ T-celler så vel som CD20+ B-celler i utvalgte ROI til tidspunktet for tilbakefall2. Her ble bildeanalyseprogramvaren QuPath brukt til å vurdere overfloden av CD1a+ iDC-er, CD117+-mastceller og NKp46+ NK-celler i flere distinkte regioner av HCC og evaluerte deres prognostiske betydning. På grunn av de uregelmessige formene til noen medfødte immunceller, kan kvantifiseringen av dem være unøyaktig. Dette er grunnen til at evaluering av arealfraksjonen av immunpositive celler var det optimale alternativet. Blant de tre celletypene var det bare CD117+ mastceller som viste signifikant prognostisk innvirkning: en høyere AF mastceller i IM og PT-området var assosiert med lengre overlevelse.

Mastceller var de mest tallrike i alle ROI, og assosiasjonen av deres AF i peritumorområdet og indre margin med bedre overlevelse gjenspeiler mastcellenes antitumorrolle. Mastceller kan tiltrekkes inn i TME av tumorcellefrigjorte kjemotiltrekkere, som SCF eller CCL1518. Mastceller kan påvirke antitumorrespons ved direkte cytotoksisitet til tumorceller27 eller ved å skille ut pro-inflammatoriske cytokiner som kan hemme tumorvekst18. Økt mastcelletetthet var beskyttende mot tilbakefall av prostatakreft28, magekreft27 og HCC etter levertransplantasjon29. En omfattende undersøkelse bestående av en større kohort på 245 HCC-pasienter fant en positiv sammenheng mellom mer signifikant mastcelleinfiltrasjon i tumorprøver og mer forlenget overlevelse etter tumorreseksjon30. Rohr-Udilova et al. rapporterte lignende resultater av større tettheter av mastceller i omkringliggende HCC-vev; Imidlertid var bare intratumor mastcelletetthet assosiert med en lavere tilbakefallsrate29.

I denne studien utøvde mastceller en antitumoreffekt kun i IM og PT-lever. TME av forskjellige svulster er heterogen når det gjelder den romlige fordelingen av immunceller31. Den prognostiske betydningen av immunceller i TME er også kritisk relatert til deres romlige fordeling 32,33. Ulike tilnærminger for å kommentere tumorinvasiv margin har blitt foreslått, inkludert en hel margin med forskjellige bredder 4,34,35, indre og ytre marginer, igjen med forskjellige bredder36,37, med eller uten PT 2,7. Vi fulgte den reproduserbare, standardiserte metodikken fra International Immunooncology Biomarkers Working Group for å definere den invasive marginen som en 1 mm region sentrert på grensen som skiller de ondartede cellereirene fra vertsvevet og representerer den sentrale svulsten som det gjenværende tumorområdet38. Siden den tidligere studien fremhevet signifikante forskjeller i resultatene av indre og ytre invasiv margin2, har disse regionene (hver 500 μm i bredden) blitt analysert separat. Den romlige immunprofileringen av peritumorområdet har sin distinkte prediktive betydning39,40, og derfor ble PT-området også inkludert.

Analysen av TC, tumormargin og PT-lever ble utført i WSI-er i motsetning til muligheten for å evaluere utvalgte synsfelt i de respektive regionene. Hele lysbildeavbildning er en potensielt rik datakilde41. Siden vi ikke utførte delprøver, ble den “sanne forventningsverdien” oppnådd på en tidseffektiv måte10. I tillegg var dette systemet rimelig fordi bare 1 eller 2 lysbilder per blokk ble analysert, noe som gjorde det mulig for oss å unngå skjevheten ved patchvalg42. Den langsomme arbeidsflyten utfordret oss i den forrige studien da stereologi ble brukt for kvantifisering av immunceller2.

