Summary

Aislamiento de células madre mesenquimales derivadas del cordón umbilical con alto rendimiento y bajo daño

Published: July 05, 2024
doi:

Summary

Este estudio presenta un procedimiento único de disección roma para preservar la integridad de la jalea de Wharton (WJ), lo que resulta en WJ menos dañado y una mayor cantidad y viabilidad de las células madre mesenquimales (MSC) recolectadas. El método demuestra un rendimiento y una capacidad proliferativa superiores en comparación con los métodos convencionales de disección aguda.

Abstract

Las células madre mesenquimales (MSC) son una población de células multipotentes con notables propiedades regenerativas e inmunomoduladoras. La jalea de Wharton (WJ) del cordón umbilical (CU) ha ganado un interés creciente en el campo biomédico como una fuente excepcional de MSCs. Sin embargo, han surgido desafíos como la oferta limitada y la falta de estandarización de los métodos existentes. Este artículo presenta un método novedoso para mejorar el rendimiento de MSC mediante la disección de WJ intacta del cordón umbilical. El método emplea la disección roma para eliminar la capa epitelial, manteniendo la integridad de todo el WJ y dando como resultado una mayor cantidad y viabilidad de las MSC cosechadas. Este enfoque reduce significativamente el desperdicio de WJ en comparación con los métodos convencionales de disección aguda. Para garantizar la pureza de las WJ-MSC y minimizar la influencia celular externa, se llevó a cabo un procedimiento que utilizaba la tensión interna para despegar el endotelio después de voltear la CU. Además, la placa de Petri se invirtió durante un corto período de tiempo durante el cultivo del explante para mejorar la unión y el crecimiento de las células. El análisis comparativo demostró la superioridad del método propuesto, mostrando un mayor rendimiento de WJ y WJ-MSCs con mejor viabilidad que los métodos tradicionales. La morfología y el patrón de expresión similares de los marcadores de superficie celular en ambos métodos confirman su caracterización y pureza para diversas aplicaciones. Este método proporciona un enfoque de alto rendimiento y alta viabilidad para el aislamiento de WJ-MSC, demostrando un gran potencial para la aplicación clínica de MSCs.

Introduction

Desde el primer aislamiento de células madre mesenquimales (MSC) a partir de jalea de Wharton (WJ) en 1991, estas células madre multipotentes han atraído una gran atención por parte de los investigadores debido a sus propiedades regenerativas y su capacidad de diferenciación multilinaje1. Las MSC se pueden aislar de varias fuentes, como la médula ósea, la sangre periférica, la pulpa dental, el tejido adiposo, el feto (aborto humano) y los tejidos relacionados con el nacimiento2. El cordón umbilical (CU) se ha convertido en un reservorio prometedor debido a su naturaleza no invasiva, abundante rendimiento celular y capacidad de diferenciación, exhibiendo una alta tasa de proliferación, potencial de diferenciación y propiedades de modulación inmune3. Las MSC fetales exhiben fuertes propiedades madre e inmunológicas, lo que las convierte en el foco principal de los ensayos clínicos y la investigación básica realizada en las últimas dos décadas 2,4,5. Las MSC derivadas de la CU tienen un potencial terapéutico superior en comparación con otras fuentes de MSC, como la médula ósea o el tejido adiposo 6,7.

La CU está compuesta por epitelio amniótico, tres vasos (dos arterias y una vena) y la sustancia gelatinosa conocida como WJ3. Curiosamente, la CU constituye una vasculatura simple, que consta solo del endotelio y el mesotelio, pero no de la túnica adventicia; el WJ no contiene linfa ni nervios8. La UC presenta una estructura única ideal para la separación segmentaria. Las UC-MSC se encuentran principalmente en el WJ. Las MSC podrían aislarse de diferentes compartimentos del WJ, incluyendo el amnios, el subamnios (el amnios y el subamnios también designados como región de revestimiento del cordón) y el área perivascular del WJ8. Cada región del WJ tiene su propia estructura, características inmunohistoquímicas y función 3,6.

