Tilstedeværelsen av mastceller i den indre marginen og peritumorområdene av hepatocellulært karsinom etter reseksjon gir en gunstig prognose. Denne studien støtter QuPath-bildeanalyseprogramvare som en lovende plattform som kan møte behovet for reproduserbarhet, konsistens og nøyaktighet i digital patologi.
Innsikten gitt av in-situ deteksjon av immunceller i hepatocellulært karsinom (HCC) kan gi informasjon om pasientutfall. Studier som undersøker uttrykk og lokalisering av immunceller i tumorvev er assosiert med flere utfordringer, inkludert mangel på presis merknad for tumorregioner og tilfeldig utvalg av mikroskopiske synsfelt. QuPath er en åpen kildekode, brukervennlig programvare som kan møte det økende behovet for digital patologi i hellysbildeanalyse (WSI).
Infiltrasjonen av HCC og tilstøtende vev av CD1a+ umodne dendrittiske celler (iDC), CD117+ mastceller og NKp46+ naturlige drepeceller (NKs) celler ble vurdert immunhistokjemisk i representative prøver av 67 pasienter med HCC som gjennomgikk kurativ reseksjon. Arealfraksjonen (AF) av positivt fargede celler ble vurdert automatisk i WSI-er ved bruk av QuPath i tumorsenteret (TC), indre margin (IM), ytre margin (OM) og peritumor (PT) området. Den prognostiske betydningen av immunceller ble evaluert for tid til tilbakefall (TTR), sykdomsfri overlevelse (DFS) og total overlevelse (OS).
AF for mastceller var signifikant større enn AF for NK-er, og AF for iDC-er var signifikant lavere sammenlignet med NK-er i hver region av interesse. Høye AF-er av mastceller i IM- og PT-områdene var assosiert med lengre DFS. I tillegg var høy AF av mastceller i IM assosiert med lengre OS.
Dataassistert analyse ved hjelp av denne programvaren er et egnet verktøy for å innhente prognostisk informasjon for tumorinfiltrerende immunceller (iDC, mastceller og NK) i forskjellige regioner av HCC etter reseksjon. Mastceller viste størst AF i alle interesseområder (ROI). Mastceller i peritumorregionen og IM viste positiv prognostisk signifikans.
Den romlige organiseringen og overfloden av tumorinfiltrerende immunceller har vist seg å påvirke overlevelse i forskjellige kreftformer, hepatocellulært karsinom (HCC) inkluderte 1,2,3,4. Den prognostiske betydningen av tumorinfiltrerende lymfocytter i kreft ble først vist på hematoksylin og eosin (H&E) fargede seksjoner 5,6. Deretter viste en pionerstudie av Galon et al. ved bruk av immunhistokjemi (IHC) viste assosiasjoner av tettheten av CD3 + og CD8 + T-celler i tykktarmskreftvev med prognose4.
IHC er en gullstandard for visualisering, kvantifisering og kartlegging av immunceller i tumorvev for videre assosiasjon med kliniske utfall7. IHC gir flere fordeler, som lave kostnader, utbredt tilgjengelighet og kompatibilitet med formalinfiksert parafininnebygd (FFPE) vev8. Nøyaktig vurdering av IHC-fargede immunceller er imidlertid en stor utfordring. Tradisjonell skåring i utvalgte mikroskopiske synsfelt er tidkrevende og ikke lenger tilstrekkelig for å sikre den høykvalitets, reproduserbare, objektive analysen som er avgjørende for kandidatbiomarkørvalg og pålitelig klinisk korrelasjon9. Hellysbildeskanninger kan vurderes som et helt bilde eller etter delsampling10.
Datastyrt kvantitativ vurdering av overfloden av immunceller i vevsprøver kan sikre praktiske, nøyaktige, pålitelige og klinisk relevante data11. QuPath er en gratis programvare med åpen kildekode som muliggjør digital bildeanalyse av IHC-fargede lysbilder og maksimerer mengden informasjon som gis fra individuelle prøver12.
