Isolatie en cryopreservatie van zeer levensvatbare mononucleaire cellen van menselijk perifeer bloed uit volbloed: een gids voor beginners
Summary
Dit protocol biedt een toegankelijke gids voor het verzamelen, bewaren en ontdooien van perifere mononucleaire bloedcellen die geschikt zijn voor stroomafwaartse analyses en workflows zoals flowcytometrie en RNA-sequencing. Plasma- en buffy-jascollecties worden ook gedemonstreerd.
Abstract
Perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC’s) worden vaak gebruikt in biomedisch onderzoek naar het immuunsysteem en zijn reactie op ziekten en ziekteverwekkers. Dit gedetailleerde protocol beschrijft de apparatuur, benodigdheden en stappen voor het isoleren, cryoconserveren en ontdooien van hoogwaardige en zeer levensvatbare PBMC’s uit volbloedcellen die geschikt zijn voor stroomafwaartse toepassingen zoals flowcytometrie en RNA-sequencing. Protocollen voor het verwerken van plasma en buffy coat uit het volbloed parallel en gelijktijdig met PBMC’s worden ook beschreven. Dit eenvoudig te volgen stap-voor-stap protocol, dat gebruik maakt van dichtheidsgradiëntcentrifugatie om PBMC’s te isoleren, gaat vergezeld van een checklist met benodigdheden, apparatuur en voorbereidingsstappen. Dit protocol is geschikt voor personen met enige eerdere ervaring met laboratoriumtechnieken en kan worden geïmplementeerd in klinische of onderzoekslaboratoria. Hoogwaardige cellevensvatbaarheid en RNA-sequencing waren het resultaat van PBMC’s die werden verzameld door operators zonder eerdere laboratoriumervaring met het gebruik van dit protocol.
Introduction
Dit protocol demonstreert een toegankelijke methode en workflow voor de isolatie van perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC’s) uit volbloed. Dit protocol is speciaal gericht op beginnende onderzoekstechnici, studenten en klinisch laboratoriumpersoneel met als doel het verzamelen en cryopreservatie van PBMC’s te vergemakkelijken zonder voorafgaande training in laboratoriumtechnieken te veronderstellen.
Dit protocol maakt gebruik van centrifugatie om de componenten van volbloed te scheiden op dichtheid. Volbloed bestaat uit vier hoofdcomponenten die worden vermeld in volgorde van afnemende dichtheid: rode bloedcellen/erytrocyten (~45% van het volume), witte bloedcellen (<1% van het volume), bloedplaatjes (<1% van het volume) en plasma (~55% van het volume)1,2,3,4,5,6. Witte bloedcellen kunnen worden onderverdeeld in twee categorieën op basis van hun kernkenmerken: rond of meerkernig6. PBMC’s worden gedefinieerd als witte bloedcellen met ronde kernen en bestaan uit de volgende celtypen: lymfocyten (T-cellen, B-cellen, NK-cellen), dendritische cellen en monocyten6. Meerkernige witte bloedcellen omvatten granulocyten, die bestaan uit de volgende celtypen: neutrofielen, basofielen en eosinofielen6. Meerkernige witte bloedcellen zijn dichter dan PBMC’s6. De dichtheden van elk bestanddeel van volbloed worden gedetailleerd beschreven in tabel 1.
In dit protocol wordt volbloed verzameld in centrifugatiebuisjes met dichtheidsgradiënt. Deze buisjes bevatten een voorverpakt dichtheidsgradiëntmedium met een dichtheid van 1,077 g/ml. Na centrifugatie worden dichtere cellen, waaronder meerkernige witte bloedcellen en erytrocyten, gescheiden van PBMC’s en bloedplaatjes door het dichtheidsgradiëntmedium (figuur 1A)6,7. De PBMC- en bloedplaatjesfractie wordt vervolgens verzameld, gewassen en gecentrifugeerd om bloedplaatjes te verwijderen. De resulterende gezuiverde PBMC’s worden verzameld en opgeslagen bij -80 °C of in vloeibare stikstof. Gecryopreserveerde PBMC’s kunnen levensvatbaar worden ontdooid en direct worden gebruikt in stroomafwaartse analyses of aanvullend worden verwerkt om specifieke componentceltypen te isoleren.
