Summary

Выделение ядер из межмышечной жировой ткани человека и последующее секвенирование одноядерных РНК

Published: May 03, 2024
doi:

Summary

Биология межмышечной жировой ткани (IMAT) в значительной степени не изучена из-за ограниченной доступности тканей человека. Здесь мы представляем подробный протокол выделения ядер и подготовки библиотеки замороженного человеческого IMAT для секвенирования одноядерных РНК для определения клеточного состава этого уникального жирового депо.

Abstract

Межмышечная жировая ткань (IMAT) – это относительно малоизученное жировое депо, расположенное между мышечными волокнами. Содержание IMAT увеличивается с возрастом и ИМТ и связано с метаболическими и мышечными дегенеративными заболеваниями; однако понимание биологических свойств IMAT и его взаимодействия с окружающими мышечными волокнами сильно отсутствует. В последние годы секвенирование одиночных клеток и ядер РНК позволило нам получить атласы нескольких тканей человека, специфичные для разных типов клеток. Тем не менее, клеточный состав IMAT человека остается в значительной степени неизученным из-за неотъемлемых проблем, связанных с его доступностью из биопсии у человека. В дополнение к ограниченному количеству собранной ткани, обработка IMAT человека затруднена из-за его близости к скелетной мышечной ткани и фасциям. Насыщенная липидами природа адипоцитов делает его несовместимым с выделением одиночных клеток. Следовательно, секвенирование РНК с одним ядром является оптимальным для получения многомерной транскриптомики с разрешением одной клетки и обеспечивает потенциал для раскрытия биологии этого депо, включая точный клеточный состав IMAT. Здесь мы представляем подробный протокол выделения ядер и подготовки библиотеки замороженного человеческого IMAT для секвенирования одноядерных РНК. Этот протокол позволяет профилировать тысячи ядер с использованием капельного подхода, тем самым обеспечивая возможность обнаружения редких и малораспространенных типов клеток.

Introduction

Межмышечная жировая ткань (IMAT) представляет собой эктопическое жировое депо, расположенное между мышечными волокнами и вокруг них1. Как подробно описано в недавнем обзоре Goodpaster et al., IMAT может быть обнаружен с помощью компьютерной томографии (КТ) высокого разрешения и магнитно-резонансной томографии (МРТ) (рис. 1A, B) и обнаруживается вокруг и внутри мышечных волокон повсему телу. Количество IMAT сильно варьируется у разных людей и зависит от ИМТ, возраста, пола, расы и сидячего образа жизни 2,3,4. Кроме того, отложение IMAT обычно наблюдается при патологических состояниях, связанных с мышечной дегенерацией5, и многочисленные исследования документально подтвердили увеличение массы IMAT у людей с ожирением, диабетом 2 типа, метаболическим синдромом и резистентностью к инсулину 6,7,8,9. Тем не менее, клеточные и биологические свойства IMAT только начинают раскрываться. Ограниченная доступность и различия в местах расположения и содержимом IMAT по всему телу затруднили сбор образцов из этого уникального жирового депо2. Кроме того, образцы легко «загрязняются» скелетными мышцами (СМ) после сбора, что затрудняет расшифровку разделения между биологическим вкладом различных тканей (рис. 1C). С этой целью секвенирование одноядерных РНК (snRNA-seq), которое привлекло значительное внимание в течение последнего десятилетия, служит идеальной методологией, позволяющей разделить паттерны экспрессии генов, полученных от IMAT и SM, с разрешением для одной клетки. Кроме того, выделение ядер особенно полезно для жировой ткани из-за больших липидных адипоцитов, которые невозможно диссоциировать на одноклеточную суспензию без нарушения целостности клеток. Наконец, эта технология обладает потенциалом для открытия новых маркеров IMAT-специфичных адипоцитов и раскрытия состава и присутствия различных популяций клеток-предшественников, а также изучения вариаций клеточного состава в патологических и нормальных условиях.

Figure 1
Рисунок 1: Изображения IMAT. Репрезентативное магнитно-резонансное (МРТ) изображение IMAT от (А) худощавой женщины среднего возраста и (Б) мужчины среднего возраста с ожирением. Красный: подкожная жировая клетчатка, желтый: межмышечная жировая ткань, зеленый: скелетные мышцы, синий: костные. Изображение любезно предоставлено Хизер Корннелл, Институт трансляционных исследований AdventHealth. (C) Свежий образец ткани с IMAT (обведен пунктирной черной линией). Изображение любезно предоставлено Меган Хопф из Института трансляционных исследований AdventHealth и Брайаном Бергманом из Университета Колорадо. Этот рисунок был изменен с разрешения Goodpaster et al.1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

