عزل وحفظ خلايا الدم البشرية أحادية النواة المحيطية عالية القابلية للحياة من الدم الكامل: دليل للمبتدئين
Summary
يقدم هذا البروتوكول دليلا يمكن الوصول إليه لجمع وتخزين وإذابة خلايا الدم أحادية النواة المحيطية المناسبة لتحليلات المصب وسير العمل مثل قياس التدفق الخلوي وتسلسل الحمض النووي الريبي. كما يتم عرض مجموعات معطف البلازما وبافي.
Abstract
تستخدم خلايا الدم أحادية النواة المحيطية (PBMCs) بشكل شائع في الأبحاث الطبية الحيوية على الجهاز المناعي واستجابته للأمراض ومسببات الأمراض. يصف هذا البروتوكول التفصيلي المعدات والإمدادات والخطوات الخاصة بعزل وحجز التبريد وإذابة PBMCs عالية الجودة والقابلة للحياة للغاية من خلايا الدم الكاملة المناسبة لتطبيقات المصب مثل قياس التدفق الخلوي وتسلسل الحمض النووي الريبي. كما يتم وصف بروتوكولات لمعالجة البلازما ومعطف بافي من الدم كله بالتوازي وبالتزامن مع PBMCs. هذا البروتوكول سهل المتابعة خطوة بخطوة ، والذي يستخدم الطرد المركزي المتدرج الكثافة لعزل PBMCs ، مصحوب بقائمة مرجعية بالإمدادات والمعدات وخطوات التحضير. هذا البروتوكول مناسب للأفراد الذين لديهم أي خبرة سابقة في التقنيات المختبرية ويمكن تنفيذه في المختبرات السريرية أو البحثية. نتجت صلاحية الخلايا عالية الجودة وتسلسل الحمض النووي الريبي عن PBMCs التي جمعها المشغلون الذين ليس لديهم خبرة مختبرية سابقة باستخدام هذا البروتوكول.
Introduction
يوضح هذا البروتوكول طريقة وسير عمل يمكن الوصول إليهما لعزل خلايا الدم أحادية النواة المحيطية (PBMCs) من الدم الكامل. يستهدف هذا البروتوكول بشكل خاص فنيي الأبحاث المبتدئين والطلاب وموظفي المختبرات السريرية بهدف تسهيل جمع وحفظ PBMCs بالتبريد دون الحصول على تدريب مسبق على التقنيات المختبرية.
يستخدم هذا البروتوكول الطرد المركزي لفصل مكونات الدم الكامل حسب الكثافة. يتكون الدم الكامل من أربعة مكونات رئيسية مدرجة بترتيب تناقص الكثافة: خلايا الدم الحمراء / كريات الدم الحمراء (~ 45٪ من الحجم) ، وخلايا الدم البيضاء (<1٪ من الحجم) ، والصفائح الدموية (<1٪ من الحجم) ، والبلازما (~ 55٪ من الحجم) 1،2،3،4،5،6. يمكن تقسيم خلايا الدم البيضاء إلى فئتين بناء على خصائص نفاياتها: مستديرة أو متعددة النواة6. تعرف PBMCs بأنها خلايا الدم البيضاء ذات النوى المستديرة وتتكون من أنواع الخلايا التالية: الخلايا الليمفاوية (الخلايا التائية ، الخلايا البائية ، الخلايا القاتلة الطبيعية) ، الخلايا المتغصنة ، والوحيدات6. تشمل خلايا الدم البيضاء متعددة النوى الخلايا المحببة ، والتي تتكون من أنواع الخلايا التالية: العدلات ، الخلايا القاعدية ، والحمضات6. خلايا الدم البيضاء متعددة النوى أكثر كثافة من PBMCs6. يتم تفصيل كثافات كل مكون من مكونات الدم الكامل في الجدول 1.
في هذا البروتوكول ، يتم جمع الدم الكامل في أنابيب الطرد المركزي المتدرجة الكثافة. تحتوي هذه الأنابيب على وسط تدرج كثافة معبأ مسبقا كثافته 1.077 g/mL. بعد الطرد المركزي ، يتم فصل الخلايا الأكثر كثافة ، بما في ذلك خلايا الدم البيضاء متعددة النوى وكريات الدم الحمراء ، عن PBMCs والصفائح الدموية بواسطة وسط تدرج الكثافة (الشكل 1A)6,7. ثم يتم جمع PBMC وجزء الصفائح الدموية وغسلها وطردها مركزيا لإزالة الصفائح الدموية. يتم جمع PBMCs المنقى الناتج وتخزينه عند -80 درجة مئوية أو في النيتروجين السائل. يمكن إذابة PBMCs المحفوظة بالتبريد بشكل قابل للتطبيق واستخدامها مباشرة في تحليلات المصب أو معالجتها بشكل إضافي لعزل أنواع معينة من الخلايا المكونة.
