Summary

Aislamiento y criopreservación de células mononucleares de sangre periférica humana altamente viables a partir de sangre total: una guía para principiantes

Published: October 25, 2024
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Summary

Este protocolo presenta una guía accesible para recolectar, almacenar y descongelar células mononucleares de sangre periférica adecuada para análisis posteriores y flujos de trabajo como la citometría de flujo y la secuenciación de ARN. También se muestran las colecciones de pelajes de plasma y buffy.

Abstract

Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se utilizan habitualmente en la investigación biomédica sobre el sistema inmunitario y su respuesta a enfermedades y patógenos. Este protocolo detallado describe el equipo, los suministros y los pasos para aislar, criopreservar y descongelar PBMC de alta calidad y altamente viables a partir de células sanguíneas completas adecuadas para aplicaciones posteriores como la citometría de flujo y la secuenciación de ARN. También se describen los protocolos para el procesamiento de plasma y capa leucocitaria de la sangre total en paralelo y simultáneamente con PBMC. Este protocolo paso a paso fácil de seguir, que utiliza la centrifugación en gradiente de densidad para aislar las PBMC, va acompañado de una lista de verificación de suministros, equipos y pasos de preparación. Este protocolo es adecuado para personas con experiencia previa con técnicas de laboratorio y puede implementarse en laboratorios clínicos o de investigación. La viabilidad celular de alta calidad y la secuenciación del ARN fueron el resultado de PBMC recopilados por operadores sin experiencia previa en el laboratorio utilizando este protocolo.

Introduction

Este protocolo demuestra un método y un flujo de trabajo accesibles para el aislamiento de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de sangre completa. Este protocolo está especialmente dirigido a técnicos de investigación noveles, estudiantes y personal de laboratorio clínico con el objetivo de facilitar la recolección y criopreservación de PBMCs sin suponer una formación previa en técnicas de laboratorio.

Este protocolo utiliza la centrifugación para separar los componentes de la sangre total por densidad. La sangre total consta de cuatro componentes principales enumerados en orden decreciente de densidad: glóbulos rojos/eritrocitos (~45% del volumen), glóbulos blancos (<1% del volumen), plaquetas (<1% del volumen) y plasma (~55% del volumen)1,2,3,4,5,6. Los glóbulos blancos se pueden subdividir en dos categorías en función de las características de sus núcleos: redondos o multinucleados6. Las PBMC se definen como glóbulos blancos con núcleos redondos y constan de los siguientes tipos de células: linfocitos (linfocitos T, linfocitos B, linfocitos NK), linfocitos dendríticos y monocitos6. Los glóbulos blancos multinucleados incluyen granulocitos, que consisten en los siguientes tipos de células: neutrófilos, basófilos y eosinófilos6. Los glóbulos blancos multinucleados son más densos que los PBMC6. Las densidades de cada componente de la sangre total se detallan en la Tabla 1.

En este protocolo, la sangre entera se recolecta en tubos de centrifugación en gradiente de densidad. Estos tubos contienen un medio de gradiente de densidad preenvasado que tiene una densidad de 1,077 g/mL. Después de la centrifugación, las células más densas, incluidos los glóbulos blancos multinucleados y los eritrocitos, se separan de las PBMC y las plaquetas por el medio de gradiente de densidad (Figura 1A)6,7. A continuación, se recoge, se lava y se centrifuga la PBMC y la fracción plaquetaria para eliminar las plaquetas. Los PBMC purificados resultantes se recogen y almacenan a -80 °C o en nitrógeno líquido. Las PBMC criopreservadas pueden descongelarse de forma viable y utilizarse directamente en análisis posteriores o procesarse adicionalmente para aislar tipos de células componentes específicas.

Este protocolo se ha optimizado para la secuenciación de ARN de alta calidad a partir de PBMC altamente viables. En este artículo, se aislaron y criopreservaron PBMC de pacientes en una clínica ambulatoria. Posteriormente, los monocitos se aislaron de PBMC mediante FACS y se analizaron mediante secuenciación de ARN. Sin embargo, el protocolo puede adaptarse ampliamente a otras necesidades experimentales como el cultivo celular, la edición de genes, los estudios funcionales ex-vivo, los análisis de células individuales, el fenotipado por citometría de flujo o citometría por tiempo de vuelo, el aislamiento de ADN/ARN o proteínas, los portaobjetos para inmunohistoquímica, entre otros 8,9,10,11,12,13,14,15, 16,17,18.

Además de la recolección de PBMC de los tubos de centrifugación en gradiente de densidad, este protocolo revisa cómo recolectar plasma y capa leucocitaria mediante centrifugación usando un tubo de EDTA. Después de la centrifugación, la sangre entera se separa en plasma, eritrocitos y una fina capa de interfaz denominada capa leucocitaria que contiene leucocitos (Figura 1B)6. El pelaje leucocitario se utiliza habitualmente para la extracción de ADN y los posteriores análisis genómicos19,20. La capa de plasma contiene los componentes libres de células de la sangre total y puede utilizarse para ensayos de biomarcadores 21,22.