Las MSCs aisladas del WJ de la UC son ampliamente consideradas como de utilidad clínica superior en comparación con las de otras regiones3. Las WJ-MSC han sido ampliamente estudiadas en entornos preclínicos y clínicos para el tratamiento de diversas enfermedades debido a su potencial de diferenciación multilínea, propiedades inmunomoduladoras, efectos paracrinos, efectos antiinflamatorios y propiedades inmunoprivilegiadas 2,3. Se ha demostrado que las WJ-MSC son prometedoras en el tratamiento de una variedad de enfermedades, incluida la enfermedad de injerto contra huésped (EICH), el rechazo del injerto, la enfermedad de Crohn, las enfermedades autoinmunes y las enfermedades cardiovasculares 9,10,11,12,13,14. A medida que la demanda clínica de WJ-MSC continúa aumentando, la escasez de suministro de cordones umbilicales es actualmente un impedimento para sus aplicaciones generalizadas.

El rendimiento de las WJ-MSCs depende del método utilizado para la extracción celular15. Si bien las WJ-MSC se pueden aislar mediante cultivo de explantes o digestión enzimática, este último método tiene un tiempo de propagación más largo que puede aumentar el riesgo de daño celular y disminuir la viabilidad celular16. Sin embargo, numerosos estudios han demostrado que el método de cultivo de explantes aumenta el rendimiento y la viabilidad de las células, y que los factores paracrinos liberados de los tejidos de los explantes también ayudan a promover la proliferación celular17,18.

Este estudio aplicó un enfoque de disección único para obtener WJ completo, produciendo MSC con mayor capacidad proliferativa, viabilidad y cantidad, al tiempo que minimiza el daño a la WJ. Este método innovador ofrece una estrategia optimizada para aislar los WJ-MSC, abordando las necesidades críticas en las aplicaciones de MSC.

Protocol

Las muestras se obtuvieron de los donantes sanos y consentidos del Hospital de Atención Materna e Infantil del Distrito de Shenzhen Longgang, Guangdong, China. El uso de muestras humanas para el estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital de Shenzhen, la Universidad de Medicina China de Beijing (SZLDH2020LSYM-095) y el Comité de Ética Médica del Hospital de Atención Médica Infantil y de Maternidad del Distrito de Shenzhen Longgang (LGFYYXLLS-2020-005). Todos los experimentos se llevaron a cabo de acu…

Representative Results

En la Figura 1 se resumen los procedimientos de recolección y cultivo de UC-MSCs, así como su posterior análisis. La UC se diseccionó cuidadosamente en varias secciones utilizando el método único; el diagrama de operación específico de los procedimientos principales se ilustra en la Figura 2. El crecimiento de las células de los cultivos de explantes se monitoreó y registró de manera rutinaria. Se observaron células adherentes en forma de huso aproxi…

Discussion

Las MSC representan un área dinámica de investigación con profundas implicaciones para la medicina regenerativa22. Sus propiedades únicas los convierten en un punto focal para la investigación científica y tienen el potencial de revolucionar el tratamiento de una amplia gama de enfermedades y lesiones7. Las WJ-MSCs son un subconjunto distinto de las MSCs, que pueden obtenerse del tejido conectivo gelatinoso dentro de la CU situado entre el epitelio intervascular y amn…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo contó con el apoyo financiero de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82172107), la Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Guangdong, China (2021A1515011927, 2021A1515010918, 2020A1515110347), el Fondo de Investigación Médica de Shenzhen (SMRF. D2301015), el Comité Municipal de Innovación Científica y Tecnológica de Shenzhen (JCYJ20210324135014040, JCYJ20220530172807016, JCYJ20230807150908018, JCYJ20230807150915031) y el Fondo Especial para el Desarrollo Económico y Tecnológico del Distrito de Longgang (LGKCYLWS2022007).