تم تحسين هذا البروتوكول لتسلسل الحمض النووي الريبي عالي الجودة من PBMCs عالية القابلية للتطبيق. في هذه المقالة ، تم عزل PBMCs وحفظها بالتبريد من المرضى في عيادة خارجية. بعد ذلك ، تم عزل الخلايا الوحيدة من PBMCs بواسطة FACS وتحليلها عبر تسلسل الحمض النووي الريبي. ومع ذلك ، يمكن تكييف البروتوكول على نطاق واسع مع الاحتياجات التجريبية الأخرى مثل زراعة الخلايا ، وتحرير الجينات ، والدراسات الوظيفية خارج الجسم الحي ، وتحليلات الخلية الواحدة ، والتنميط الظاهري عن طريق قياس التدفق الخلوي أو قياس الخلايا حسب وقت الرحلة ، وعزل الحمض النووي / الحمض النووي الريبي أو البروتينات ، والشرائح للكيمياء المناعية ، من بين أمور أخرى8،9،10،11،12،13،14،15 ، 16,17,18.
بالإضافة إلى جمع PBMC من أنابيب الطرد المركزي المتدرجة الكثافة ، يستعرض هذا البروتوكول كيفية جمع البلازما ومعطف بافي عبر الطرد المركزي باستخدام أنبوب EDTA. بعد الطرد المركزي ، يتم فصل الدم الكامل إلى بلازما وكريات الدم الحمراء وطبقة واجهة رقيقة تسمى معطف بافي يحتوي على كريات الدم البيضاء (الشكل 1 ب)6. يستخدم معطف بافي بشكل شائع لاستخراج الحمض النووي والتحليلات الجينومية اللاحقة19,20. تحتوي طبقة البلازما على مكونات خالية من الخلايا في الدم الكامل ويمكن استخدامها لفحوصات العلامات الحيوية21,22.
Protocol
Representative Results
Discussion
تم تنفيذ هذا البروتوكول لجمع PBMC والحفظ بالتبريد بنجاح من قبل الأفراد الذين لديهم أو بدون تدريب مختبري بحثي سابق. في تطبيقنا ، أدى تسلسل FACS و RNA للوحيدات القابلة للحياة للغاية والمنقاة من PBMCs المخزنة إلى تسلسلات عالية الجودة.
تتمثل إحدى نقاط القوة الرئيسية ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر المرضى الذين تطوعوا بموافقتهم ووقتهم وتبرعهم بعينات الدم. كما نعرب عن تقديرنا للدكتور باتريك موريارتي وجولي آن داتون ومارك ماكليلين في المركز الطبي بجامعة كانساس لتعاونهم ولتنفيذ هذا البروتوكول في موقع بعيد. تلقت CY دعما بحثيا من منحة المعاهد الوطنية للصحة 1K08HL150271.
Materials
| 1000 µL Tips | Gilson | F174501 | Approximately 3 tips needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection |
| 15 mL tube | Biopioneeer | CNT-15 | To hold Solutions 2/3 2 needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection |
| 2 mL Cryovials | Globe Scientific | 3012 | Approximately 40 cryovials needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection |
| 20 µL Tips | Gilson | F174201 | For use in cell counting; volume needed is dependent on method of cell counting used. 1 tip is needed per 1 mL of unpooled frozen PBMCs to be defrosted |
| 50 mL Conical Tube | CEM Corporation | 50-187-7683 | 2 needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection 3 needed per 1 mL of unpooled frozen PBMCs to be defrosted |
| CD14 Antibody | Biolegend | 325621 | |
| CD16 Antibody | Biolegend | 360723 | |
| CD19 Antibody | Biolegend | 363007 | |
| CD3 Antibody | Biolegend | 300405 | |
| CD56 Antibody | Biolegend | 318303 | |
| CD66b Antibody | Biolegend | 305103 | |
| Cell Strainer | Biopioneeer | DGN258367 | 1 needed per 1 mL of unpooled frozen PBMCs to be defrosted |
| CPT Mononuclear Cell Preparation Tube | BD Biosciences | 362753 | 6 tubes needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection |
| Cryo Freezer Box | Southern Labware | SB2CC-81 | Holds 81 tubes 1 needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection |
| Cryotube Rack | Fisherbrand | 05-669-45 | Holds up to 50 cryovials |
| DMSO | Invitrogen | 15575020 | Approximately 2.5 mL needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection |
| DNase/RNase-Free Distilled Water | Invitrogen | 10977015 | Approximately 2 mL needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection Approximately 9 mL needed per 1 mL of frozen PBMCs to be defrosted |
| EDTA Tubes | BD Biosciences | 366643 | 1 tube needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection |
| Flavopiridol | Sigma-Aldrich | F3055-5MG | |
| HLA-DR Antibody | Biolegend | 307609 | |
| Human Serum Albumin | GeminiBio | 800-120 | Approximately 25 mL needed per patient or treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection |
| Human Trustain FcX | Biolegend | 422301 | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | W292912-1KG-K | For use in Mr. Frosty |
| Label Printer | Phomemo | M110-WH | |
| Live-Dead Stain | Biolegend | 423105 | |
| Mr. Frosty | Thermo Scientific | 5100-0001 | Holds up to 18 tubes. 2 Mr. Frostys needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection |
| Multidispense Pipette | Brandtech | 705110 | |
| Multidispense Pipette Tips | Brandtech | 705744 | Approximately 3 tips needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection |
| P1000 Pipette | Gilson | F144059M | |
| P20 Pipette | Gilson | F144056M | For use in cell counting; volume needed is dependent on method of cell counting used. |
| Printer Labels | Phomemo | PM-M110-3020 | Approximately 45 labels needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection Approximately 5 labels needed per 1 mL of unpooled frozen PBMCs to be defrosted |
| RNase-Free EDTA (0.5 M) | Invitrogen | AM9260G | Approximately 40 µL needed per 1 mL of frozen PBMCs to be defrosted |
| RNase-Free PBS (10X) | Invitrogen | AM9625 | Approximately 1 mL needed per 1 mL of frozen PBMCs to be defrosted |
| RNasin | Promega | N2111 | |
| RPMI | Corning | 10-040-CV | Approximately 80 mL needed per patient or treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection |
| Transfer Pipettes | Fisherbrand | 13-711-7M | Approximately 5 needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection |
| Tube Holder | Endicott-Seymour | 14-781-15 | Holds up to 80 CPT/EDTA Tubes |
References
- Mathew, J., Sankar, P., Varacallo, M. . Physiology, Blood Plasma. , (2018).
- Van Oost, B., Van Hien-Hagg, I. H., Timmermans, A. P., Sixma, J. J. The effect of thrombin on the density distribution of blood platelets: Detection of activated platelets in the circulation. Blood. 62 (2), 433-438 (1983).
- Hassani, M., et al. On the origin of low-density neutrophils. Journal of Leukocyte Biology. 107 (5), 809-818 (2020).
- Norouzi, N., Bhakta, H. C., Grover, W. H. Sorting cells by their density. PLOS ONE. 12 (7), e0180520 (2017).
- Manzone, T. A., Dam, H. Q., Soltis, D., Sagar, V. V. Blood volume analysis: A new technique and new clinical interest reinvigorate a classic study. JNMT. 35 (2), 55-63 (2007).
- Kleiveland, C. R. . The impact of food bioactives on health: In vitro and ex vivo models. , 161-167 (2015).
- Rosado, M., et al. Advances in biomarker detection: Alternative approaches for blood-based biomarker detection. Adv Clin Chem. 92, 141-199 (2019).
- Riedhammer, C., Halbritter, D., Weissert, R. . Multiple sclerosis: Methods and Protocols. 1304, 53-61 (2016).
- Panda, S. K., Ravindran, B. In vitro Culture of Human PBMCs. Bio Protoc. 3 (3), e322 (2013).
- He, D., et al. Whole blood vs PBMC: Compartmental differences in gene expression profiling exemplified in asthma. Allergy Asthma Clinic Immol. 15, 67 (2019).
- Pelák, O., et al. Lymphocyte enrichment using CD81-targeted immunoaffinity matrix. Cytometry Part A. 91 (1), 62-72 (2017).
- Higdon, L. E., et al. Impact on in-depth immunophenotyping of delay to peripheral blood processing. Clin Exp Immunol. 217 (2), 119-132 (2024).
- Liu, Z., et al. Photoactivatable aptamer-CRISPR nanodevice enables precise profiling of interferon-gamma release in humanized mice. ACS Nano. 18 (4), 3826-3838 (2024).
- Ren, Z., Li, C., Wang, J., Sui, J., Ma, Y. Single-cell transcriptome revealed dysregulated RNA-binding protein expression patterns and functions in human ankylosing spondylitis. Front Med. 11, 1369341 (2024).
- Honardoost, M. A., et al. Systematic immune cell dysregulation and molecular subtypes revealed by single-cell-RNA-seq of subjects with type 1 diabetes. Genome Med. 16, 45 (2024).
- Amini, A., Esmaeili, F., Golpich, M. Possible role of lncRNAs in amelioration of Parkinson’s disease symptoms by transplantation of dopaminergic cells. NPJ Parkinsons Dis. 10, 56 (2024).