IHC tillater direkte lokalisering av CD1a+ iDC, NKp46+NK og CD117+ mastcelleuttrykk i levervev, kvantifisering av deres fordelinger og derfor underklassifisering av kohorten. IHC-analyse gir denne studien viktige fordeler i forhold til biokjemiske analyser i oppløst vev, noe som kan føre til falske negative resultater når bare noen få biomarkør-positive celler er tilstede43 og ikke gjenspeiler immuncellenes regionale reaksjon på histopatologiske egenskaper44. IHC er også å foretrekke fremfor analyse i H&E-fargede seksjoner. Studier på tykktarmskreft og småcellet lungekreft viste at vurderingen av H&E-fargede seksjoner kunne gi robuste, kvantitative tumorimmune biomarkører 45,46,47; begrensninger for å gjenspeile den faktiske tilstedeværelsen av spesifikke undertyper er imidlertid fortsatt til stede.

Høy kvalitet på vevssnitt og IHC-farging er en forutsetning for en nøyaktig vurdering. Høy bakgrunn, kantartefakter og spesifikk, men uønsket farging (f.eks. farging av endotelceller i leverens sinusformede rom med anti-CD4-antistoffer) kan ødelegge alle resultater. Et CD56-antistoff var førstevalget i den nåværende studien for å oppdage naturlige drepeceller, men ble erstattet med NKp46-antistoffet på grunn av ekspresjon av CD56 i umodne galleganger. Valget av den mest passende markøren når det gjelder spesifisitet, robust fargemønster og stabilitet i FFPE-blokker representerer et annet problem å vurdere. For eksempel ble CD117 valgt i stedet for tryptase fordi tryptaseuttrykk kan være sterkt nedregulert, dessuten er celler som ikke uttrykker CD117 ikke mastceller48.

QuPath gir muligheten til å jevne ut grensene for ROI fra utsiden og fjerne eventuelle artefakter, store kar, nekrotisk vev, uspesifikk farging, bakgrunn og aggregering av erytrocytter som ikke skal være en del av ROI. Operatøren må velge ROI og trykke på “Alt”-tasten mens han kommenterer disse artefaktene. Uspesifikk farging ble eliminert i denne studien som artefakter før kvantifisering, slik at det ikke påvirket resultatene. Ved systematisk lav spesifikk farging eller høy bakgrunn bør protokollen gjennomgås for å unngå mulig skjevhet. Terskelen ble justert for hvert tilfelle med en svak spesifikk positiv farging. Før rutinemessig bruk bør protokollen optimaliseres. Alle analyser bør gjøres på en blind måte, og ideelt sett fortjener nøyaktigheten av terskelen kryssjekking.

QuPath er en brukervennlig, intuitiv, utvidbar, åpen kildekode-løsning for digital patologi og hellysbildeanalyse9, testet tidligere for bildeanalyse i HCC49 og forskjellige kreftformer50,51. Den enkle betjeningen av programvaren for WSI-er og alternativene for merknad av regioner av interesse (f.eks. tumorale eller peritumorale områder) er de viktigste fordelene.

Bruk av eksisterende, modifiserte eller de novo-opprettede skript kan øke hastigheten på analysen betydelig. Skriptet for å lage merknader for avkastning ble brukt, noe som muliggjorde rask og nøyaktig regional segmentering i stedet for manuell avgrensning. Skriptet er ikke fast, og det kan enkelt tilpasses til mindre enn 500 μm marginer for regioner med utilstrekkelige vevsgrenser. Bredden på IM-, OM- eller PT-området kan tilpasses via Automatiser > Vis skriptredigering > å tilpasse linjen 30 Double Expand Margin Microns = 500 μm til den tilgjengelige bredden > Run. ROI kan også legges til eller fjernes. Generelt er arbeidsflytene i programvaren ikke faste, og operatøren står fritt til å utvikle og endre dem.

En mengde tilgjengelige programvareverktøy for patologisk bildeanalyse, inkludert CellProfiler, ImageJ, Fiji, Microscopy Image Browser og andre, er tilgjengelig nå. QuPath utmerker seg imidlertid gjennom et sett med fordeler som åpen kildekode-arkitektur, brukervennlig grensesnitt, algoritmetilpasningsmuligheter og integrering av avanserte maskinlæringsverktøy. Disse funksjonene posisjonerer samlet denne bildeanalyseprogramvaren som et robust valg for nyansert analyse av kreftvev innen digital patologi.