Materials

APC anti-human CD44 Antibody  Biolegend  338806
24-well cell culture plates Thermo Scientific 142475
APC anti-human CD73 (Ecto-5'-nucleotidase) Antibody  Biolegend  344006
APC Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl (FC) Antibody Biolegend  400122
Autoclave HIRAYAMA HVE-50
Automatic Cell Counter Countstar FL-CD
BAMBANKER Cryopreservation Solution Wako 302-14681
Cell Staining Buffer Biolegend  420201
Centrifugal Machine Eppendorf 5424R
Clean Bench Shanghai ZhiCheng C1112B
CO2 Incubator Thermo Scientific HERAcell 150i
D-PBS Solarbio D1040
Electro- thermostatic Blast Oven Shanghai JingHong DHG-9423A
FITC anti-human CD105 Antibody  Biolegend  323204
FITC anti-human CD90 (Thy1) Antibody  Biolegend  328108
FITC Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl (FC) Antibody Biolegend  400110
Flow Cytometry Beckman CytoFLEX
hemocytometer Superior Marienfeld 640410
Intracellular Staining Permeabilization Wash Buffer (10×)  Biolegend  421002
Inverted Biological Microscope ZEISS Axio Vert. A1
Liquid Nitrogen Storage Tank Thermo Scientific CY50935-70
Normal saline (NS) Meilunbio MA0083
PBS Solarbio P1032
PE anti-human CD11b Antibody Biolegend  393112
PE anti-human CD19 Antibody  Biolegend  392506
PE anti-human CD34 Antibody Biolegend  343606
PE anti-human CD45 Antibody Biolegend  368510
PE anti-human HLA-DR Antibody  Biolegend  307606
PE Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl (FC) Antibody Biolegend  400114
PE Mouse IgG2a, κ Isotype Ctrl (FC) Antibody Biolegend  400214
Precision Electronic Balance Satorius PRACTUM313-1CN
Snowflake Ice Machine ZIEGRA ZBE 30-10
steriled 50 mL plastic tube Greniner 227270
Thermostatic Water Bath Shanghai YiHeng HWS12
Trypsin 1:250 Solarbio T8150
UltraGRO-Advanced Helios  HPCFDCGL50
Ultrapure and Pure Water Purification System Milli-Q Milli-Q Reference
Xeno-Free Human MSC Culture Medium FUKOKU  T2011301

