Isolamento e crioconservazione di cellule mononucleate del sangue periferico umano altamente vitali da sangue intero: una guida per principianti
Summary
Questo protocollo presenta una guida accessibile per la raccolta, la conservazione e lo scongelamento di cellule mononucleate del sangue periferico adatte per analisi e flussi di lavoro a valle come la citometria a flusso e il sequenziamento dell’RNA. Vengono dimostrate anche le collezioni di plasma e buffy coat.
Abstract
Le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) sono comunemente utilizzate nella ricerca biomedica sul sistema immunitario e la sua risposta a malattie e agenti patogeni. Questo protocollo dettagliato descrive le apparecchiature, le forniture e i passaggi per l’isolamento, la crioconservazione e lo scongelamento di PBMC di alta qualità e altamente vitali da cellule di sangue intero, adatte per applicazioni a valle come la citometria a flusso e il sequenziamento dell’RNA. Vengono inoltre descritti i protocolli per l’elaborazione del plasma e del buffy coat dal sangue intero in parallelo e in concomitanza con le PBMC. Questo protocollo passo-passo facile da seguire, che utilizza la centrifugazione in gradiente di densità per isolare le PBMC, è accompagnato da una lista di controllo di forniture, attrezzature e fasi di preparazione. Questo protocollo è adatto a persone con qualsiasi esperienza precedente con le tecniche di laboratorio e può essere implementato in laboratori clinici o di ricerca. La vitalità cellulare e il sequenziamento dell’RNA di alta qualità sono il risultato di PBMC raccolti da operatori senza precedenti esperienze di laboratorio nell’utilizzo di questo protocollo.
Introduction
Questo protocollo dimostra un metodo e un flusso di lavoro accessibili per l’isolamento delle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) dal sangue intero. Questo protocollo è rivolto in particolare ai tecnici di ricerca alle prime armi, agli studenti e al personale di laboratorio clinico con l’obiettivo di facilitare la raccolta e la crioconservazione delle PBMC senza presupporre una formazione preliminare nelle tecniche di laboratorio.
Questo protocollo utilizza la centrifugazione per separare i componenti del sangue intero in base alla densità. Il sangue intero è costituito da quattro componenti principali elencati in ordine decrescente di densità: globuli rossi/eritrociti (~45% del volume), globuli bianchi (<1% del volume), piastrine (<1% del volume) e plasma (~55% del volume)1,2,3,4,5,6. I globuli bianchi possono essere suddivisi in due categorie in base alle caratteristiche dei loro nuclei: rotondi o plurinucleati6. Le PBMC sono definite come globuli bianchi con nuclei rotondi e sono costituite dai seguenti tipi di cellule: linfociti (cellule T, cellule B, cellule NK), cellule dendritiche e monociti6. I globuli bianchi multinucleati includono i granulociti, che consistono nei seguenti tipi di cellule: neutrofili, basofili ed eosinofili6. I globuli bianchi multinucleati sono più densi dei PBMC6. Le densità di ciascun componente del sangue intero sono dettagliate nella Tabella 1.
In questo protocollo, il sangue intero viene raccolto in provette per centrifugazione a gradiente di densità. Queste provette contengono un terreno di gradiente di densità preconfezionato con una densità di 1,077 g/mL. Dopo la centrifugazione, le cellule più dense, compresi i globuli bianchi multinucleati e gli eritrociti, vengono separate dalle PBMC e dalle piastrine mediante il mezzo del gradiente di densità (Figura 1A)6,7. La PBMC e la frazione piastrinica vengono quindi raccolte, lavate e centrifugate per rimuovere le piastrine. Le PBMC purificate risultanti vengono raccolte e conservate a -80 °C o in azoto liquido. Le PBMC crioconservate possono essere scongelate in modo vitale e utilizzate direttamente nelle analisi a valle o ulteriormente elaborate per isolare specifici tipi di cellule componenti.
Questo protocollo è stato ottimizzato per il sequenziamento di RNA di alta qualità da PBMC altamente vitali. In questo articolo, le PBMC sono state isolate e crioconservate da pazienti in una clinica ambulatoriale. Successivamente, i monociti sono stati isolati dalle PBMC mediante FACS e analizzati tramite sequenziamento dell’RNA. Tuttavia, il protocollo può essere ampiamente adattato ad altre esigenze sperimentali come la coltura cellulare, l’editing genetico, gli studi funzionali ex-vivo, le analisi di singole cellule, la fenotipizzazione mediante citometria a flusso o citometria a tempo di volo, l’isolamento di DNA/RNA o proteine, vetrini per immunoistochimica, tra gli altri 8,9,10,11,12,13,14,15, 16,17,18.