Siden umodne dendrittiske celler (iDC), naturlige drepeceller (NK) og mastceller er involvert i antitumorimmunresponser og ble vist å korrelere med pasientenes utfall 13,14,15, presenterer vi her en trinn-for-trinn-protokoll for å vurdere deres romlige fordeling i FFPE HCC-vev og utforske deres prognostiske innvirkning. CD1a uttrykkes hovedsakelig på membranen til umodne dendrittiske celler, hvis tetthet har vært assosiert med kliniske utfall i en rekke humane svulster16,17. Mastceller kan spille en protumor- eller antitumorrolle i tumormikromiljøet (TME)18. De kan støtte angiogenese og lette metastase19. Omvendt har det blitt rapportert at mastceller kan formidle tumorcelleapoptose gjennom produksjon av IL-420. Anti-CD117-farging brukes ofte til å visualisere og kvantifisere mastceller i tumorvevet21. NK-celler antas å bidra til overvåking og kontroll av HCC22 ved å drepe kreftceller23. NKp46-ekspresjon av NK er en avgjørende parameter for deres antitumoraktivitet24. Imidlertid korrelerte NKp46+ NK-celler positivt med tumordiameter hos HCC-pasienter25. Til tross for dette er lite kjent om deres sammenheng med pasientoverlevelse.
Vi hadde som mål å kvantitativt vurdere overfloden av CD1a+ iDC, CD117+ mastceller og NKp46+ NK-celler i forskjellige regioner av HCC og fremheve deres prognostiske betydning. Totalt 70 påfølgende pasienter med patologisk bekreftet stadium I-IV HCC, som var kvalifisert for reseksjon i henhold til BCLC-retningslinjene og gjennomgikk kurativ leverreseksjon ved Pilsen universitetssykehus mellom 1997 og 2019, ble inkludert i den nåværende retrospektive studien. Patologirapporter fra pasientene ble gjennomgått. Ingen av pasientene som ble inkludert i denne studien hadde fjernmetastaser og hadde heller ikke fått neoadjuvant behandling som kjemoterapi eller strålebehandling før operasjonen. Totalt 3 pasienter med histologiske prøver av dårlig kvalitet ble ekskludert, og de resterende 67 pasientene ble inkludert i studien (tab 1).
Ved hjelp av overvåking av in situ-immunorganisasjonen i TME kan immunonkologifeltet legge til nye kreftprognostiske og prediktive biomarkører. Vår tidligere publiserte artikkel om rollen til adaptive immunceller i TME av HCC viste positive prognostiske assosiasjoner av CD3+ og CD8+ T-celler så vel som CD20+ B-celler i utvalgte ROI til tidspunktet for tilbakefall2. Her ble bildeanalyseprogramvaren QuPath brukt til å vurdere overfloden av CD1a+ iDC-er, CD117+-mastceller og NKp46+ NK-celler i flere distinkte regioner av HCC og evaluerte deres prognostiske betydning. På grunn av de uregelmessige formene til noen medfødte immunceller, kan kvantifiseringen av dem være unøyaktig. Dette er grunnen til at evaluering av arealfraksjonen av immunpositive celler var det optimale alternativet. Blant de tre celletypene var det bare CD117+ mastceller som viste signifikant prognostisk innvirkning: en høyere AF mastceller i IM og PT-området var assosiert med lengre overlevelse.
Mastceller var de mest tallrike i alle ROI, og assosiasjonen av deres AF i peritumorområdet og indre margin med bedre overlevelse gjenspeiler mastcellenes antitumorrolle. Mastceller kan tiltrekkes inn i TME av tumorcellefrigjorte kjemotiltrekkere, som SCF eller CCL1518. Mastceller kan påvirke antitumorrespons ved direkte cytotoksisitet til tumorceller27 eller ved å skille ut pro-inflammatoriske cytokiner som kan hemme tumorvekst18. Økt mastcelletetthet var beskyttende mot tilbakefall av prostatakreft28, magekreft27 og HCC etter levertransplantasjon29. En omfattende undersøkelse bestående av en større kohort på 245 HCC-pasienter fant en positiv sammenheng mellom mer signifikant mastcelleinfiltrasjon i tumorprøver og mer forlenget overlevelse etter tumorreseksjon30. Rohr-Udilova et al. rapporterte lignende resultater av større tettheter av mastceller i omkringliggende HCC-vev; Imidlertid var bare intratumor mastcelletetthet assosiert med en lavere tilbakefallsrate29.
I denne studien utøvde mastceller en antitumoreffekt kun i IM og PT-lever. TME av forskjellige svulster er heterogen når det gjelder den romlige fordelingen av immunceller31. Den prognostiske betydningen av immunceller i TME er også kritisk relatert til deres romlige fordeling 32,33. Ulike tilnærminger for å kommentere tumorinvasiv margin har blitt foreslått, inkludert en hel margin med forskjellige bredder 4,34,35, indre og ytre marginer, igjen med forskjellige bredder36,37, med eller uten PT 2,7. Vi fulgte den reproduserbare, standardiserte metodikken fra International Immunooncology Biomarkers Working Group for å definere den invasive marginen som en 1 mm region sentrert på grensen som skiller de ondartede cellereirene fra vertsvevet og representerer den sentrale svulsten som det gjenværende tumorområdet38. Siden den tidligere studien fremhevet signifikante forskjeller i resultatene av indre og ytre invasiv margin2, har disse regionene (hver 500 μm i bredden) blitt analysert separat. Den romlige immunprofileringen av peritumorområdet har sin distinkte prediktive betydning39,40, og derfor ble PT-området også inkludert.
