Este protocolo presenta una guía accesible para recolectar, almacenar y descongelar células mononucleares de sangre periférica adecuada para análisis posteriores y flujos de trabajo como la citometría de flujo y la secuenciación de ARN. También se muestran las colecciones de pelajes de plasma y buffy.
Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se utilizan habitualmente en la investigación biomédica sobre el sistema inmunitario y su respuesta a enfermedades y patógenos. Este protocolo detallado describe el equipo, los suministros y los pasos para aislar, criopreservar y descongelar PBMC de alta calidad y altamente viables a partir de células sanguíneas completas adecuadas para aplicaciones posteriores como la citometría de flujo y la secuenciación de ARN. También se describen los protocolos para el procesamiento de plasma y capa leucocitaria de la sangre total en paralelo y simultáneamente con PBMC. Este protocolo paso a paso fácil de seguir, que utiliza la centrifugación en gradiente de densidad para aislar las PBMC, va acompañado de una lista de verificación de suministros, equipos y pasos de preparación. Este protocolo es adecuado para personas con experiencia previa con técnicas de laboratorio y puede implementarse en laboratorios clínicos o de investigación. La viabilidad celular de alta calidad y la secuenciación del ARN fueron el resultado de PBMC recopilados por operadores sin experiencia previa en el laboratorio utilizando este protocolo.
Este protocolo demuestra un método y un flujo de trabajo accesibles para el aislamiento de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de sangre completa. Este protocolo está especialmente dirigido a técnicos de investigación noveles, estudiantes y personal de laboratorio clínico con el objetivo de facilitar la recolección y criopreservación de PBMCs sin suponer una formación previa en técnicas de laboratorio.
Este protocolo utiliza la centrifugación para separar los componentes de la sangre total por densidad. La sangre total consta de cuatro componentes principales enumerados en orden decreciente de densidad: glóbulos rojos/eritrocitos (~45% del volumen), glóbulos blancos (<1% del volumen), plaquetas (<1% del volumen) y plasma (~55% del volumen)1,2,3,4,5,6. Los glóbulos blancos se pueden subdividir en dos categorías en función de las características de sus núcleos: redondos o multinucleados6. Las PBMC se definen como glóbulos blancos con núcleos redondos y constan de los siguientes tipos de células: linfocitos (linfocitos T, linfocitos B, linfocitos NK), linfocitos dendríticos y monocitos6. Los glóbulos blancos multinucleados incluyen granulocitos, que consisten en los siguientes tipos de células: neutrófilos, basófilos y eosinófilos6. Los glóbulos blancos multinucleados son más densos que los PBMC6. Las densidades de cada componente de la sangre total se detallan en la Tabla 1.
En este protocolo, la sangre entera se recolecta en tubos de centrifugación en gradiente de densidad. Estos tubos contienen un medio de gradiente de densidad preenvasado que tiene una densidad de 1,077 g/mL. Después de la centrifugación, las células más densas, incluidos los glóbulos blancos multinucleados y los eritrocitos, se separan de las PBMC y las plaquetas por el medio de gradiente de densidad (Figura 1A)6,7. A continuación, se recoge, se lava y se centrifuga la PBMC y la fracción plaquetaria para eliminar las plaquetas. Los PBMC purificados resultantes se recogen y almacenan a -80 °C o en nitrógeno líquido. Las PBMC criopreservadas pueden descongelarse de forma viable y utilizarse directamente en análisis posteriores o procesarse adicionalmente para aislar tipos de células componentes específicas.
Este protocolo se ha optimizado para la secuenciación de ARN de alta calidad a partir de PBMC altamente viables. En este artículo, se aislaron y criopreservaron PBMC de pacientes en una clínica ambulatoria. Posteriormente, los monocitos se aislaron de PBMC mediante FACS y se analizaron mediante secuenciación de ARN. Sin embargo, el protocolo puede adaptarse ampliamente a otras necesidades experimentales como el cultivo celular, la edición de genes, los estudios funcionales ex-vivo, los análisis de células individuales, el fenotipado por citometría de flujo o citometría por tiempo de vuelo, el aislamiento de ADN/ARN o proteínas, los portaobjetos para inmunohistoquímica, entre otros 8,9,10,11,12,13,14,15, 16,17,18.
Además de la recolección de PBMC de los tubos de centrifugación en gradiente de densidad, este protocolo revisa cómo recolectar plasma y capa leucocitaria mediante centrifugación usando un tubo de EDTA. Después de la centrifugación, la sangre entera se separa en plasma, eritrocitos y una fina capa de interfaz denominada capa leucocitaria que contiene leucocitos (Figura 1B)6. El pelaje leucocitario se utiliza habitualmente para la extracción de ADN y los posteriores análisis genómicos19,20. La capa de plasma contiene los componentes libres de células de la sangre total y puede utilizarse para ensayos de biomarcadores 21,22.