Oltre alla raccolta di PBMC da provette per centrifugazione a gradiente di densità, questo protocollo esamina come raccogliere il plasma e il buffy coat tramite centrifugazione utilizzando una provetta EDTA. Dopo la centrifugazione, il sangue intero viene separato in plasma, eritrociti e un sottile strato di interfaccia chiamato buffy coat contenente leucociti (Figura 1B)6. Il buffy coat è comunemente usato per l’estrazione del DNA e le successive analisi genomiche19,20. Lo strato plasmatico contiene i componenti privi di cellule del sangue intero e può essere utilizzato per saggi di biomarcatori21,22.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo per la raccolta e la crioconservazione delle PBMC è stato implementato con successo da individui con e senza una precedente formazione di laboratorio di ricerca. Nella nostra applicazione, il sequenziamento FACS e RNA di monociti altamente vitali purificati da PBMC conservati ha portato a sequenze di alta qualità.
Uno dei principali punti di forza di questo protocollo è la sua accessibilità. La tecnica presentata nel protocollo utilizza t…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare i pazienti che hanno offerto volontariamente il loro consenso, il loro tempo e la donazione di campioni di sangue. Ringraziamo anche il Dr. Patrick Moriarty, Julie-Ann Dutton e Mark McClellen del Kansas University Medical Center per la loro collaborazione e per l’implementazione di questo protocollo in un sito remoto. CY ha ricevuto supporto per la ricerca dalla sovvenzione NIH 1K08HL150271.
Materials
| 1000 µL Tips | Gilson | F174501 | Approximately 3 tips needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection |
| 15 mL tube | Biopioneeer | CNT-15 | To hold Solutions 2/3 2 needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection |
| 2 mL Cryovials | Globe Scientific | 3012 | Approximately 40 cryovials needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection |
| 20 µL Tips | Gilson | F174201 | For use in cell counting; volume needed is dependent on method of cell counting used. 1 tip is needed per 1 mL of unpooled frozen PBMCs to be defrosted |
| 50 mL Conical Tube | CEM Corporation | 50-187-7683 | 2 needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection 3 needed per 1 mL of unpooled frozen PBMCs to be defrosted |
| CD14 Antibody | Biolegend | 325621 | |
| CD16 Antibody | Biolegend | 360723 | |
| CD19 Antibody | Biolegend | 363007 | |
| CD3 Antibody | Biolegend | 300405 | |
| CD56 Antibody | Biolegend | 318303 | |
| CD66b Antibody | Biolegend | 305103 | |
| Cell Strainer | Biopioneeer | DGN258367 | 1 needed per 1 mL of unpooled frozen PBMCs to be defrosted |
| CPT Mononuclear Cell Preparation Tube | BD Biosciences | 362753 | 6 tubes needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection |
| Cryo Freezer Box | Southern Labware | SB2CC-81 | Holds 81 tubes 1 needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection |
| Cryotube Rack | Fisherbrand | 05-669-45 | Holds up to 50 cryovials |
| DMSO | Invitrogen | 15575020 | Approximately 2.5 mL needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection |
| DNase/RNase-Free Distilled Water | Invitrogen | 10977015 | Approximately 2 mL needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection Approximately 9 mL needed per 1 mL of frozen PBMCs to be defrosted |
| EDTA Tubes | BD Biosciences | 366643 | 1 tube needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection |
| Flavopiridol | Sigma-Aldrich | F3055-5MG | |
| HLA-DR Antibody | Biolegend | 307609 | |
| Human Serum Albumin | GeminiBio | 800-120 | Approximately 25 mL needed per patient or treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection |
| Human Trustain FcX | Biolegend | 422301 | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | W292912-1KG-K | For use in Mr. Frosty |
| Label Printer | Phomemo | M110-WH | |
| Live-Dead Stain | Biolegend | 423105 | |
| Mr. Frosty | Thermo Scientific | 5100-0001 | Holds up to 18 tubes. 2 Mr. Frostys needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection |
| Multidispense Pipette | Brandtech | 705110 | |
| Multidispense Pipette Tips | Brandtech | 705744 | Approximately 3 tips needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection |
| P1000 Pipette | Gilson | F144059M | |
| P20 Pipette | Gilson | F144056M | For use in cell counting; volume needed is dependent on method of cell counting used. |
| Printer Labels | Phomemo | PM-M110-3020 | Approximately 45 labels needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection Approximately 5 labels needed per 1 mL of unpooled frozen PBMCs to be defrosted |
| RNase-Free EDTA (0.5 M) | Invitrogen | AM9260G | Approximately 40 µL needed per 1 mL of frozen PBMCs to be defrosted |
| RNase-Free PBS (10X) | Invitrogen | AM9625 | Approximately 1 mL needed per 1 mL of frozen PBMCs to be defrosted |
| RNasin | Promega | N2111 | |
| RPMI | Corning | 10-040-CV | Approximately 80 mL needed per patient or treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection |
| Transfer Pipettes | Fisherbrand | 13-711-7M | Approximately 5 needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection |
| Tube Holder | Endicott-Seymour | 14-781-15 | Holds up to 80 CPT/EDTA Tubes |
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