В области животноводства был опубликован ряд исследований, в которых изучалось мраморность мяса (в частности, IMAT) у свиней, кур и крупного рогатого скота с использованием одноклеточного (sc) и snRNA-seq10. Эти исследования выявили несколько субпопуляций адипоцитов и маркеров потенциальных клеток-предшественников IMAT 11,12,13; однако неизвестно, транслируются ли эти клеточные композиции в IMAT человека. Насколько нам известно, только в одном исследовании изучалась клеточная гетерогенность мышц человека с жировой инфильтрацией, полученная от пациентов мужского пола с остеоартрозом тазобедренного сустава, с использованием snRNA-seq14. Исследователи сообщили о небольшой популяции адипоцитов и нескольких субпопуляциях фиброадипогенных предшественников (FAP) в большой популяции миоядер14. В нашем исследовании впервые разработан метод прямого опроса IMAT, вручную препарированного из мышц человека, на предмет клеточного состава с помощью snRNA-seq.

Важно отметить, что протоколы для snRNA-seq должны быть адаптированы для конкретной изучаемой ткани, поскольку количество доступной ткани и физические свойства конкретной ткани будут диктовать оптимальные этапы обработки. Выход ткани для IMAT обычно невелик, часто не превышает 50 мг, даже при проведении биопсии под ультразвуковым контролем. Следовательно, правильная обработка этой дефицитной ткани имеет важное значение. Мы считаем, что этот протокол послужит ценным ресурсом для исследователей, изучающих IMAT человека.

Protocol

Образец, использованный для этого протокола, был частью Исследования мышц, подвижности и старения (SOMMA)15, которое было одобрено Институциональным наблюдательным советом Западной группы IRB-Copernicus (WCG) и проводилось в соответствии с Хельсинкской декларацией. Участники п?…

Representative Results

Этот рабочий процесс был разработан для управления обработкой замороженных образцов IMAT человека для получения профилей экспрессии генов с разрешением одного ядра, что позволяет идентифицировать тип клеток. Здесь представлена одна репрезентативная выборка IMAT от участника исследован…

Discussion

Работа с IMAT сопряжена с несколькими проблемами. Помимо ограниченной доступности, выход материала образца часто бывает очень скудным, а «загрязнения» скелетных мышц практически невозможно избежать. Для получения образца наилучшего качества следует проникнуть в мышечную фасцию при вв?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы выражают признательность Брайану Бергману, доктору философии из Университета Колорадо, за предоставление изображения биопсии IMAT на рисунке 1C из исследования MoTrIMAT (R01AG077956). Мы благодарны Study of Muscle, Mobility and Aging (Study of Muscle, Mobility and Aging) предоставила выборку IMAT, данные которой представлены в разделе репрезентативных результатов. Национальный институт по проблемам старения (NIA) финансировал исследование мышц, подвижности и старения (SOMMA; R01AG059416) и его вспомогательные исследования SOMMA AT (R01AG066474) и SOMMA Knee OA (R01AG070647). Поддержка исследовательской инфраструктуры частично финансировалась Центрами независимости пожилых американцев им. Клода Д. Пеппера в Университете Питтсбурга (P30AG024827) и Университете Уэйк Форест (P30AG021332) и Институтами клинических и трансляционных наук, финансируемыми Национальным центром развития трансляционной науки в Университете Уэйк Форест (UL1 0TR001420).