Este protocolo para la recolección y criopreservación de PBMC ha sido implementado con éxito por personas con y sin capacitación previa en laboratorio de investigación. En nuestra aplicación, la secuenciación de FACS y ARN de monocitos altamente viables purificados a partir de PBMC almacenados dio como resultado secuencias de alta calidad.
Una de las principales fortalezas de este protocolo es su accesibilidad. La técnica presentada en el protocolo uti…
The authors have nothing to disclose.
Nos gustaría agradecer a los pacientes que ofrecieron voluntariamente su consentimiento, tiempo y donación de muestras de sangre. También agradecemos al Dr. Patrick Moriarty, Julie-Ann Dutton y Mark McClellen del Centro Médico de la Universidad de Kansas por su colaboración y por implementar este protocolo en un sitio remoto. CY ha recibido apoyo de investigación de la subvención 1K08HL150271 de los NIH.
1000 µL Tips | Gilson | F174501 | Approximately 3 tips needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection |
15 mL tube | Biopioneeer | CNT-15 | To hold Solutions 2/3 2 needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection |
2 mL Cryovials | Globe Scientific | 3012 | Approximately 40 cryovials needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection |
20 µL Tips | Gilson | F174201 | For use in cell counting; volume needed is dependent on method of cell counting used. 1 tip is needed per 1 mL of unpooled frozen PBMCs to be defrosted |
50 mL Conical Tube | CEM Corporation | 50-187-7683 | 2 needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection 3 needed per 1 mL of unpooled frozen PBMCs to be defrosted |
CD14 Antibody | Biolegend | 325621 | |
CD16 Antibody | Biolegend | 360723 | |
CD19 Antibody | Biolegend | 363007 | |
CD3 Antibody | Biolegend | 300405 | |
CD56 Antibody | Biolegend | 318303 | |
CD66b Antibody | Biolegend | 305103 | |
Cell Strainer | Biopioneeer | DGN258367 | 1 needed per 1 mL of unpooled frozen PBMCs to be defrosted |
CPT Mononuclear Cell Preparation Tube | BD Biosciences | 362753 | 6 tubes needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection |
Cryo Freezer Box | Southern Labware | SB2CC-81 | Holds 81 tubes 1 needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection |
Cryotube Rack | Fisherbrand | 05-669-45 | Holds up to 50 cryovials |
DMSO | Invitrogen | 15575020 | Approximately 2.5 mL needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection |
DNase/RNase-Free Distilled Water | Invitrogen | 10977015 | Approximately 2 mL needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection Approximately 9 mL needed per 1 mL of frozen PBMCs to be defrosted |
EDTA Tubes | BD Biosciences | 366643 | 1 tube needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection |
Flavopiridol | Sigma-Aldrich | F3055-5MG | |
HLA-DR Antibody | Biolegend | 307609 | |
Human Serum Albumin | GeminiBio | 800-120 | Approximately 25 mL needed per patient or treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection |
Human Trustain FcX | Biolegend | 422301 | |
Isopropanol | Sigma-Aldrich | W292912-1KG-K | For use in Mr. Frosty |
Label Printer | Phomemo | M110-WH | |
Live-Dead Stain | Biolegend | 423105 | |
Mr. Frosty | Thermo Scientific | 5100-0001 | Holds up to 18 tubes. 2 Mr. Frostys needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection |
Multidispense Pipette | Brandtech | 705110 | |
Multidispense Pipette Tips | Brandtech | 705744 | Approximately 3 tips needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection |
P1000 Pipette | Gilson | F144059M | |
P20 Pipette | Gilson | F144056M | For use in cell counting; volume needed is dependent on method of cell counting used. |
Printer Labels | Phomemo | PM-M110-3020 | Approximately 45 labels needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection Approximately 5 labels needed per 1 mL of unpooled frozen PBMCs to be defrosted |
RNase-Free EDTA (0.5 M) | Invitrogen | AM9260G | Approximately 40 µL needed per 1 mL of frozen PBMCs to be defrosted |
RNase-Free PBS (10X) | Invitrogen | AM9625 | Approximately 1 mL needed per 1 mL of frozen PBMCs to be defrosted |
RNasin | Promega | N2111 | |
RPMI | Corning | 10-040-CV | Approximately 80 mL needed per patient or treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection |
Transfer Pipettes | Fisherbrand | 13-711-7M | Approximately 5 needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection |
Tube Holder | Endicott-Seymour | 14-781-15 | Holds up to 80 CPT/EDTA Tubes |