QuPath viste den laveste variasjonen sammenlignet med kommersiell programvare HALO (IndicaLab) og QuantCenter (3DHistech) for påvisning av Ki67-ekspresjon i brystkreft52. Programvaren har også potensial til å bli instruert til å kjøre et skript for alle prosjektbilder på en reproduserbar batch-behandlingsmåte.

QuPath gjorde det mulig for oss å lage kvantitative kontinuerlige data i stedet for ordinære (semi-kvantitative) data. Ordinære data innhentet ved visuell scoring er fulle av problemer på grunn av subjektivitet i tolkning, variasjon mellom observatører og dårlig reproduserbarhet53. Hurtigheten i den nåværende analysen ble forbedret av det faktum at personer uten omfattende histopatologisk bakgrunn og programmeringsekspertise kan utføre automatisk analyse, forutsatt at nøyaktigheten av merknader ble kontrollert av en patolog. En studie på hode- og nakkesvulster demonstrerte QuPaths egnethet for rask og reproduserbar vurdering av den prognostiske verdien av CD57+ tumorinfiltrerende lymfocytter50. Studien viste også en betydelig konkordans mellom menneskelige observatører og QuPath. Høy konkordans mellom manuell observasjon og vurdering ved bruk av QuPath ble også presentert ved munnhulekreft54 og brystkreft55. Den nevnte artikkelen sammenlignet IHC-kvantifiseringen av 5 kliniske brystkreftbiomarkører ved bruk av QuPath og 2 kommersielle programvareprodukter (Definiens Tissue Studio og inForm) med en manuell scoring av en patolog. Gjennom denne studien viste QuPath konsekvent den beste ytelsen så vel som den minste tiden å sette opp og bruke, og viste seg dermed å være et utmerket fremtidig alternativ til visuell overvåking og kommersiell programvare. Selv sammenlignet med ImageJ, den mest kjente åpen kildekode-programvaren for biomedisinsk bildeanalyse, utmerker QuPath seg ved å håndtere store WSI-er56.

Det er et åpent nettforum for QuPath hvor brukere legger inn spørsmål om metoder for digital patologi og presenterer et aktivt og engasjert fellesskap for å støtte utviklingen av verktøy for bildeanalyse (https://forum.image.sc/tag/qupath).

Kohorten som ble brukt i denne studien var unik og ikke representativ for den generelle befolkningen med HCC fordi den kun omfattet pasienter som var kvalifisert for leverreseksjon. Generelt er et mindretall av pasientene med HCC (20%-30%) kvalifisert for leverreseksjon57. Dette kan også være en årsak til at færre pasienter hadde bekreftet skrumplever fordi pasienter med denne etiologien til HCC sannsynligvis hadde høyere Child-Pugh-skår og ikke ble ansett som resektabelle. Kohorten var også ganske liten, og de fleste pasientene hadde tidlige TNM-stadier av sykdommen. Ekstrapolering av resultatene til andre populasjoner bør derfor gjøres med forsiktighet.

I den nåværende studien har overfloden av medfødte immunceller i HCC-mikromiljøet blitt estimert gjennom vurderingen av deres AF, da presis telling av uregelmessig formede immunceller som dendrittiske celler kan vise seg å være vanskelig. På den annen side korrelerer arealfraksjonen av immunceller vanligvis sterkt med deres tettheter58. Immunperoksidasemerking gir data for lokalisering av antigenet, arealfraksjonen eller tettheten av celler som uttrykker det, men intensiteten av farging er ikke-lineært relatert til mengden antigen. IHC bør derfor ikke brukes til å kvantitativt vurdere ekspresjonsnivået til et bestemt protein. Nøyaktigheten til metoden avhenger også av ensartetheten av seksjonstykkelse, bildekvalitet og valgt oppløsning for pikselklassifisering. Eventuelle resultater av bildeanalyse bør valideres og behandles med forsiktighet. Siden en enkelt markør ikke fullt ut kan fange kompleksiteten til immunceller, er det nødvendig med flere IHC-markører og multipleksfarging for å få et pålitelig bilde av immun-TME til HCC. Bruk av kun én IHC-markør for fenotyping av immunceller representerer en tilnærming, og resultatene bør tolkes med forsiktighet.

