Automatically Generated

Summary

Denne studien skisserer en ny tilnærming for etablering av humane monocytt-avledede mikroglia-lignende (iMG) celler som muliggjør indirekte vurdering av hjernebetennelse. Dette presenterer en cellulær modell som kan være gunstig for forskning med fokus på potensiell betennelse i hjernen og tilhørende nevropsykiatriske lidelser.

Abstract

Nylige undersøkelser ved bruk av dyremodeller har fremhevet betydningen av mikroglia som avgjørende immunologiske modulatorer ved ulike nevropsykiatriske og fysiske sykdommer. Postmortem hjerneanalyse og positronemisjonstomografiavbildning er representative forskningsmetoder som evaluerer mikrogliaaktivering hos menneskelige pasienter; Funnene har avslørt aktivering av mikroglia i hjernen til pasienter med ulike nevropsykiatriske lidelser og kroniske smerter. Ikke desto mindre letter den nevnte teknikken bare vurderingen av begrensede aspekter ved mikrogliaaktivering.

I stedet for hjernebiopsi og den induserte pluripotente stamcelleteknikken, utviklet vi opprinnelig en teknikk for å generere direkte induserte mikroglia-lignende (iMG) celler fra nyavledede humane perifere blodmonocytter ved å supplere dem med granulocytt-makrofagkolonistimulerende faktor og interleukin 34 i 2 uker. Disse iMG-cellene kan brukes til å utføre dynamiske morfologiske og molekylære analyser angående fagocytisk kapasitet og cytokinfrigjøring etter stressstimulering på cellenivå. Nylig har omfattende transkriptomanalyse blitt brukt for å verifisere likheten mellom humane iMG-celler og hjernens primære mikroglia.

De pasientavledede iMG-cellene kan tjene som viktige surrogatmarkører for å forutsi mikrogliaaktivering i menneskelige hjerner og har hjulpet til med avsløringen av tidligere ukjent dynamisk patofysiologi av mikroglia hos pasienter med Nasu-Hakola sykdom, fibromyalgi, bipolar lidelse og Moyamoya sykdom. Derfor fungerer den iMG-baserte teknikken som et verdifullt reverse-translasjonelt verktøy og gir ny innsikt i å belyse dynamisk den molekylære patofysiologien til mikroglia i en rekke mentale og fysiske sykdommer.

Introduction

De siste årene har hjernebetennelse blitt foreslått å påta sentrale roller i patofysiologien til ulike hjerne- og nevropsykiatriske lidelser; mikroglia har blitt fremhevet som viktige immunmodulerende celler ved human postmortem hjerneanalyse og positronemisjonstomografi (PET)-baserte bioavbildningsteknikker 1,2,3,4. Postmortem hjerne- og PET-avbildningsanalyser avslører betydelige funn; Likevel er disse tilnærmingene ineffektive når det gjelder å fange de dynamiske molekylære aktivitetene til menneskelig mikroglia i hjernen i sin helhet. Derfor er det nødvendig med nye strategier for å muliggjøre omfattende evaluering av menneskelige mikrogliale funksjoner og dysfunksjoner på molekylært og cellulært nivå.

I 2014 konstruerte vi opprinnelig en ny teknikk for å produsere direkte induserte mikroglia-lignende (iMG) celler ^5,6, før den første publiseringen av menneskeinduserte pluripotente stamceller (iPSC)-avledede mikroglia-lignende celler i 2016⁷. På bare 2 uker konverterte vi vellykket humane perifere blodmonocytter til iMG-celler ved å optimalisere cytokinene, granulocytt-makrofagkolonistimulerende faktor (GM-CSF) og interleukin 34 (IL-34). Da vi utviklet denne teknikken, begynte den innovative omprogrammeringsmetoden for å indusere nevronale celler fra iPS-celler eller fibroblaster akkurat å råde i verden 8,9,10,11. På den tiden var imidlertid en metode for å indusere iPS-avledede mikrogliaceller ennå ikke rapportert, og generering av en human somatisk celle-avledet mikrogliamodell var ønsket. Siden cytokiner som GM-CSF og IL-34, makrofagkolonistimulerende faktor, ble rapportert å være nødvendige for utvikling og vedlikehold av mikroglia 12,13,14,15, antok vi at en kombinasjon av disse cytokinene kunne brukes direkte for å generere en mikroglial cellulær modell fra blodmonocytter. Til slutt lyktes vi med å utvikle en modell av mikroglia avledet fra monocytter ved å kombinere GM-CSF og IL-34⁵. I tillegg brukes noen av disse kombinasjonene av cytokiner også for å indusere mikroglia fra iPS-celler ^7,16 og antas å være en viktig faktor for å tilegne seg mikrogliale egenskaper.

I motsetning til iPSC-metoder, krever ikke iMG-celler noen genetisk modifikasjon og kan genereres på svært kort tid ved enkel kjemisk induksjon, noe som resulterer i lavere tid og økonomiske kostnader. Videre krever ikke iMG-celler genetisk omprogrammering, så vi tror at iMG-celler er potente surrogatceller for å evaluere ikke bare egenskapene, men også tilstandene til menneskelig mikroglia. I den første artikkelen om iMG-teknikken i 2014 bekreftet vi at iMG-celler viser en fenotype av humane mikroglia, som kan være forskjellig fra monocytter og makrofager. For eksempel viste iMG-celler et overekspresjonsforhold av CX3C kjemokinreseptor 1 (CX3CR1) og CC kjemokinreseptor type 2 (CCR2) enn monocytter og typiske mikrogliamarkører, inkludert transmembranprotein 119 (TMEM 119) og purinerg reseptor P2RY12 ^5,17. Nylig validerte vi at perifere blodavledede iMG-celler ligner hjernemikroglia i deres genuttrykksprofil av velkjente mikrogliamarkører hos samme pasient som gjennomgikk hjerneoperasjoner¹⁸. iMG-cellene kan analyseres for dynamiske funksjoner på molekylært nivå, som fagocytose og cytokinproduksjon, og forventes å kompensere for ulempene ved postmortem hjerneforskning og PET-studier.