Analysen av TC, tumormargin og PT-lever ble utført i WSI-er i motsetning til muligheten for å evaluere utvalgte synsfelt i de respektive regionene. Hele lysbildeavbildning er en potensielt rik datakilde41. Siden vi ikke utførte delprøver, ble den “sanne forventningsverdien” oppnådd på en tidseffektiv måte10. I tillegg var dette systemet rimelig fordi bare 1 eller 2 lysbilder per blokk ble analysert, noe som gjorde det mulig for oss å unngå skjevheten ved patchvalg42. Den langsomme arbeidsflyten utfordret oss i den forrige studien da stereologi ble brukt for kvantifisering av immunceller2.
IHC tillater direkte lokalisering av CD1a+ iDC, NKp46+NK og CD117+ mastcelleuttrykk i levervev, kvantifisering av deres fordelinger og derfor underklassifisering av kohorten. IHC-analyse gir denne studien viktige fordeler i forhold til biokjemiske analyser i oppløst vev, noe som kan føre til falske negative resultater når bare noen få biomarkør-positive celler er tilstede43 og ikke gjenspeiler immuncellenes regionale reaksjon på histopatologiske egenskaper44. IHC er også å foretrekke fremfor analyse i H&E-fargede seksjoner. Studier på tykktarmskreft og småcellet lungekreft viste at vurderingen av H&E-fargede seksjoner kunne gi robuste, kvantitative tumorimmune biomarkører 45,46,47; begrensninger for å gjenspeile den faktiske tilstedeværelsen av spesifikke undertyper er imidlertid fortsatt til stede.
Høy kvalitet på vevssnitt og IHC-farging er en forutsetning for en nøyaktig vurdering. Høy bakgrunn, kantartefakter og spesifikk, men uønsket farging (f.eks. farging av endotelceller i leverens sinusformede rom med anti-CD4-antistoffer) kan ødelegge alle resultater. Et CD56-antistoff var førstevalget i den nåværende studien for å oppdage naturlige drepeceller, men ble erstattet med NKp46-antistoffet på grunn av ekspresjon av CD56 i umodne galleganger. Valget av den mest passende markøren når det gjelder spesifisitet, robust fargemønster og stabilitet i FFPE-blokker representerer et annet problem å vurdere. For eksempel ble CD117 valgt i stedet for tryptase fordi tryptaseuttrykk kan være sterkt nedregulert, dessuten er celler som ikke uttrykker CD117 ikke mastceller48.
QuPath gir muligheten til å jevne ut grensene for ROI fra utsiden og fjerne eventuelle artefakter, store kar, nekrotisk vev, uspesifikk farging, bakgrunn og aggregering av erytrocytter som ikke skal være en del av ROI. Operatøren må velge ROI og trykke på “Alt”-tasten mens han kommenterer disse artefaktene. Uspesifikk farging ble eliminert i denne studien som artefakter før kvantifisering, slik at det ikke påvirket resultatene. Ved systematisk lav spesifikk farging eller høy bakgrunn bør protokollen gjennomgås for å unngå mulig skjevhet. Terskelen ble justert for hvert tilfelle med en svak spesifikk positiv farging. Før rutinemessig bruk bør protokollen optimaliseres. Alle analyser bør gjøres på en blind måte, og ideelt sett fortjener nøyaktigheten av terskelen kryssjekking.
QuPath er en brukervennlig, intuitiv, utvidbar, åpen kildekode-løsning for digital patologi og hellysbildeanalyse9, testet tidligere for bildeanalyse i HCC49 og forskjellige kreftformer50,51. Den enkle betjeningen av programvaren for WSI-er og alternativene for merknad av regioner av interesse (f.eks. tumorale eller peritumorale områder) er de viktigste fordelene.
Bruk av eksisterende, modifiserte eller de novo-opprettede skript kan øke hastigheten på analysen betydelig. Skriptet for å lage merknader for avkastning ble brukt, noe som muliggjorde rask og nøyaktig regional segmentering i stedet for manuell avgrensning. Skriptet er ikke fast, og det kan enkelt tilpasses til mindre enn 500 μm marginer for regioner med utilstrekkelige vevsgrenser. Bredden på IM-, OM- eller PT-området kan tilpasses via Automatiser > Vis skriptredigering > å tilpasse linjen 30 Double Expand Margin Microns = 500 μm til den tilgjengelige bredden > Run. ROI kan også legges til eller fjernes. Generelt er arbeidsflytene i programvaren ikke faste, og operatøren står fritt til å utvikle og endre dem.