Ved å bruke QuPath-bildeanalyseprogramvaren for å evaluere IHC-fargede objektglass kunne vi vurdere fordelingen og arealfraksjonen av lokale iDC-er, mastceller og NK-er i tumor og peritumor hos HCC-pasienter og deretter analysere deres forhold til prognose. Overfloden av mastceller i den indre marginen og peritumorleveren til HCC er assosiert med lengre DFS og OS, noe som fremhever antitumoreffektene til de medfødte immuncellene. QuPaths analytiske arbeidsflyt er brukervennlig, rask og enkel å bruke, med nyttige standardinnstillinger og enkel dataeksport. Denne programvaren har blitt godkjent som en lovende plattform for digital bildeanalyse, som kan møte behovet for reproduserbarhet, konsistens og nøyaktighet i digital patologi.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi anerkjenner bidragene fra Mgr. Ondřej Šebesta (Vinicna Microscopy Core Facility, Det naturvitenskapelige fakultet, Charles University) for helglassskanning og prosjektet “e-Infrastruktura CZ” (e-INFRA LM2018140), som ga oss beregningsressursene for denne studien. Teknikerne Jana Dosoudilova og Jan Javurek er anerkjent for sin utmerkede tekniske assistanse. Denne forskningen ble finansiert av EUs Horizon 2020 forsknings- og innovasjonsprogram, tilskudd N°856620, og Helsedepartementet i Tsjekkia, tilskudd AZV NU21-03-00506, og av Cooperatio-programmet (kirurgiske disipliner). Vinicna Microscopy Core Facility er medfinansiert av Czech-BioImaging store RI-prosjektet LM2023050.

Materials

Anti-CD1a Leica Biosystems PA0235 Identifier- immature dendritic cells; RTU, Protocol F, ER2/20 min
Anti-CD117 Leica Biosystems  PA0007 Identifier- mast cells; RTU, Protocol F, ER2/20 min
BOND Plus Microscope Slides Leica Biosystems, Germany S21.2113.A
BOND RXm Leica Biosystems 49.1501 Fully Automated IHC Stainer  
Bond Aspirating Probe Cleaning Kit Leica Biosystems CS9100
Bond Dewax Solution Leica Biosystems AR9222
Bond Polymer Refine Detection Kit Leica Biosystems DS9800
BondTM Epitope Retrieval 2 Leica Biosystems AR9640
BondTM Primary Antibody Diluent Leica Biosystems AR9352
BondTM Wash Solution 10X Concentrate Leica Biosystems AR9590
Computer Specifications: Intel(R) Core(TM) i5-10500 CPU @ 3.10GHz   3.10 GHz Installed RAM: 128 G Intel A 64-bit operating system that has Windows 7. Any computer with Java-based operating system and Excel available
Coverslips Leica Biosystems, Germany 14071135636
CV Mount Leica Biosystems, Germany 14046430011
CV5030 Fully Automated Glass Coverslipper Leica Biosystems 149CVTS5025
Drying Oven UN30 Memmert GmbH  UN30
GraphPad Prism 9.0 GraphPad Software LLC  Version 12
Human NKp46/NCR1 Antibody, Monoclonal Mouse IgG2B Clone # 195314 R&D Systems, Inc., United States MAB1850 Identifier- natural killer cells; Dilution 1:150, Protocol F + BLOK, ER2/20 min
Leica HI1210 – Water Bath Leica Biosystems 14041521466
Protein Block Agilent Dako, United States X0909
QuPath 0.3.2 or higher versions  version (QuPath v.0.3.2) 
RM2235 Rotary Microtome Leica Biosystems 149AUTO00C1
ST5020 Multistainer Slide Stainer Leica Biosystems DEV-ST5010-CV5030
Statistica StatSoft Inc. version 7
Zeiss Axio Scan.Z1 ScienceServices GmbH, Germany 430038-9000-000  Slide scanner 