Vi har oppdaget tidligere ukjente dynamiske patofysiologiske mekanismer som involverer mikroglia hos pasienter diagnostisert med Nasu-Hakola sykdom⁵, fibromyalgi¹⁹, bipolar lidelse^20,21 eller Moyamoya sykdom²². Videre, basert på vår opprinnelige metodikk, har forskjellige laboratorier brukt iMG-cellene (enkelte laboratorier har utpekt alternative navn til disse cellene) som et avgjørende omvendt-translasjonelt forskningsverktøy 23,24,25,26,27. Sellgren et al. genererte med suksess iMG-celler i samsvar med våre anbefalinger og gjennomførte en mikroarray-analyse, som avslørte at disse cellene ligner mye på menneskelig hjernemikroglia²³. Nylig bekreftet vi likheten mellom humane iMG-celler og hjernens primære mikroglia ved hjelp av RNA-sekvensering¹⁸.

Denne studien hadde som mål å dokumentere metodikken for å generere iMG-celler fra humant perifert blod for å legge til rette for omvendt translasjonell forskning fokusert på nevropsykiatriske sykdommer. Denne teknikken presenterer potensial som et rimelig analytisk verktøy som enkelt kan produsere mikrogliacellulære modeller på kort tid, selv i dårlig utstyrte laboratorier som mangler genoverføringsapparat eller dyktig personell.

Protocol

Studieprotokollen ble godkjent av etikkkomiteen ved Kyushu University og overholdt alle bestemmelsene i Helsinki-erklæringen. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle deltakere, inkludert friske frivillige og pasienter, til å analysere blodet deres og publisere dataene deres. Materialer og utstyr er oppført i materialtabellen, og sammensetningen av løsningene er beskrevet i tabell 1. 1. Klargjøring av medier og buffere for eksperimenter</…

Representative Results

Det er viktig at det er mye heterogenitet på personnivå og tidsnivå i karakterene til iMG-celler, inkludert morfologier og genuttrykk. iMG-cellene hos enkelte individer antar et tallrikt forgreningsutseende (figur 1A), mens de hos andre forblir sfæriske (figur 1B). iMG-egenskapene kan variere selv innenfor et enkelt individ, noe som gjør iMG-celler til et sentralt verktøy for å oppdage biomarkører for sykdomstilstand. Motsatt rettferdiggjør undersøkels…

Discussion

Analytiske teknikker som bruker iMG-celler kan tjene som potente reverse-translasjonelle forskningsverktøy ^5,6. For å generere tilstrekkelige mengder humane iMG-celler, bør eksperimentatorer designe studiene sine med tanke på visse problemer. Blodprøver fra mennesker er ekstremt følsomme; følgelig garanterer de oppnådde prøvene rask behandling og omhyggelig håndtering for å unngå kontaminering. Spesielt bør blodprøver skilles umiddelbart etter at de…

Materials

0.1% Triton X-100	Sigma-Aldrich	30-5140-5
4% paraformaldehyde	Nacalai Tesque	09154-14
Antibiotic-Antimycotic (100x)	gibco	15240-062	described as "antibiotic-antimycotic solution"
autoMACS Rinsing Solution	Miltenyi Biotec	130-091-222	described as "basic buffer solution" and used for "isolation buffer"
CD11b MicroBeads	Miltenyi Biotec	130–049-601
DAPI solution	DOJINDO	28718-90-3
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Nacalai Tesque	14249-24	described as "PBS (−)"
Fetal Bovine Serum	biowest	S1760-500
Histopaque-1077	Sigma-Aldrich	10771	described as "density gradient medium"
Human FcR Blocking Reagent	Miltenyi Biotec	130–059-901
Leucosep	Greiner Bio-One	227290	described as "density gradient centrifugation tube"
MACS LS columns	Miltenyi Biotec	130-042-401	described as "magnetic column"
MACS BSA Stock Solution	Miltenyi Biotec	130-091-376	described as "bovine serum albumin (BSA) stock solution"
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303	described as "magnetic stand"
Penicillin-Streptomycin	Nacalai Tesque	26253–84
ProLong Gold Antifade Mountant	Invitrogen	P10144	described as "mounting media"
recombinant human GM-CSF	R&D Systems	215-GM
recombinant human IL-34	R&D Systems	5265-IL
RPMI 1640 Medium + GlutaMAX Supplement (pre-supplemented medium)	Thermo Fisher Scientific	61870036	described as "basal induction medium"
RPMI-1640	Nacalai Tesque	30264-56
Antibodies
anti-P2RY12 antibody	Sigma-Aldrich	HPA014518	primary antibody, rabbit, 1:100
anti-TMEM119 antibody	Sigma-Aldrich	HPA051870	primary antibody, rabbit, 1:100
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568	invitrogen	A-11011	secondary antibody, rabbit, 1:1000