- Luo, Y., et al. Sars-Cov-2 spike induces intestinal barrier dysfunction through the interaction between CEACAM5 and Galectin-9. Front Immunol. 15, e1303356 (2024).
- Zhang, X., Wu, G., Ma, X., Cheng, L. Immune cell alterations and PI3k-PKB pathway suppression in patients with allergic rhinitis undergoing sublingual immunotherapy. Adv Ther. 41 (2), 777-791 (2024).
- Rucci, C., et al. Exploring mitochondrial DNA copy number in circulating cell-free DNA and extracellular vesicles across cardiovascular health status: A prospective case-control pilot study. FASEB J. 38 (10), e23672 (2024).
- Ghamrawi, R., et al. Buffy coat DNA Methylation Profile is Representative of Methylation Patterns in White Blood Cell Types in Normal Pregnancy. Front Bioeng Biotechnol. 9, e782843 (2022).
- Johansson, C., et al. Plasma biomarker profiles in autosomal dominant Alzheimer’s disease. Brain. 146 (3), 1132-1140 (2023).
- Bonaterra-Pastra, A., et al. Comparison of plasma lipoprotein composition and function in cerebral amyloid angiopathy and Alzheimer’s disease. Biomedicines. 9 (1), 72 (2021).
- Green, M. R., Sambrook, J. Estimation of cell number by hemocytometry counting. Cold Spring Harb Protoc. (11), prot097980 (2019).
- Cobo, I., et al. Monosodium urate crystals regulate a unique JNK-dependent macrophage metabolic and inflammatory response. Cell Rep. 38 (10), e110489 (2022).
- Corkum, C. P., et al. Immune cell subsets and their gene expression profiles from human PBMC isolated by Vacutainer Cell Preparation Tube (CPT™) and standard density gradient. BMC Immunology. 16, 48 (2015).
- Golke, T., et al. Delays during PBMC isolation have a moderate effect on yield but severely compromise cell viability. Clin Chem Lab Med. 60 (5), 701-706 (2022).
- Fuss, I. J., Kanof, M. E., Smith, P. D., Zola, H. Isolation of whole mononuclear cells from peripheral blood and cord blood. Curr Protoc Immunol. 85 (1), 7.1.1-7.1.8 (2009).
- Faass, L., et al. Contribution of heptose metabolites and the cag pathogenicity island to the activation of monocytes/macrophages by Helicobacter Pylori. Front Immunol. 12, e632154 (2021).
- Preobrazhensky, S. N., Bahler, D. W. Immunomagnetic bead separation of mononuclear cells from contaminating granulocytes in cryopreserved blood samples. Cryobiology. 59 (3), 366-368 (2009).
- Schenz, J., Obermaier, M., Uhle, S., Weigand, M. A., Uhle, F. Low-density granulocyte contamination from peripheral blood mononuclear cells of patients with sepsis and how to remove it – A technical report. Front Immunol. 12, e684119 (2021).
- Tessema, B., Riemer, J., Sack, U., König, B. Cellular stress assay in peripheral blood mononuclear cells: factors influencing its results. Int J Mol Sci. 23 (21), 13118 (2022).
- Chen, X., Thibeault, S. 2013 35th Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society (EMBC). IEEE. , 6228-6231 (2013).
- Chen, X., Thibeault, S. abc. , 6228-6231 (2013).
- Yang, J., et al. The effects of storage temperature on PBMC gene expression. BMC Immunol. 17, 6 (2016).
- Ticha, O., Moos, L., Bekeredjian-Ding, I. Effects of long-term cryopreservation of PBMC on recovery of B cell subpopulations. J Immunol Methods. 495, e113081 (2021).
- Chao, S. -. H., Price, D. H. Flavopiridol inactivates P-TEFb and blocks most RNA polymerase II transcription in vivo. J of Biol Chem. 276 (34), 31793-31799 (2001).
- Banfi, G., Salvagno, G. L., Lippi, G. The role of ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) as in vitro anticoagulant for diagnostic purposes. Clin Chem Lab Med. 45 (5), 565-576 (2007).
- Mohri, M., Rezapoor, H. Effects of heparin, citrate, and EDTA on plasma biochemistry of sheep: Comparison with serum. Res Vet Sci. 86 (1), 111-114 (2009).
- Edwards, K., et al. Heparin-mediated PCR interference in SARS-CoV-2 assays and subsequent reversal with heparinase I. J Virol Methods. 327, 114944 (2024).
- Yokota, M., Tatsumi, N., Nathalang, O., Yamada, T., Tsuda, I. Effects of heparin on polymerase chain reaction for blood white cells. J Clin Lab Anal. 13 (3), 133-140 (1999).
- Yuan, Y., et al. Efficient long-term cryopreservation of pluripotent stem cells at -80 °C. Sci Rep. 6 (1), 34476 (2016).