References

  1. Du, M., Yin, Y. L., Xiao, L., Cai, Y. M., Ji, Y. Evaluating tumor-infiltrating lymphocytes in hepatocellular carcinoma using hematoxylin and eosin-stained tumor sections. World J Clin Cases. 10 (3), 856-869 (2022).
  2. Trailin, A., et al. T-and B-cells in the inner invasive margin of hepatocellular carcinoma after resection associate with favorable prognosis. Cancers (Basel). 14 (3), 604 (2022).
  3. Xiao, N., et al. CD74+ macrophages are associated with favorable prognosis and immune contexture in hepatocellular carcinoma. Cancer Immunol Immunother. 71 (1), 57-69 (2022).
  4. Galon, J., et al. Type, density, and location of immune cells within human colorectal tumors predict clinical outcome. Science. 313 (5795), 1960-1964 (2006).
  5. Roxburgh, C. S. D., Salmond, J. M., Horgan, P. G., Oien, K. A., McMillan, D. C. Tumour inflammatory infiltrate predicts survival following curative resection for node-negative colorectal cancer. Eur J Cancer. 45 (12), 2138-2145 (2009).
  6. Klintrup, K., et al. Inflammation and prognosis in colorectal cancer. Eur J Cancer. 41 (17), 2645-2654 (2005).
  7. Kather, J. N., et al. Topography of cancer-associated immune cells in human solid tumors. Elife. 7, e36967 (2018).
  8. Cho, J. Basic immunohistochemistry for lymphoma diagnosis. Blood Res. 57 (S1), 55-61 (2022).
  9. Bankhead, P., et al. QuPath: Open source software for digital pathology image analysis. Sci Rep. 7 (1), 16878 (2017).
  10. Kolinko, Y., et al. Using virtual microscopy for the development of sampling strategies in quantitative histology and design-based stereology. Anat Histol Embryol. 51 (1), 3-22 (2022).
  11. Rodrigues, A., et al. Computer-assisted tumor grading, validation of PD-L1 scoring, and quantification of CD8-positive immune cell density in urothelial carcinoma, a visual guide for pathologists using QuPath. Surg Exp Pathol. 5, 12 (2022).
  12. Hein, A. L., et al. QuPath digital immunohistochemical analysis of placental tissue. J Pathol Inform. 12, 40 (2021).
  13. Lichterman, J. N., Reddy, S. M. Mast cells: A new frontier for cancer immunotherapy. Cells. 10 (6), 1270 (2021).
  14. Veglia, F., Gabrilovich, D. I. Dendritic cells in cancer: the role revisited. Curr Opin Immunol. 45, 43-51 (2017).
  15. Wu, S. -. Y., Fu, T., Jiang, Y. -. Z., Shao, Z. -. M. Natural killer cells in cancer biology and therapy. Mol Cancer. 19 (1), 120 (2020).
  16. Kai, K., et al. Immunohistochemical analysis of the aggregation of CD1a-positive dendritic cells in resected specimens and its association with surgical outcomes for patients with gallbladder cancer. Transl Oncol. 14 (1), 100923 (2021).
  17. Minesaki, A., Kai, K., Kuratomi, Y., Aishima, S. Infiltration of CD1a-positive dendritic cells in advanced laryngeal cancer correlates with unfavorable outcomes post-laryngectomy. BMC Cancer. 21 (1), 973 (2021).
  18. Komi, D. E. A., Redegeld, F. A. Role of mast cells in shaping the tumor microenvironment. Clin Rev Allergy Immunol. 58 (3), 313-325 (2020).
  19. Maltby, S., Khazaie, K., McNagny, K. M. Mast cells in tumor growth: Angiogenesis, tissue remodelling and immune-modulation. Biochim Biophys Acta. 1796 (1), 19-26 (2009).
  20. Gooch, J. L., Lee, A. V., Yee, D. Interleukin 4 inhibits growth and induces apoptosis in human breast cancer cells. Cancer Res. 58 (18), 4199-4205 (1998).
  21. Brockmeyer, P., et al. High mast cell density indicates a longer overall survival in oral squamous cell carcinoma. Sci Rep. 7 (1), 14677 (2017).
  22. Lee, H. A., et al. Natural killer cell activity is a risk factor for the recurrence risk after curative treatment of hepatocellular carcinoma. BMC Gastroenterol. 21 (1), 258 (2021).