Materials

0.2 µm corning syringe filters  Millipore Sigma CLS431229
1.7 mL DNA LoBind tubes Eppendorf 22431021 low-bind tubes
10% Tween 20 Bio-Rad 1662404
100x protease inhibitor Thermo Fisher Scientific 78437
10X Magnetic Separator 10X Genomics 230003
10X Vortex Adapter 10X Genomics 330002
15 mL canonical tubes Sarstedt 6,25,54,502
2100 Bioanalyzer  Agilent G2939BA
50 mL conical tubes Sarstedt 6,25,47,254
CellRanger Genomics N/A
Chromium iX accesory kit 10X Genomics PN1000323
Chromium iX Controller 10X Genomics PN1000326
Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit  10X Genomics PN1000127
Chromium Next GEM Single Cell 3'  Kit v 3.1 10X Genomics PN1000269
Chromium Next GEM Single Cell 3' Gel Bead Kit v3.1  10X Genomics PN1000129
Chromium Next GEM Single Cell GEM Kit v3.1 10X Genomics PN1000130
Countess 3 Automated Cell Counter Thermo Fisher Scientific AMQAX2000 Automated cell counter
Countess cell counting chamber slides Thermo Fisher Scientific C10228
DoubletFinder N/A
DPBS (no calcium, no magnesium) Thermo Fisher Scientific 14190144
DTT Thermo Fisher Scientific R0861
Dual Index Kit TT Set A, 96 rxns 10X Genomics PN1000215
Dynabeads MyOne SILANE  10X Genomics PN2000048
Falcon 100 µm Cell strainer Corning Life Science 352360
Falcon 40 µm Cell strainer Corning Life Science 352340
Glycerin (glycerol), 50% (v/v) Aqueous Solution Ricca Chemical Company 3290-32
KCL Thermo Fisher Scientific AM9640G
Library Construction Kit v3.1 10X Genomics PN1000196
MACS SmartStrainers (30µm) Miltenyi Biotec 130-098-458
Mastercycler Nexus Gradient Thermal cycler Eppendorf 6331000017
MgCl2 Ambion AM9530G
Mortar and pestel Health care logistics  14075
NucBlue Live Ready Probes Reagent Thermo Fisher Scientific R37605
Nuclease Free Water (not DEPC treated) Thermo Fisher Scientific AM9930
Probumin Bovine Serum Albumin Fatty Acid Free, Powder Sigma-Aldrich 820024
Qiagen Buffer EB Qiagen 19086
Ribolock RNAse inhibitor Thermo Fisher Scientific EO0382
Seurat N/A
Sucrose Sigma-Aldrich S0389
SUPERasin 20 U/µL Thermo Fisher Scientific AM2695
ThermoMixer C Eppendorf  5382000015
Tissue homogenizer Glass-Col 099C K54
Tris buffer pH 8.0 Thermo Fisher Scientific AM9855G
Triton X-100 Thermo Fisher Scientific AC327372500
UltraPure 0.5M EDTA pH 8.0 Gibco 15575020