Dit protocol is geoptimaliseerd voor hoogwaardige RNA-sequencing van zeer levensvatbare PBMC’s. In dit artikel werden PBMC’s geïsoleerd en gecryopreserveerd van patiënten in een polikliniek. Vervolgens werden monocyten geïsoleerd uit PBMC’s door FACS en geanalyseerd via RNA-sequencing. Het protocol kan echter op grote schaal worden aangepast aan andere experimentele behoeften, zoals celcultuur, genbewerking, ex-vivo functionele studies, analyses van één cel, fenotypering door flowcytometrie of cytometrie door vluchttijd, isolatie van DNA/RNA of eiwitten, objectglaasjes voor immunohistochemie, onder andere 8,9,10,11,12,13,14,15, 16,17,18.
Naast PBMC-verzameling van centrifugatiebuizen met dichtheidsgradiënt, wordt in dit protocol beoordeeld hoe plasma en buffy coat kunnen worden verzameld via centrifugatie met behulp van een EDTA-buis. Na centrifugatie wordt volbloed gescheiden in plasma, erytrocyten en een dunne interfacelaag die buffy coat wordt genoemd en leukocyten bevat (Figuur 1B)6. De buffy coat wordt vaak gebruikt voor DNA-extractie en daaropvolgende genomische analyses19,20. De plasmalaag bevat de celvrije componenten van volbloed en kan worden gebruikt voor biomarkertests21,22.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol voor PBMC-verzameling en cryopreservatie is met succes geïmplementeerd door personen met en zonder voorafgaande opleiding in onderzoekslaboratoria. In onze toepassing resulteerde FACS- en RNA-sequencing van zeer levensvatbare monocyten gezuiverd uit opgeslagen PBMC’s in hoogwaardige sequenties.
Een grote kracht van dit protocol is de toegankelijkheid. De techniek die in het protocol wordt gepresenteerd, maakt gebruik van buizen die zijn voorverpa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We willen de patiënten bedanken die vrijwillig hun toestemming, tijd en donatie van bloedmonsters hebben gegeven. We erkennen ook Dr. Patrick Moriarty, Julie-Ann Dutton en Mark McClellen van het Kansas University Medical Center voor hun samenwerking en voor het implementeren van dit protocol op een afgelegen locatie. CY heeft onderzoeksondersteuning ontvangen van NIH-subsidie 1K08HL150271.
Materials
| 1000 µL Tips | Gilson | F174501 | Approximately 3 tips needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection |
| 15 mL tube | Biopioneeer | CNT-15 | To hold Solutions 2/3 2 needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection |
| 2 mL Cryovials | Globe Scientific | 3012 | Approximately 40 cryovials needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection |
| 20 µL Tips | Gilson | F174201 | For use in cell counting; volume needed is dependent on method of cell counting used. 1 tip is needed per 1 mL of unpooled frozen PBMCs to be defrosted |
| 50 mL Conical Tube | CEM Corporation | 50-187-7683 | 2 needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection 3 needed per 1 mL of unpooled frozen PBMCs to be defrosted |
| CD14 Antibody | Biolegend | 325621 | |
| CD16 Antibody | Biolegend | 360723 | |
| CD19 Antibody | Biolegend | 363007 | |
| CD3 Antibody | Biolegend | 300405 | |
| CD56 Antibody | Biolegend | 318303 | |
| CD66b Antibody | Biolegend | 305103 | |
| Cell Strainer | Biopioneeer | DGN258367 | 1 needed per 1 mL of unpooled frozen PBMCs to be defrosted |
| CPT Mononuclear Cell Preparation Tube | BD Biosciences | 362753 | 6 tubes needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection |
| Cryo Freezer Box | Southern Labware | SB2CC-81 | Holds 81 tubes 1 needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection |
| Cryotube Rack | Fisherbrand | 05-669-45 | Holds up to 50 cryovials |
| DMSO | Invitrogen | 15575020 | Approximately 2.5 mL needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection |
| DNase/RNase-Free Distilled Water | Invitrogen | 10977015 | Approximately 2 mL needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection Approximately 9 mL needed per 1 mL of frozen PBMCs to be defrosted |
| EDTA Tubes | BD Biosciences | 366643 | 1 tube needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection |
| Flavopiridol | Sigma-Aldrich | F3055-5MG | |
| HLA-DR Antibody | Biolegend | 307609 | |
| Human Serum Albumin | GeminiBio | 800-120 | Approximately 25 mL needed per patient or treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection |
| Human Trustain FcX | Biolegend | 422301 | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | W292912-1KG-K | For use in Mr. Frosty |
| Label Printer | Phomemo | M110-WH | |
| Live-Dead Stain | Biolegend | 423105 | |
| Mr. Frosty | Thermo Scientific | 5100-0001 | Holds up to 18 tubes. 2 Mr. Frostys needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection |
| Multidispense Pipette | Brandtech | 705110 | |
| Multidispense Pipette Tips | Brandtech | 705744 | Approximately 3 tips needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection |
| P1000 Pipette | Gilson | F144059M | |
| P20 Pipette | Gilson | F144056M | For use in cell counting; volume needed is dependent on method of cell counting used. |
| Printer Labels | Phomemo | PM-M110-3020 | Approximately 45 labels needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection Approximately 5 labels needed per 1 mL of unpooled frozen PBMCs to be defrosted |
| RNase-Free EDTA (0.5 M) | Invitrogen | AM9260G | Approximately 40 µL needed per 1 mL of frozen PBMCs to be defrosted |
| RNase-Free PBS (10X) | Invitrogen | AM9625 | Approximately 1 mL needed per 1 mL of frozen PBMCs to be defrosted |
| RNasin | Promega | N2111 | |
| RPMI | Corning | 10-040-CV | Approximately 80 mL needed per patient or treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection |
| Transfer Pipettes | Fisherbrand | 13-711-7M | Approximately 5 needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection |
| Tube Holder | Endicott-Seymour | 14-781-15 | Holds up to 80 CPT/EDTA Tubes |
References
- Mathew, J., Sankar, P., Varacallo, M. . Physiology, Blood Plasma. , (2018).
- Van Oost, B., Van Hien-Hagg, I. H., Timmermans, A. P., Sixma, J. J. The effect of thrombin on the density distribution of blood platelets: Detection of activated platelets in the circulation. Blood. 62 (2), 433-438 (1983).
- Hassani, M., et al. On the origin of low-density neutrophils. Journal of Leukocyte Biology. 107 (5), 809-818 (2020).
- Norouzi, N., Bhakta, H. C., Grover, W. H. Sorting cells by their density. PLOS ONE. 12 (7), e0180520 (2017).
- Manzone, T. A., Dam, H. Q., Soltis, D., Sagar, V. V. Blood volume analysis: A new technique and new clinical interest reinvigorate a classic study. JNMT. 35 (2), 55-63 (2007).
- Kleiveland, C. R. . The impact of food bioactives on health: In vitro and ex vivo models. , 161-167 (2015).
- Rosado, M., et al. Advances in biomarker detection: Alternative approaches for blood-based biomarker detection. Adv Clin Chem. 92, 141-199 (2019).
- Riedhammer, C., Halbritter, D., Weissert, R. . Multiple sclerosis: Methods and Protocols. 1304, 53-61 (2016).
- Panda, S. K., Ravindran, B. In vitro Culture of Human PBMCs. Bio Protoc. 3 (3), e322 (2013).
- He, D., et al. Whole blood vs PBMC: Compartmental differences in gene expression profiling exemplified in asthma. Allergy Asthma Clinic Immol. 15, 67 (2019).
- Pelák, O., et al. Lymphocyte enrichment using CD81-targeted immunoaffinity matrix. Cytometry Part A. 91 (1), 62-72 (2017).
- Higdon, L. E., et al. Impact on in-depth immunophenotyping of delay to peripheral blood processing. Clin Exp Immunol. 217 (2), 119-132 (2024).
- Liu, Z., et al. Photoactivatable aptamer-CRISPR nanodevice enables precise profiling of interferon-gamma release in humanized mice. ACS Nano. 18 (4), 3826-3838 (2024).
- Ren, Z., Li, C., Wang, J., Sui, J., Ma, Y. Single-cell transcriptome revealed dysregulated RNA-binding protein expression patterns and functions in human ankylosing spondylitis. Front Med. 11, 1369341 (2024).
- Honardoost, M. A., et al. Systematic immune cell dysregulation and molecular subtypes revealed by single-cell-RNA-seq of subjects with type 1 diabetes. Genome Med. 16, 45 (2024).
- Amini, A., Esmaeili, F., Golpich, M. Possible role of lncRNAs in amelioration of Parkinson’s disease symptoms by transplantation of dopaminergic cells. NPJ Parkinsons Dis. 10, 56 (2024).
- Luo, Y., et al. Sars-Cov-2 spike induces intestinal barrier dysfunction through the interaction between CEACAM5 and Galectin-9. Front Immunol. 15, e1303356 (2024).
- Zhang, X., Wu, G., Ma, X., Cheng, L. Immune cell alterations and PI3k-PKB pathway suppression in patients with allergic rhinitis undergoing sublingual immunotherapy. Adv Ther. 41 (2), 777-791 (2024).