  23. Shimasaki, N., Jain, A., Campana, D. NK cells for cancer immunotherapy. Nat Rev Drug Discov. 19 (3), 200-218 (2020).
  24. Barrow, A. D., Martin, C. J., Colonna, M. The natural cytotoxicity receptors in health and disease. Front Immunol. 10, 909 (2019).
  25. Guan, X., et al. Tumor-associated NK cells facilitate tumor growth via NKp46 in immunocompetent murine hepatocellular carcinoma. Immunol Lett. 258, 8-19 (2023).
  26. Ali, E., et al. Prognostic role of macrophages and mast cells in the microenvironment of hepatocellular carcinoma after resection. BMC Cancer. 24 (1), 142 (2024).
  27. Lin, C., et al. Tryptase expression as a prognostic marker in patients with resected gastric cancer. Br J Surg. 104 (8), 1037-1044 (2017).
  28. Hempel, H. A., et al. Low intratumoral mast cells are associated with a higher risk of prostate cancer recurrence. Prostate. 77 (4), 412-424 (2017).
  29. Rohr-Udilova, N., et al. Morphometric analysis of mast cells in tumor predicts recurrence of hepatocellular carcinoma after liver transplantation. Hepatol Commun. 5 (11), 1939-1952 (2021).
  30. Lin, S. Z., et al. Prediction of recurrence and survival in hepatocellular carcinoma based on two cox models mainly determined by FoxP3+ regulatory T cells. Cancer Prev Res. 6 (6), 594-602 (2013).
  31. Jia, Q., Wang, A., Yuan, Y., Zhu, B., Long, H. Heterogeneity of the tumor immune microenvironment and its clinical relevance. Exp Hematol Oncol. 11 (1), 24 (2022).
  32. Pyo, J. -. S., Son, B. K., Lee, H. Y., Oh, I. H., Chung, K. H. Prognostic implications of intratumoral and peritumoral infiltrating lymphocytes in pancreatic ductal adenocarcinoma. Curr Oncol. 28 (6), 4367-4376 (2021).
  33. Yusa, T., et al. Survival impact of immune cells infiltrating peritumoral area of hepatocellular carcinoma. Cancer Sci. 113 (12), 4048-4058 (2022).
  34. Halama, N., et al. Localization and density of immune cells in the invasive margin of human colorectal cancer liver metastases are prognostic for response to chemotherapy. Cancer Res. 71 (17), 5670-5677 (2011).
  35. Zwing, N., et al. Analysis of spatial organization of suppressive myeloid cells and effector T cells in colorectal cancer-A potential tool for discovering prognostic biomarkers in clinical research. Front Immunol. 11, 550250 (2020).
  36. Soeratram, T. T. D., et al. Prognostic value of T-cell density in the tumor center and outer margins in gastric cancer. Mod Pathol. 36 (9), 100218 (2023).
  37. Gonzàlez-Farré, M., et al. Characterization and spatial distribution of the immune cell infiltrate in triple-negative breast cancer: a novel classification based on plasma cells and CD8+ T cells. Hum Pathol. 139, 91-105 (2023).
  38. Hendry, S., et al. Assessing tumor-infiltrating lymphocytes in solid tumors: A practical review for pathologists and proposal for a standardized method from the International Immunooncology Biomarkers Working Group: Part 1: Assessing the host immune response, TILs in invasive breast carcinoma and ductal carcinoma in situ, metastatic tumor deposits and areas for further research. Adv Anat Pathol. 24 (5), 235-251 (2017).
  39. Brück, O., et al. Spatial immunoprofiling of the intratumoral and peritumoral tissue of renal cell carcinoma patients. Mod Pathol. 34 (12), 2229-2241 (2021).
  40. Knebel, M., et al. Prognostic impact of intra- and peritumoral immune cell subpopulations in head and neck squamous cell carcinomas – comprehensive analysis of the TCGA-HNSC cohort and immunohistochemical validation on 101 patients. Front Immunol. 14, 1172768 (2023).