References

  1. Goodpaster, B. H., Bergman, B. C., Brennan, A. M., Sparks, L. M. Intermuscular adipose tissue in metabolic disease. Nat Rev Endocrinol. 19 (5), 285-298 (2023).
  2. Sparks, L. M., Goodpaster, B. H., Bergman, B. C. The metabolic significance of intermuscular adipose tissue: Is IMAT a friend or a foe to metabolic health. Diabetes. 70 (11), 2457-2467 (2021).
  3. Gallagher, D., et al. Adipose tissue in muscle: A novel depot similar in size to visceral adipose tissue. Am J Clin Nutr. 81 (4), 903-910 (2005).
  4. Manini, T. M., et al. Reduced physical activity increases intermuscular adipose tissue in healthy young adults. Am J Clin Nutr. 85 (2), 377-384 (2007).
  5. Addison, O., Marcus, R. L., LaStayo, P. C., Ryan, A. S. Intermuscular fat: A review of the consequences and causes. Int J Endocrinol. 2014, 309570 (2014).
  6. Goodpaster, B. H., et al. Obesity, regional body fat distribution, and the metabolic syndrome in older men and women. Arch Intern Med. 165 (7), 777-783 (2005).
  7. Goodpaster, B. H., Thaete, F. L., Kelley, D. E. Thigh adipose tissue distribution is associated with insulin resistance in obesity and in type 2 diabetes mellitus. Am J Clin Nutr. 71 (4), 885-892 (2000).
  8. Goodpaster, B. H., et al. Association between regional adipose tissue distribution and both type 2 diabetes and impaired glucose tolerance in elderly men. Diabetes Care. 26 (2), 372-379 (2003).
  9. Sachs, S., et al. Intermuscular adipose tissue directly modulates skeletal muscle insulin sensitivity in humans. Am J Physiol Endocrinol Metab. 316 (5), E866-E879 (2019).
  10. Ford, H., Liu, Q., Fu, X., Strieder-Barboza, C. White adipose tissue heterogeneity in the single-cell era: From mice and humans to cattle. Biology (Basel). 12 (10), 1289 (2023).
  11. Wang, L., et al. Single-nucleus and bulk RNA sequencing reveal cellular and transcriptional mechanisms underlying lipid dynamics in high marbled pork. NPJ Sci Food. 7 (1), 23 (2023).
  12. Li, J., et al. Identification of diverse cell populations in skeletal muscles and biomarkers for intramuscular fat of chicken by single-cell RNA sequencing. BMC Genomics. 21 (1), 752 (2020).
  13. Lyu, P., Qi, Y., Tu, Z. J., Jiang, H. Single-cell RNA sequencing reveals heterogeneity of cultured bovine satellite cells. Front Genet. 12, 742077 (2021).
  14. Fitzgerald, G., et al. MME+ fibro-adipogenic progenitors are the dominant adipogenic population during fatty infiltration in human skeletal muscle. Commun Biol. 6 (1), 111 (2023).
  15. Cummings, S. R., et al. The study of muscle, mobility and aging (SOMMA): A unique cohort study about the cellular biology of aging and age-related loss of mobility. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 78 (11), 2083-2093 (2023).
  16. Whytock, K. L., et al. Isolation of nuclei from frozen human subcutaneous adipose tissue for full-length single-nuclei transcriptional profiling. STAR Protoc. 4 (1), 102054 (2023).
  17. 10x Genomics. Chromium Single Cell 3′ Reagent Kits User Guide (v3.1 Chemistry Dual Index), Document Number CG000315 RevE Available from: https://cdn.10xgenomics.com/image/upload/v1668017706/support-documents/CG000315_ChromiumNextGEMSingleCell3-_GeneExpression_v3.1_DualIndex__RevE.pdf (2022)
  18. Heumos, L., et al. Best practices for single-cell analysis across modalities. Nat Rev Genet. 24 (1), 550-572 (2023).
  19. Hao, Y., et al. Dictionary learning for integrative, multimodal and scalable single-cell analysis. Nat Biotechnol. 42 (2), 293-304 (2023).
  20. McGinnis, C. S., Murrow, L. M., Gartner, Z. J. DoubletFinder: Doublet detection in single-cell RNA sequencing data using artificial nearest neighbors. Cell Syst. 8 (4), 329-337 (2019).
  21. Yang, S., et al. Decontamination of ambient RNA in single-cell RNA-seq with DecontX. Genome Biol. 21 (2), 57 (2020).
  22. Common considerations for quality control filters for single cell RNA-seq data. 10X Genomics Available from: https://www.10xgenomics.com/analysis-guides/common-considerations-for-quality-control-filters-for-single-cell-rna-seq-data (2022)
  23. Luecken, M. D., Theis, F. J. Current best practices in single-cell RNA-seq analysis: a tutorial. Mol Syst Biol. 15 (6), e8746 (2019).
  24. Emont, M. P., et al. A single-cell atlas of human and mouse white adipose tissue. Nature. 603 (7903), 926-933 (2022).
  25. Hildreth, A. D., et al. Single-cell sequencing of human white adipose tissue identifies new cell states in health and obesity. Nat Immunol. 22 (5), 639-653 (2021).
  26. Whytock, K. L., et al. Single cell full-length transcriptome of human subcutaneous adipose tissue reveals unique and heterogeneous cell populations. iScience. 25 (8), 104772 (2022).
  27. Probst, V., et al. Benchmarking full-length transcript single cell mRNA sequencing protocols. BMC Genomics. 23 (1), 860 (2022).
  28. CG000148 Rev A Technical Note – Resolving cell types as a function of read depth and cell number. Technical note. 10X Genomics Available from: https://assets.ctfassets.net/an68im79xiti/6gDArDPBTOg4IIkYEO2Sis/803be2286bb (2018)
  29. Gupta, A., et al. Characterization of transcript enrichment and detection bias in single-nucleus RNA-seq for mapping of distinct human adipocyte lineages. Genome Res. 32 (2), 242-257 (2022).
  30. Bakken, T. E., et al. Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types. PLoS One. 13 (12), e0209648 (2018).
  31. Wu, H., Kirita, Y., Donnelly, E. L., Humphreys, B. D. Advantages of single-nucleus over single-cell RNA sequencing of adult kidney: Rare cell types and novel cell states revealed in fibrosis. J Am Soc Nephrol. 30 (1), 23-32 (2019).
  32. Kim, N., Kang, H., Jo, A., Yoo, S. -. A., Lee, H. -. O. Perspectives on single-nucleus RNA sequencing in different cell types and tissues. J Pathol Transl Med. 57 (1), 52-59 (2023).
  33. Avila Cobos, F., Alquicira-Hernandez, J., Powell, J. E., Mestdagh, P., De Preter, K. Benchmarking of cell type deconvolution pipelines for transcriptomics data. Nat Commun. 11 (1), 5650 (2020).

Play Video

Cite This Article
Elingaard-Larsen, L. O., Whytock, K. L., Divoux, A., Hopf, M., Kershaw, E. E., Justice, J. N., Goodpaster, B. H., Lane, N. E., Sparks, L. M. Isolation of Nuclei from Human Intermuscular Adipose Tissue and Downstream Single-Nuclei RNA Sequencing. J. Vis. Exp. (207), e66784, doi:10.3791/66784 (2024).

View Video