Protocol

El protocolo del estudio fue aprobado por el Programa de Protección Humana de UCSD y KUMC y se ajusta a la Declaración de Helsinki. Todas las personas dieron su consentimiento informado para la participación y la recolección de sangre. 1. Procesamiento y criopreservación de PBMC Un día antes de la recolección de sangre, imprima la lista de verificación de materiales y reactivos enumerados en la Tabla 2 y prep…

Representative Results

Después de la recolección y criopreservación de PBMC, se evaluó la viabilidad de PBMC, monocitos y linfocitos descongelados de 56 muestras únicas mediante citometría de flujo utilizando los reactivos enumerados en la Tabla 4 siguiendo las instrucciones del fabricante (Figura 2A-F). Se logró una viabilidad media ± SD de PBMCs, monocitos y linfocitos de 94 ± 4,0%, 98 ± 1,1% y 93 ± 5,6%, respectivamente (<strong clas…

Discussion

Este protocolo para la recolección y criopreservación de PBMC ha sido implementado con éxito por personas con y sin capacitación previa en laboratorio de investigación. En nuestra aplicación, la secuenciación de FACS y ARN de monocitos altamente viables purificados a partir de PBMC almacenados dio como resultado secuencias de alta calidad.

Una de las principales fortalezas de este protocolo es su accesibilidad. La técnica presentada en el protocolo uti…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nos gustaría agradecer a los pacientes que ofrecieron voluntariamente su consentimiento, tiempo y donación de muestras de sangre. También agradecemos al Dr. Patrick Moriarty, Julie-Ann Dutton y Mark McClellen del Centro Médico de la Universidad de Kansas por su colaboración y por implementar este protocolo en un sitio remoto. CY ha recibido apoyo de investigación de la subvención 1K08HL150271 de los NIH.

Materials

1000 µL Tips Gilson F174501 Approximately 3 tips needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
15 mL tube Biopioneeer CNT-15 To hold Solutions 2/3
2 needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
2 mL Cryovials Globe Scientific 3012 Approximately 40 cryovials needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
20 µL Tips Gilson F174201 For use in cell counting; volume needed is dependent on method of cell counting used. 1 tip is needed per 1 mL of unpooled frozen PBMCs to be defrosted
50 mL Conical Tube CEM Corporation 50-187-7683 2 needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
3 needed per 1 mL of unpooled frozen PBMCs to be defrosted
CD14 Antibody Biolegend 325621
CD16 Antibody Biolegend 360723
CD19 Antibody Biolegend 363007
CD3 Antibody Biolegend 300405
CD56 Antibody Biolegend 318303
CD66b Antibody Biolegend 305103
Cell Strainer Biopioneeer DGN258367 1 needed per 1 mL of unpooled frozen PBMCs to be defrosted
CPT Mononuclear Cell Preparation Tube BD Biosciences 362753 6 tubes needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Cryo Freezer Box Southern Labware SB2CC-81 Holds 81 tubes
1 needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Cryotube Rack Fisherbrand 05-669-45 Holds up to 50 cryovials
DMSO Invitrogen 15575020 Approximately 2.5 mL needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
DNase/RNase-Free Distilled Water Invitrogen 10977015 Approximately 2 mL needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Approximately 9 mL needed per 1 mL of frozen PBMCs to be defrosted
EDTA Tubes BD Biosciences 366643 1 tube needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Flavopiridol Sigma-Aldrich F3055-5MG
HLA-DR Antibody Biolegend 307609
Human Serum Albumin GeminiBio 800-120 Approximately 25 mL needed per patient or treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Human Trustain FcX Biolegend 422301
Isopropanol Sigma-Aldrich W292912-1KG-K For use in Mr. Frosty
Label Printer Phomemo M110-WH
Live-Dead Stain Biolegend 423105
Mr. Frosty Thermo Scientific 5100-0001 Holds up to 18 tubes.
2 Mr. Frostys needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Multidispense Pipette Brandtech 705110
Multidispense Pipette Tips Brandtech 705744 Approximately 3 tips needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
P1000 Pipette Gilson F144059M
P20 Pipette Gilson F144056M For use in cell counting; volume needed is dependent on method of cell counting used.
Printer Labels Phomemo PM-M110-3020 Approximately 45 labels needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Approximately 5 labels needed per 1 mL of unpooled frozen PBMCs to be defrosted
RNase-Free EDTA (0.5 M) Invitrogen AM9260G Approximately 40 µL needed per 1 mL of frozen PBMCs to be defrosted
RNase-Free PBS (10X) Invitrogen AM9625 Approximately 1 mL needed per 1 mL of frozen PBMCs to be defrosted
RNasin Promega N2111
RPMI Corning 10-040-CV Approximately 80 mL needed per patient or treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Transfer Pipettes Fisherbrand 13-711-7M Approximately 5 needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Tube Holder Endicott-Seymour 14-781-15 Holds up to 80 CPT/EDTA Tubes

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Dinh, B., Hoeksema, M. A., Spann, N. J., Rendler, J., Cobo, I., Glass, C. K., Yeang, C. Isolation and Cryopreservation of Highly Viable Human Peripheral Blood Mononuclear Cells From Whole Blood: A Guide for Beginners. J. Vis. Exp. (212), e66794, doi:10.3791/66794 (2024).

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