En mengde tilgjengelige programvareverktøy for patologisk bildeanalyse, inkludert CellProfiler, ImageJ, Fiji, Microscopy Image Browser og andre, er tilgjengelig nå. QuPath utmerker seg imidlertid gjennom et sett med fordeler som åpen kildekode-arkitektur, brukervennlig grensesnitt, algoritmetilpasningsmuligheter og integrering av avanserte maskinlæringsverktøy. Disse funksjonene posisjonerer samlet denne bildeanalyseprogramvaren som et robust valg for nyansert analyse av kreftvev innen digital patologi.
QuPath viste den laveste variasjonen sammenlignet med kommersiell programvare HALO (IndicaLab) og QuantCenter (3DHistech) for påvisning av Ki67-ekspresjon i brystkreft52. Programvaren har også potensial til å bli instruert til å kjøre et skript for alle prosjektbilder på en reproduserbar batch-behandlingsmåte.
QuPath gjorde det mulig for oss å lage kvantitative kontinuerlige data i stedet for ordinære (semi-kvantitative) data. Ordinære data innhentet ved visuell scoring er fulle av problemer på grunn av subjektivitet i tolkning, variasjon mellom observatører og dårlig reproduserbarhet53. Hurtigheten i den nåværende analysen ble forbedret av det faktum at personer uten omfattende histopatologisk bakgrunn og programmeringsekspertise kan utføre automatisk analyse, forutsatt at nøyaktigheten av merknader ble kontrollert av en patolog. En studie på hode- og nakkesvulster demonstrerte QuPaths egnethet for rask og reproduserbar vurdering av den prognostiske verdien av CD57+ tumorinfiltrerende lymfocytter50. Studien viste også en betydelig konkordans mellom menneskelige observatører og QuPath. Høy konkordans mellom manuell observasjon og vurdering ved bruk av QuPath ble også presentert ved munnhulekreft54 og brystkreft55. Den nevnte artikkelen sammenlignet IHC-kvantifiseringen av 5 kliniske brystkreftbiomarkører ved bruk av QuPath og 2 kommersielle programvareprodukter (Definiens Tissue Studio og inForm) med en manuell scoring av en patolog. Gjennom denne studien viste QuPath konsekvent den beste ytelsen så vel som den minste tiden å sette opp og bruke, og viste seg dermed å være et utmerket fremtidig alternativ til visuell overvåking og kommersiell programvare. Selv sammenlignet med ImageJ, den mest kjente åpen kildekode-programvaren for biomedisinsk bildeanalyse, utmerker QuPath seg ved å håndtere store WSI-er56.
Det er et åpent nettforum for QuPath hvor brukere legger inn spørsmål om metoder for digital patologi og presenterer et aktivt og engasjert fellesskap for å støtte utviklingen av verktøy for bildeanalyse (https://forum.image.sc/tag/qupath).
Kohorten som ble brukt i denne studien var unik og ikke representativ for den generelle befolkningen med HCC fordi den kun omfattet pasienter som var kvalifisert for leverreseksjon. Generelt er et mindretall av pasientene med HCC (20%-30%) kvalifisert for leverreseksjon57. Dette kan også være en årsak til at færre pasienter hadde bekreftet skrumplever fordi pasienter med denne etiologien til HCC sannsynligvis hadde høyere Child-Pugh-skår og ikke ble ansett som resektabelle. Kohorten var også ganske liten, og de fleste pasientene hadde tidlige TNM-stadier av sykdommen. Ekstrapolering av resultatene til andre populasjoner bør derfor gjøres med forsiktighet.
I den nåværende studien har overfloden av medfødte immunceller i HCC-mikromiljøet blitt estimert gjennom vurderingen av deres AF, da presis telling av uregelmessig formede immunceller som dendrittiske celler kan vise seg å være vanskelig. På den annen side korrelerer arealfraksjonen av immunceller vanligvis sterkt med deres tettheter58. Immunperoksidasemerking gir data for lokalisering av antigenet, arealfraksjonen eller tettheten av celler som uttrykker det, men intensiteten av farging er ikke-lineært relatert til mengden antigen. IHC bør derfor ikke brukes til å kvantitativt vurdere ekspresjonsnivået til et bestemt protein. Nøyaktigheten til metoden avhenger også av ensartetheten av seksjonstykkelse, bildekvalitet og valgt oppløsning for pikselklassifisering. Eventuelle resultater av bildeanalyse bør valideres og behandles med forsiktighet. Siden en enkelt markør ikke fullt ut kan fange kompleksiteten til immunceller, er det nødvendig med flere IHC-markører og multipleksfarging for å få et pålitelig bilde av immun-TME til HCC. Bruk av kun én IHC-markør for fenotyping av immunceller representerer en tilnærming, og resultatene bør tolkes med forsiktighet.
