Биология межмышечной жировой ткани (IMAT) в значительной степени не изучена из-за ограниченной доступности тканей человека. Здесь мы представляем подробный протокол выделения ядер и подготовки библиотеки замороженного человеческого IMAT для секвенирования одноядерных РНК для определения клеточного состава этого уникального жирового депо.
Межмышечная жировая ткань (IMAT) – это относительно малоизученное жировое депо, расположенное между мышечными волокнами. Содержание IMAT увеличивается с возрастом и ИМТ и связано с метаболическими и мышечными дегенеративными заболеваниями; однако понимание биологических свойств IMAT и его взаимодействия с окружающими мышечными волокнами сильно отсутствует. В последние годы секвенирование одиночных клеток и ядер РНК позволило нам получить атласы нескольких тканей человека, специфичные для разных типов клеток. Тем не менее, клеточный состав IMAT человека остается в значительной степени неизученным из-за неотъемлемых проблем, связанных с его доступностью из биопсии у человека. В дополнение к ограниченному количеству собранной ткани, обработка IMAT человека затруднена из-за его близости к скелетной мышечной ткани и фасциям. Насыщенная липидами природа адипоцитов делает его несовместимым с выделением одиночных клеток. Следовательно, секвенирование РНК с одним ядром является оптимальным для получения многомерной транскриптомики с разрешением одной клетки и обеспечивает потенциал для раскрытия биологии этого депо, включая точный клеточный состав IMAT. Здесь мы представляем подробный протокол выделения ядер и подготовки библиотеки замороженного человеческого IMAT для секвенирования одноядерных РНК. Этот протокол позволяет профилировать тысячи ядер с использованием капельного подхода, тем самым обеспечивая возможность обнаружения редких и малораспространенных типов клеток.
Межмышечная жировая ткань (IMAT) представляет собой эктопическое жировое депо, расположенное между мышечными волокнами и вокруг них1. Как подробно описано в недавнем обзоре Goodpaster et al., IMAT может быть обнаружен с помощью компьютерной томографии (КТ) высокого разрешения и магнитно-резонансной томографии (МРТ) (рис. 1A, B) и обнаруживается вокруг и внутри мышечных волокон повсему телу. Количество IMAT сильно варьируется у разных людей и зависит от ИМТ, возраста, пола, расы и сидячего образа жизни 2,3,4. Кроме того, отложение IMAT обычно наблюдается при патологических состояниях, связанных с мышечной дегенерацией5, и многочисленные исследования документально подтвердили увеличение массы IMAT у людей с ожирением, диабетом 2 типа, метаболическим синдромом и резистентностью к инсулину 6,7,8,9. Тем не менее, клеточные и биологические свойства IMAT только начинают раскрываться. Ограниченная доступность и различия в местах расположения и содержимом IMAT по всему телу затруднили сбор образцов из этого уникального жирового депо2. Кроме того, образцы легко «загрязняются» скелетными мышцами (СМ) после сбора, что затрудняет расшифровку разделения между биологическим вкладом различных тканей (рис. 1C). С этой целью секвенирование одноядерных РНК (snRNA-seq), которое привлекло значительное внимание в течение последнего десятилетия, служит идеальной методологией, позволяющей разделить паттерны экспрессии генов, полученных от IMAT и SM, с разрешением для одной клетки. Кроме того, выделение ядер особенно полезно для жировой ткани из-за больших липидных адипоцитов, которые невозможно диссоциировать на одноклеточную суспензию без нарушения целостности клеток. Наконец, эта технология обладает потенциалом для открытия новых маркеров IMAT-специфичных адипоцитов и раскрытия состава и присутствия различных популяций клеток-предшественников, а также изучения вариаций клеточного состава в патологических и нормальных условиях.
Рисунок 1: Изображения IMAT. Репрезентативное магнитно-резонансное (МРТ) изображение IMAT от (А) худощавой женщины среднего возраста и (Б) мужчины среднего возраста с ожирением. Красный: подкожная жировая клетчатка, желтый: межмышечная жировая ткань, зеленый: скелетные мышцы, синий: костные. Изображение любезно предоставлено Хизер Корннелл, Институт трансляционных исследований AdventHealth. (C) Свежий образец ткани с IMAT (обведен пунктирной черной линией). Изображение любезно предоставлено Меган Хопф из Института трансляционных исследований AdventHealth и Брайаном Бергманом из Университета Колорадо. Этот рисунок был изменен с разрешения Goodpaster et al.1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
В области животноводства был опубликован ряд исследований, в которых изучалось мраморность мяса (в частности, IMAT) у свиней, кур и крупного рогатого скота с использованием одноклеточного (sc) и snRNA-seq10. Эти исследования выявили несколько субпопуляций адипоцитов и маркеров потенциальных клеток-предшественников IMAT 11,12,13; однако неизвестно, транслируются ли эти клеточные композиции в IMAT человека. Насколько нам известно, только в одном исследовании изучалась клеточная гетерогенность мышц человека с жировой инфильтрацией, полученная от пациентов мужского пола с остеоартрозом тазобедренного сустава, с использованием snRNA-seq14. Исследователи сообщили о небольшой популяции адипоцитов и нескольких субпопуляциях фиброадипогенных предшественников (FAP) в большой популяции миоядер14. В нашем исследовании впервые разработан метод прямого опроса IMAT, вручную препарированного из мышц человека, на предмет клеточного состава с помощью snRNA-seq.