  41. Lee, S., et al. Interactive classification of whole-slide imaging data for cancer researchers. Cancer Res. 81 (4), 1171-1177 (2021).
  42. Ciga, O., et al. Overcoming the limitations of patch-based learning to detect cancer in whole slide images. Sci Rep. 11 (1), 8894 (2021).
  43. Rizzardi, A. E., et al. Quantitative comparison of immunohistochemical staining measured by digital image analysis versus pathologist visual scoring. Diagn Pathol. 7, 42 (2012).
  44. Masuda, S., Nakanishi, Y. Application of immunohistochemistry in clinical practices as a standardized assay for breast cancer. Acta Histochem Cytochem. 56 (1), 1-8 (2023).
  45. Matsutani, S., et al. Tumor-infiltrating immune cells in H&E-stained sections of colorectal cancer tissue as a reasonable immunological biomarker. Anticancer Res. 38 (12), 6721-6727 (2018).
  46. Väyrynen, J. P., et al. Prognostic significance of immune cell populations identified by machine learning in colorectal cancer using routine hematoxylin and eosin-stained sections. Clin Cancer Res. 26 (16), 4326-4338 (2020).
  47. Zhou, G., et al. Clinical significance of tumor-infiltrating lymphocytes investigated using routine H&E slides in small cell lung cancer. Radiat Oncol. 17 (1), 127 (2022).
  48. Horny, H. -. P., Sotlar, K., Valent, P. Mastocytosis. Immunol Allergy Clin North Am. 34 (2), 315-321 (2014).
  49. Mi, H., Ho, W. J., Yarchoan, M., Popel, A. S. Multi-scale spatial analysis of the tumor microenvironment reveals features of cabozantinib and nivolumab efficacy in hepatocellular carcinoma. Front Immunol. 13, 892250 (2022).
  50. de Ruiter, E. J., et al. Assessing the prognostic value of tumor-infiltrating CD57+ cells in advanced stage head and neck cancer using QuPath digital image analysis. Virchows Archiv. 481 (2), 223-231 (2022).
  51. Fanucci, K. A., et al. Image analysis-based tumor infiltrating lymphocytes measurement predicts breast cancer pathologic complete response in SWOG S0800 neoadjuvant chemotherapy trial. NPJ Breast Cancer. 9 (1), 38 (2023).
  52. Acs, B., et al. Ki67 reproducibility using digital image analysis: an inter-platform and inter-operator study. Lab Invest. 99 (1), 107-117 (2019).
  53. Sobottka, B., et al. Establishing standardized immune phenotyping of metastatic melanoma by digital pathology. Lab Invest. 101 (12), 1561-1570 (2021).
  54. Moratin, J., et al. Digital pathology scoring of immunohistochemical staining reliably identifies prognostic markers and anatomical associations in a large cohort of oral cancers. Front Oncol. 11, 712944 (2021).
  55. Bankhead, P., et al. Integrated tumor identification and automated scoring minimizes pathologist involvement and provides new insights to key biomarkers in breast cancer. Lab Invest. 98 (1), 15-26 (2018).
  56. Humphries, M. P., Maxwell, P., Salto-Tellez, M. QuPath: The global impact of an open source digital pathology system. Comput Struct Biotechnol J. 19, 852-859 (2021).
  57. Koh, J. H., et al. Liver resection versus liver transplantation for hepatocellular carcinoma within Milan criteria: a meta-analysis of 18,421 patients. Hepatobiliary Surg Nutr. 11 (1), 78-93 (2022).
  58. Eriksen, A. C., et al. Computer-assisted stereology and automated image analysis for quantification of tumor infiltrating lymphocytes in colon cancer. Diagn Pathol. 12 (1), 65 (2017).

Play Video

Cite This Article
Ali, E., Červenková, L., Pálek, R., Ambrozkiewicz, F., Pavlov, S., Ye, W., Hošek, P., Daum, O., Liška, V., Hemminki, K., Trailin, A. Mast Cells in the Microenvironment of Hepatocellular Carcinoma Confer Favorable Prognosis: A Retrospective Study using QuPath Image Analysis Software. J. Vis. Exp. (206), e66743, doi:10.3791/66743 (2024).

View Video