全血からの生存率の高いヒト末梢血単核細胞の単離と凍結保存:初心者向けガイド
1Division of Cardiology, Department of Medicine,University of California San Diego, 2Department of Medical Biochemistry, Amsterdam Immunity and Infection: Inflammatory diseases; Amsterdam Cardiovascular Sciences: Atherosclerosis and Ischemic Syndrome,Amsterdam UMC location University of Amsterdam, 3Department of Cellular and Molecular Medicine,University of California San Diego, 4Division of Clinical Immunology & Rheumatology, Department of Medicine, Heersink School of Medicine,University of Alabama at Birmingham, 5Comprehensive Arthritis, Musculoskeletal, Bone and Autoimmunity Center, Heersink School of Medicine,University of Alabama at Birmingham, 6Department of Medicine,University of California San Diego
Summary
このプロトコールは、末梢血単核細胞の収集、保存、融解のためのアクセス可能なガイドを提供し、フローサイトメトリーやRNAシーケンシングなどのダウンストリーム分析やワークフローに適しています。プラズマとバフィーコートのコレクションも実演されます。
Abstract
末梢血単核細胞(PBMC)は、免疫系とその疾患や病原体に対する応答に関する生物医学研究で一般的に使用されています。この詳細なプロトコルでは、フローサイトメトリーやRNAシーケンシングなどのダウンストリームアプリケーションに適した全血細胞から高品質で生存率の高いPBMCを分離、凍結保存、解凍するための機器、消耗品、および手順について説明します。全血からの血漿およびバフィーコートをPBMCと並行して同時に処理するためのプロトコルについても説明します。密度勾配遠心分離法を利用してPBMCを単離するこのわかりやすいステップバイステップのプロトコルには、消耗品、機器、および調製手順のチェックリストが付属しています。このプロトコルは、実験室技術の経験がある個人に適しており、臨床検査室または研究検査室で実施できます。高品質の細胞生存率とRNAシーケンシングは、このプロトコルを使用した実験室の経験がないオペレーターによって収集されたPBMCから得られました。
Introduction
このプロトコルは、全血から末梢血単核細胞(PBMC)を単離するためのアクセス可能な方法とワークフローを示しています。このプロトコルは、特に初心者の研究技術者、学生、臨床検査スタッフを対象としており、実験室技術の事前トレーニングを前提とせずにPBMCの収集と凍結保存を促進することを目的としています。
このプロトコルは、遠心分離を利用して全血の成分を密度で分離します。全血は、密度の小さい順にリストされた4つの主要な成分で構成されています:赤血球/赤血球(体積の~45%)、白血球(体積の<1%)、血小板(体積の<1%)、および血漿(体積の~55%)1,2,3,4,5,6。白血球は、その核の特性に基づいて、丸型または多核型の2つのカテゴリーに細分化できます6。PBMCは、丸い核を持つ白血球として定義され、リンパ球(T細胞、B細胞、NK細胞)、樹状細胞、および単球6の細胞タイプで構成されています。多核白血球には、好中球、好塩基球、好酸球6の細胞タイプからなる顆粒球が含まれます。多核白血球はPBMCよりも密度が高い6。全血の各成分の密度を表1に詳述します。
このプロトコルでは、全血を密度勾配遠心分離チューブに収集します。これらのチューブには、密度が 1.077 g/mL の密度グラジエント培地があらかじめ充填されています。遠心分離後、多核白血球および赤血球を含むより密度の高い細胞は、密度勾配培地によってPBMCおよび血小板から分離されます(図1A)6,7。次に、PBMCと血小板画分を収集、洗浄、遠心分離して血小板を除去します。得られた精製PBMCは、-80°Cまたは液体窒素で収集および保存されます。凍結保存されたPBMCは、生存可能な解凍を行い、ダウンストリーム分析で直接使用することも、特定の構成細胞タイプを単離するために追加処理することもできます。
このプロトコルは、生存率の高いPBMCからの高品質RNAシーケンシングに最適化されています。この記事では、PBMCを外来診療所の患者から分離し、凍結保存しました。その後、単球をFACSによってPBMCから単離し、RNAシーケンシングを介して分析しました。しかし、このプロトコルは、細胞培養、遺伝子編集、ex-vivo機能研究、シングルセル分析、フローサイトメトリーによる表現型決定、または飛行時間によるサイトメトリー、DNA/RNAまたはタンパク質の単離、免疫組織化学のスライドなど、他の実験ニーズに広く適応させることができます8,9,10,11,12,13,14,15、16、17、18。
密度勾配遠心分離チューブからのPBMC収集に加えて、このプロトコルでは、EDTAチューブを使用した遠心分離による血漿およびバフィーコートの収集方法を確認します。遠心分離後、全血は血漿、赤血球、および白血球を含むバフィーコートと呼ばれる薄い界面層に分離されます(図1B)6。バフィーコートは、DNA抽出およびその後のゲノム解析に一般的に使用される19,20。血漿層は全血の無細胞成分を含み、バイオマーカーアッセイ21,22に使用することができる。
Protocol
この研究プロトコルは、UCSDおよびKUMCのHuman Protections Programによって承認され、ヘルシンキ宣言に準拠しています。すべての個人は、参加と採血についてインフォームドコンセントを提供しました。 1. PBMCの作製・凍結保存 採血の1日前に、 表2 に記載されている材料と試薬のチェックリストを印刷し、それに応じ?…
Representative Results
PBMCの収集と凍結保存に続いて、56のユニークなサンプルからの解凍したPBMC、単球、およびリンパ球の生存率を、製造元の指示に従って表4にリストされている試薬を使用してフローサイトメトリーによって評価しました(図2A-F)。PBMC、単球、およびリンパ球の平均±SD生存率は、それぞれ94 ± 4.0%、98 ± 1.1%、および93 ± 5.6%?…
Discussion
PBMCの収集と凍結保存のためのこのプロトコルは、事前の研究室でのトレーニングの有無にかかわらず、個人によって成功裏に実施されています。私たちのアプリケーションでは、保存されたPBMCから精製された生存率の高い単球のFACSおよびRNAシーケンシングにより、高品質のシーケンシングが得られました。
このプロトコルの大きな強みは、そ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ボランティアで同意してくださった患者様、時間をお過ごしいただき、血液サンプルの提供にご協力いただいたことに感謝いたします。また、カンザス大学医療センターのPatrick Moriarty博士、Julie-Ann Dutton博士、Mark McClellen氏には、協力してこのプロトコルを遠隔地で実施してくださったことに感謝いたします。CYは、NIHの助成金1K08HL150271から研究支援を受けています。
Materials
| 1000 µL Tips | Gilson | F174501 | Approximately 3 tips needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection |
| 15 mL tube | Biopioneeer | CNT-15 | To hold Solutions 2/3 2 needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection |
| 2 mL Cryovials | Globe Scientific | 3012 | Approximately 40 cryovials needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection |
| 20 µL Tips | Gilson | F174201 | For use in cell counting; volume needed is dependent on method of cell counting used. 1 tip is needed per 1 mL of unpooled frozen PBMCs to be defrosted |
| 50 mL Conical Tube | CEM Corporation | 50-187-7683 | 2 needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection 3 needed per 1 mL of unpooled frozen PBMCs to be defrosted |
| CD14 Antibody | Biolegend | 325621 | |
| CD16 Antibody | Biolegend | 360723 | |
| CD19 Antibody | Biolegend | 363007 | |
| CD3 Antibody | Biolegend | 300405 | |
| CD56 Antibody | Biolegend | 318303 | |
| CD66b Antibody | Biolegend | 305103 | |
| Cell Strainer | Biopioneeer | DGN258367 | 1 needed per 1 mL of unpooled frozen PBMCs to be defrosted |
| CPT Mononuclear Cell Preparation Tube | BD Biosciences | 362753 | 6 tubes needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection |
| Cryo Freezer Box | Southern Labware | SB2CC-81 | Holds 81 tubes 1 needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection |
| Cryotube Rack | Fisherbrand | 05-669-45 | Holds up to 50 cryovials |
| DMSO | Invitrogen | 15575020 | Approximately 2.5 mL needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection |
| DNase/RNase-Free Distilled Water | Invitrogen | 10977015 | Approximately 2 mL needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection Approximately 9 mL needed per 1 mL of frozen PBMCs to be defrosted |
| EDTA Tubes | BD Biosciences | 366643 | 1 tube needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection |
| Flavopiridol | Sigma-Aldrich | F3055-5MG | |
| HLA-DR Antibody | Biolegend | 307609 | |
| Human Serum Albumin | GeminiBio | 800-120 | Approximately 25 mL needed per patient or treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection |
| Human Trustain FcX | Biolegend | 422301 | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | W292912-1KG-K | For use in Mr. Frosty |
| Label Printer | Phomemo | M110-WH | |
| Live-Dead Stain | Biolegend | 423105 | |
| Mr. Frosty | Thermo Scientific | 5100-0001 | Holds up to 18 tubes. 2 Mr. Frostys needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection |
| Multidispense Pipette | Brandtech | 705110 | |
| Multidispense Pipette Tips | Brandtech | 705744 | Approximately 3 tips needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection |
| P1000 Pipette | Gilson | F144059M | |
| P20 Pipette | Gilson | F144056M | For use in cell counting; volume needed is dependent on method of cell counting used. |
| Printer Labels | Phomemo | PM-M110-3020 | Approximately 45 labels needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection Approximately 5 labels needed per 1 mL of unpooled frozen PBMCs to be defrosted |
| RNase-Free EDTA (0.5 M) | Invitrogen | AM9260G | Approximately 40 µL needed per 1 mL of frozen PBMCs to be defrosted |
| RNase-Free PBS (10X) | Invitrogen | AM9625 | Approximately 1 mL needed per 1 mL of frozen PBMCs to be defrosted |
| RNasin | Promega | N2111 | |
| RPMI | Corning | 10-040-CV | Approximately 80 mL needed per patient or treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection |
| Transfer Pipettes | Fisherbrand | 13-711-7M | Approximately 5 needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection |
| Tube Holder | Endicott-Seymour | 14-781-15 | Holds up to 80 CPT/EDTA Tubes |
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Cite This Article
Dinh, B., Hoeksema, M. A., Spann, N. J., Rendler, J., Cobo, I., Glass, C. K., Yeang, C. Isolation and Cryopreservation of Highly Viable Human Peripheral Blood Mononuclear Cells From Whole Blood: A Guide for Beginners. J. Vis. Exp. (212), e66794, doi:10.3791/66794 (2024).