Ved å bruke QuPath-bildeanalyseprogramvaren for å evaluere IHC-fargede objektglass kunne vi vurdere fordelingen og arealfraksjonen av lokale iDC-er, mastceller og NK-er i tumor og peritumor hos HCC-pasienter og deretter analysere deres forhold til prognose. Overfloden av mastceller i den indre marginen og peritumorleveren til HCC er assosiert med lengre DFS og OS, noe som fremhever antitumoreffektene til de medfødte immuncellene. QuPaths analytiske arbeidsflyt er brukervennlig, rask og enkel å bruke, med nyttige standardinnstillinger og enkel dataeksport. Denne programvaren har blitt godkjent som en lovende plattform for digital bildeanalyse, som kan møte behovet for reproduserbarhet, konsistens og nøyaktighet i digital patologi.
The authors have nothing to disclose.
Vi anerkjenner bidragene fra Mgr. Ondřej Šebesta (Vinicna Microscopy Core Facility, Det naturvitenskapelige fakultet, Charles University) for helglassskanning og prosjektet “e-Infrastruktura CZ” (e-INFRA LM2018140), som ga oss beregningsressursene for denne studien. Teknikerne Jana Dosoudilova og Jan Javurek er anerkjent for sin utmerkede tekniske assistanse. Denne forskningen ble finansiert av EUs Horizon 2020 forsknings- og innovasjonsprogram, tilskudd N°856620, og Helsedepartementet i Tsjekkia, tilskudd AZV NU21-03-00506, og av Cooperatio-programmet (kirurgiske disipliner). Vinicna Microscopy Core Facility er medfinansiert av Czech-BioImaging store RI-prosjektet LM2023050.
Anti-CD1a | Leica Biosystems | PA0235 | Identifier- immature dendritic cells; RTU, Protocol F, ER2/20 min |
Anti-CD117 | Leica Biosystems | PA0007 | Identifier- mast cells; RTU, Protocol F, ER2/20 min |
BOND Plus Microscope Slides | Leica Biosystems, Germany | S21.2113.A | |
BOND RXm | Leica Biosystems | 49.1501 | Fully Automated IHC Stainer |
Bond Aspirating Probe Cleaning Kit | Leica Biosystems | CS9100 | |
Bond Dewax Solution | Leica Biosystems | AR9222 | |
Bond Polymer Refine Detection Kit | Leica Biosystems | DS9800 | |
BondTM Epitope Retrieval 2 | Leica Biosystems | AR9640 | |
BondTM Primary Antibody Diluent | Leica Biosystems | AR9352 | |
BondTM Wash Solution 10X Concentrate | Leica Biosystems | AR9590 | |
Computer Specifications: Intel(R) Core(TM) i5-10500 CPU @ 3.10GHz 3.10 GHz Installed RAM: 128 G | Intel | A 64-bit operating system that has Windows 7. Any computer with Java-based operating system and Excel available | |
Coverslips | Leica Biosystems, Germany | 14071135636 | |
CV Mount | Leica Biosystems, Germany | 14046430011 | |
CV5030 Fully Automated Glass Coverslipper | Leica Biosystems | 149CVTS5025 | |
Drying Oven UN30 | Memmert GmbH | UN30 | |
GraphPad Prism 9.0 | GraphPad Software LLC | Version 12 | |
Human NKp46/NCR1 Antibody, Monoclonal Mouse IgG2B Clone # 195314 | R&D Systems, Inc., United States | MAB1850 | Identifier- natural killer cells; Dilution 1:150, Protocol F + BLOK, ER2/20 min |
Leica HI1210 – Water Bath | Leica Biosystems | 14041521466 | |
Protein Block | Agilent Dako, United States | X0909 | |
QuPath 0.3.2 or higher versions | version (QuPath v.0.3.2) | ||
RM2235 Rotary Microtome | Leica Biosystems | 149AUTO00C1 | |
ST5020 Multistainer Slide Stainer | Leica Biosystems | DEV-ST5010-CV5030 | |
Statistica | StatSoft Inc. | version 7 | |
Zeiss Axio Scan.Z1 | ScienceServices GmbH, Germany | 430038-9000-000 | Slide scanner |