- Rucci, C., et al. Exploring mitochondrial DNA copy number in circulating cell-free DNA and extracellular vesicles across cardiovascular health status: A prospective case-control pilot study. FASEB J. 38 (10), e23672 (2024).
- Ghamrawi, R., et al. Buffy coat DNA Methylation Profile is Representative of Methylation Patterns in White Blood Cell Types in Normal Pregnancy. Front Bioeng Biotechnol. 9, e782843 (2022).
- Johansson, C., et al. Plasma biomarker profiles in autosomal dominant Alzheimer’s disease. Brain. 146 (3), 1132-1140 (2023).
- Bonaterra-Pastra, A., et al. Comparison of plasma lipoprotein composition and function in cerebral amyloid angiopathy and Alzheimer’s disease. Biomedicines. 9 (1), 72 (2021).
- Green, M. R., Sambrook, J. Estimation of cell number by hemocytometry counting. Cold Spring Harb Protoc. (11), prot097980 (2019).
- Cobo, I., et al. Monosodium urate crystals regulate a unique JNK-dependent macrophage metabolic and inflammatory response. Cell Rep. 38 (10), e110489 (2022).
- Corkum, C. P., et al. Immune cell subsets and their gene expression profiles from human PBMC isolated by Vacutainer Cell Preparation Tube (CPT™) and standard density gradient. BMC Immunology. 16, 48 (2015).
- Golke, T., et al. Delays during PBMC isolation have a moderate effect on yield but severely compromise cell viability. Clin Chem Lab Med. 60 (5), 701-706 (2022).
- Fuss, I. J., Kanof, M. E., Smith, P. D., Zola, H. Isolation of whole mononuclear cells from peripheral blood and cord blood. Curr Protoc Immunol. 85 (1), 7.1.1-7.1.8 (2009).
- Faass, L., et al. Contribution of heptose metabolites and the cag pathogenicity island to the activation of monocytes/macrophages by Helicobacter Pylori. Front Immunol. 12, e632154 (2021).
- Preobrazhensky, S. N., Bahler, D. W. Immunomagnetic bead separation of mononuclear cells from contaminating granulocytes in cryopreserved blood samples. Cryobiology. 59 (3), 366-368 (2009).
- Schenz, J., Obermaier, M., Uhle, S., Weigand, M. A., Uhle, F. Low-density granulocyte contamination from peripheral blood mononuclear cells of patients with sepsis and how to remove it – A technical report. Front Immunol. 12, e684119 (2021).
- Tessema, B., Riemer, J., Sack, U., König, B. Cellular stress assay in peripheral blood mononuclear cells: factors influencing its results. Int J Mol Sci. 23 (21), 13118 (2022).
- Chen, X., Thibeault, S. 2013 35th Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society (EMBC). IEEE. , 6228-6231 (2013).
- Chen, X., Thibeault, S. abc. , 6228-6231 (2013).
- Yang, J., et al. The effects of storage temperature on PBMC gene expression. BMC Immunol. 17, 6 (2016).
- Ticha, O., Moos, L., Bekeredjian-Ding, I. Effects of long-term cryopreservation of PBMC on recovery of B cell subpopulations. J Immunol Methods. 495, e113081 (2021).
- Chao, S. -. H., Price, D. H. Flavopiridol inactivates P-TEFb and blocks most RNA polymerase II transcription in vivo. J of Biol Chem. 276 (34), 31793-31799 (2001).
- Banfi, G., Salvagno, G. L., Lippi, G. The role of ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) as in vitro anticoagulant for diagnostic purposes. Clin Chem Lab Med. 45 (5), 565-576 (2007).
- Mohri, M., Rezapoor, H. Effects of heparin, citrate, and EDTA on plasma biochemistry of sheep: Comparison with serum. Res Vet Sci. 86 (1), 111-114 (2009).
- Edwards, K., et al. Heparin-mediated PCR interference in SARS-CoV-2 assays and subsequent reversal with heparinase I. J Virol Methods. 327, 114944 (2024).
- Yokota, M., Tatsumi, N., Nathalang, O., Yamada, T., Tsuda, I. Effects of heparin on polymerase chain reaction for blood white cells. J Clin Lab Anal. 13 (3), 133-140 (1999).
- Yuan, Y., et al. Efficient long-term cryopreservation of pluripotent stem cells at -80 °C. Sci Rep. 6 (1), 34476 (2016).