References

  1. Abbaszadeh, H., et al. Regenerative potential of Wharton’s jelly-derived mesenchymal stem cells: A new horizon of stem cell therapy. J Cell Physiol. 235 (12), 9230-9240 (2020).
  2. Liau, L. L., Ruszymah, B. H. I., Ng, M. H., Law, J. X. Characteristics and clinical applications of Wharton’s jelly-derived mesenchymal stromal cells. Curr Res Transl Med. 68 (1), 5-16 (2020).
  3. Kim, D. -. W., et al. Wharton’s jelly-derived mesenchymal stem cells: Phenotypic characterization and optimizing their therapeutic potential for clinical applications. Int J Mol Sci. 14 (6), 11692-11712 (2013).
  4. Drobiova, H., et al. Wharton’s jelly mesenchymal stem cells: A concise review of their secretome and prospective clinical applications. Front Cell Dev Biol. 11, 1211217 (2023).
  5. Joerger-Messerli, M. S., et al. Mesenchymal stem cells from Wharton’s jelly and amniotic fluid. Best Pract Res Cl Ob. 31, 30-44 (2016).
  6. Pera, M., Subramanian, A., Fong, C. -. Y., Biswas, A., Bongso, A. Comparative characterization of cells from the various compartments of the human umbilical cord shows that the Wharton’s jelly compartment provides the best source of clinically utilizable mesenchymal stem cells. Plos One. 10 (6), 0127992 (2015).
  7. Petrenko, Y., et al. A comparative analysis of multipotent mesenchymal stromal cells derived from different sources, with a focus on neuroregenerative potential. Sci Rep. 10 (1), 4290 (2020).
  8. Davies, J. E., Walker, J. T., Keating, A. Concise review: Wharton’s jelly: The rich, but enigmatic, source of mesenchymal stromal cells. Stem Cells Transl Med. 6 (7), 1620-1630 (2017).
  9. Pan, Y., Wu, W., Jiang, X., Liu, Y. Mesenchymal stem cell-derived exosomes in cardiovascular and cerebrovascular diseases: From mechanisms to therapy. Biomed Pharmacother. 163, 114817 (2023).
  10. Elshaer, S. L., Bahram, S. H., Rajashekar, P., Gangaraju, R., El-Remessy, A. B. Modulation of mesenchymal stem cells for enhanced therapeutic utility in ischemic vascular diseases. Int J Mol Sci. 23 (1), 249 (2021).
  11. Wang, R., et al. Stem cell therapy for Crohn’s disease: Systematic review and meta-analysis of preclinical and clinical studies. Stem Cell Res Ther. 12 (1), 463 (2021).
  12. Shi, Y., et al. Immunoregulatory mechanisms of mesenchymal stem and stromal cells in inflammatory diseases. Nat Rev Nephrol. 14 (8), 493-507 (2018).
  13. Kassem, D. H., Kamal, M. M. Wharton’s jelly MSCs: Potential weapon to sharpen for our battle against DM. Trends Endocrinol Metab. 31 (4), 271-273 (2020).
  14. Saleh, M., Fotook Kiaei, S. Z., Kavianpour, M. Application of Wharton jelly-derived mesenchymal stem cells in patients with pulmonary fibrosis. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 71 (2022).
  15. Varaa, N., Azandeh, S., Khodabandeh, Z., Gharravi, A. M. Wharton’s jelly mesenchymal stem cell: Various protocols for isolation and differentiation of hepatocyte-like cells; narrative review. Iran J Med Sci. 44 (6), 437-448 (2019).
  16. Hassan, G., Kasem, I., Soukkarieh, C., Aljamali, M. A simple method to isolate and expand human umbilical cord derived mesenchymal stem cells: Using explant method and umbilical cord blood serum. Int J Stem Cells. 10 (2), 184-192 (2017).
  17. Naeem, A., et al. A comparison of isolation and culture protocols for human amniotic mesenchymal stem cells. Cell Cycle. 21 (15), 1543-1556 (2022).
  18. Yoon, J. H., et al. Comparison of explant-derived and enzymatic digestion-derived MSCs and the growth factors from Wharton’s jelly. Biomed Res Int. 2013, 428726 (2013).
  19. Reinisch, A., Strunk, D. Isolation and animal serum free expansion of human umbilical cord derived mesenchymal stromal cells (MSCs) and endothelial colony forming progenitor cells (CFCs). J Vis Exp. (32), e1525 (2009).
  20. Beeravolu, N., et al. Isolation and characterization of mesenchymal stromal cells from human umbilical cord and fetal placenta. J Vis Exp. (122), e55224 (2017).
  21. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  22. Samsonraj, R. M., et al. Concise review: Multifaceted characterization of human mesenchymal stem cells for use in regenerative medicine. Stem Cells Transl Med. 6 (12), 2173-2185 (2017).
  23. Sypecka, M., Bzinkowska, A., Sulejczak, D., Dabrowski, F., Sarnowska, A. Evaluation of the optimal manufacturing protocols and therapeutic properties of mesenchymal stem/stromal cells derived from Wharton’s jelly. Int J Mol Sci. 24 (1), 652 (2022).
  24. Binato, R., et al. Stability of human mesenchymal stem cells during in vitro culture: Considerations for cell therapy. Cell Prolif. 46 (1), 10-22 (2012).
  25. Mushahary, D., Spittler, A., Kasper, C., Weber, V., Charwat, V. Isolation, cultivation, and characterization of human mesenchymal stem cells. Cytometry A. 93 (1), 19-31 (2018).
  26. Hendijani, F. Explant culture: An advantageous method for isolation of mesenchymal stem cells from human tissues. Cell Prolif. 50 (2), 12334 (2017).

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Xu, M., Xu, J., Cheng, D., Chen, X., Lin, S., Si, X., Guo, F., Wu, D., Wu, F. Isolation of Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cells with High Yields and Low Damage. J. Vis. Exp. (209), e66835, doi:10.3791/66835 (2024).

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