Важно отметить, что протоколы для snRNA-seq должны быть адаптированы для конкретной изучаемой ткани, поскольку количество доступной ткани и физические свойства конкретной ткани будут диктовать оптимальные этапы обработки. Выход ткани для IMAT обычно невелик, часто не превышает 50 мг, даже при проведении биопсии под ультразвуковым контролем. Следовательно, правильная обработка этой дефицитной ткани имеет важное значение. Мы считаем, что этот протокол послужит ценным ресурсом для исследователей, изучающих IMAT человека.
Работа с IMAT сопряжена с несколькими проблемами. Помимо ограниченной доступности, выход материала образца часто бывает очень скудным, а «загрязнения» скелетных мышц практически невозможно избежать. Для получения образца наилучшего качества следует проникнуть в мышечную фасцию при вв?…
The authors have nothing to disclose.
Авторы выражают признательность Брайану Бергману, доктору философии из Университета Колорадо, за предоставление изображения биопсии IMAT на рисунке 1C из исследования MoTrIMAT (R01AG077956). Мы благодарны Study of Muscle, Mobility and Aging (Study of Muscle, Mobility and Aging) предоставила выборку IMAT, данные которой представлены в разделе репрезентативных результатов. Национальный институт по проблемам старения (NIA) финансировал исследование мышц, подвижности и старения (SOMMA; R01AG059416) и его вспомогательные исследования SOMMA AT (R01AG066474) и SOMMA Knee OA (R01AG070647). Поддержка исследовательской инфраструктуры частично финансировалась Центрами независимости пожилых американцев им. Клода Д. Пеппера в Университете Питтсбурга (P30AG024827) и Университете Уэйк Форест (P30AG021332) и Институтами клинических и трансляционных наук, финансируемыми Национальным центром развития трансляционной науки в Университете Уэйк Форест (UL1 0TR001420).
0.2 µm corning syringe filters | Millipore Sigma | CLS431229 | |
1.7 mL DNA LoBind tubes | Eppendorf | 22431021 | low-bind tubes |
10% Tween 20 | Bio-Rad | 1662404 | |
100x protease inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 78437 | |
10X Magnetic Separator | 10X Genomics | 230003 | |
10X Vortex Adapter | 10X Genomics | 330002 | |
15 mL canonical tubes | Sarstedt | 6,25,54,502 | |
2100 Bioanalyzer | Agilent | G2939BA | |
50 mL conical tubes | Sarstedt | 6,25,47,254 | |
CellRanger | Genomics | N/A | |
Chromium iX accesory kit | 10X Genomics | PN1000323 | |
Chromium iX Controller | 10X Genomics | PN1000326 | |
Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit | 10X Genomics | PN1000127 | |
Chromium Next GEM Single Cell 3' Kit v 3.1 | 10X Genomics | PN1000269 | |
Chromium Next GEM Single Cell 3' Gel Bead Kit v3.1 | 10X Genomics | PN1000129 | |
Chromium Next GEM Single Cell GEM Kit v3.1 | 10X Genomics | PN1000130 | |
Countess 3 Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX2000 | Automated cell counter |
Countess cell counting chamber slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
DoubletFinder | R | N/A | |
DPBS (no calcium, no magnesium) | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
DTT | Thermo Fisher Scientific | R0861 | |
Dual Index Kit TT Set A, 96 rxns | 10X Genomics | PN1000215 | |
Dynabeads MyOne SILANE | 10X Genomics | PN2000048 | |
Falcon 100 µm Cell strainer | Corning Life Science | 352360 | |
Falcon 40 µm Cell strainer | Corning Life Science | 352340 | |
Glycerin (glycerol), 50% (v/v) Aqueous Solution | Ricca Chemical Company | 3290-32 | |
KCL | Thermo Fisher Scientific | AM9640G | |
Library Construction Kit v3.1 | 10X Genomics | PN1000196 | |
MACS SmartStrainers (30µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
Mastercycler Nexus Gradient Thermal cycler | Eppendorf | 6331000017 | |
MgCl2 | Ambion | AM9530G | |
Mortar and pestel | Health care logistics | 14075 | |
NucBlue Live Ready Probes Reagent | Thermo Fisher Scientific | R37605 | |
Nuclease Free Water (not DEPC treated) | Thermo Fisher Scientific | AM9930 | |
Probumin Bovine Serum Albumin Fatty Acid Free, Powder | Sigma-Aldrich | 820024 | |
Qiagen Buffer EB | Qiagen | 19086 | |
Ribolock RNAse inhibitor | Thermo Fisher Scientific | EO0382 | |
Seurat | R | N/A | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
SUPERasin 20 U/µL | Thermo Fisher Scientific | AM2695 | |
ThermoMixer C | Eppendorf | 5382000015 | |
Tissue homogenizer | Glass-Col | 099C K54 | |
Tris buffer pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | AM9855G | |
Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific | AC327372500 | |
UltraPure 0.5M EDTA pH 8.0 | Gibco | 15575020 |