Método basado en la extracción de apoplastos para mejorar la pureza de la proteína recombinante producida por plantas
Summary
La purificación de proteínas recombinantes de sistemas vegetales generalmente se ve desafiada por las proteínas vegetales. Este trabajo proporciona un método para extraer y purificar eficazmente una proteína recombinante secretada del apoplasto de Nicotiana benthamiana.
Abstract
Las plantas son un sistema de expresión eucariota en desarrollo reciente que se está explorando para producir proteínas terapéuticas. La purificación de proteínas recombinantes de plantas es uno de los pasos más críticos en el proceso de producción. Por lo general, las proteínas se purificaron a partir de proteínas solubles totales (TSP), y la presencia de proteínas intracelulares diversas y citocromos plantea desafíos para los pasos posteriores de purificación de proteínas. Además, la mayoría de las proteínas terapéuticas, como los antígenos y los anticuerpos, se secretan para obtener una glicosilación adecuada, y la presencia de proteínas modificadas incompletamente conduce a estructuras de antígenos o anticuerpos inconsistentes. Este trabajo introduce un método más eficaz para obtener proteínas recombinantes altamente purificadas a partir del espacio apoplástico de la planta. La proteína verde fluorescente recombinante (GFP) se diseña para ser secretada en el apoplasto de Nicotiana benthamiana y luego se extrae utilizando un método de infiltración-centrifugación. A continuación, el GFP-His del apoplasto extraído se purifica mediante cromatografía de afinidad de níquel. A diferencia de los métodos tradicionales de TSP, la purificación del apoplasto produce proteínas recombinantes altamente purificadas. Esto representa una importante mejora tecnológica para los sistemas de producción de las plantas.
Introduction
Hoy en día, se están estudiando varias proteínas terapéuticas recombinantes producidas por plantas, incluidos anticuerpos, vacunas, proteínas bioactivas, enzimas y pequeños polipéptidos 1,2,3,4,5,6. Las plantas se están convirtiendo en una plataforma cada vez más utilizada para la producción de proteínas terapéuticas debido a su seguridad, bajo costo y capacidad para escalar rápidamente la producción 7,8. La expresión y modificación de proteínas en los sistemas vegetales, junto con la purificación de proteínas, son factores críticos que determinan la productividad de los biorreactores vegetales 9,10. La mejora de la productividad de las plantas y la obtención de proteínas objetivo de alta pureza son los principales retos a los que se enfrentan los sistemas de producción basados en plantas11,12.
La localización subcelular y la modificación de las proteínas recombinantes dependen del péptido señal específico codificado en el extremo N-terminal, que dirige la proteína a su destino final del orgánulo durante la expresión génica. Las proteínas recombinantes están diseñadas para localizarse en el apoplasto, el retículo endoplásmico (RE), el cloroplasto, la vacuola o el citoplasma, en función de sus propiedades únicas13. Para los antígenos y anticuerpos, se prefieren las proteínas secretadas. Antes de la secreción, las proteínas progresan a través de RE y Golgi para un correcto plegamiento y modificaciones postraduccionales 14,15,16.
Después de la producción en plantas, las proteínas recombinantes deben purificarse a partir de extractos de plantas. Por lo general, las proteínas se purifican a partir de extractos de plantas solubles totales, que contienen abundantes proteínas intracelulares, productos mal plegados y no modificados, y citocromos17. Para eliminar las impurezas, los extractos de plantas se someten a un fraccionamiento extenso, que incluye cromatografía de afinidad específica de ribulosa-1,5-bisfosfato carboxilasa/oxigenasa (RuBisCO), precipitación de fitatos, precipitación de polietilenglicol y ajuste de temperatura y pH18,19. Estos pasos de eliminación de impurezas son laboriosos y pueden comprometer la calidad de la proteína.
El compartimento de la célula vegetal más allá de la membrana plasmática se define como el apoplasto, que abarca la pared celular, los espacios intercelulares y el xilema20. La fase acuosa se denomina comúnmente fluido de lavado apoplasto (AWF). AWF contiene moléculas secretadas por las células para regular numerosos avances biológicos como el transporte, el metabolismo de la pared celular y las respuestas al estrés21,22. A diferencia de TSP, los constituyentes moleculares de AWF son menos complejos. La extracción de proteínas recombinantes de AWF puede evitar la contaminación por proteínas intracelulares, productos mal plegados y restos citoplasmáticos. Brevemente, el lípido de extracción ingresa a las hojas a través de los estomas bajo presión negativa, y el AWF se recolecta por centrifugación suave23. Si bien el aislamiento de AWF se emplea ampliamente para estudiar el progreso biológico dentro del apoplasto 24,25,26,27, no se ha explotado en sistemas de producción basados en plantas.
La mejora de la productividad de las plantas y la obtención de proteínas objetivo de alta pureza son desafíos centrales para los sistemas de producción de plantas28. Por lo general, las proteínas se purifican a partir de extractos de plantas solubles totales que contienen grandes cantidades de proteínas intracelulares, productos mal plegados y no modificados, y citocromos29, que requieren grandes costos para su posterior purificación30. El uso de métodos de extracción de proteínas AWF para la extracción de proteínas recombinantes exógenas secretadas en apoplasto puede mejorar eficazmente la homogeneidad de las proteínas recombinantes y reducir el costo de la purificación de proteínas. Aquí, utilizamos un péptido señal PR1a para permitir la secreción de proteínas exógenas en el espacio apoplasto e introducimos un método detallado para la purificación de proteínas recombinantes a partir del AWF de N. benthamiana.
Protocol
Representative Results
Discussion
El uso de plantas para producir proteínas terapéuticas se ha expandido rápidamente en los últimos años 1,2,3,4,5,6. Los genes que codifican proteínas se clonan en vectores de expresión y se introducen en los tejidos de las plantas mediante agroinfiltración. Después de la producción por parte de las células vegetale…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo cuenta con el apoyo de la Asociación Juvenil de Promoción de la Innovación CAS (2021084) y el Fondo de Apoyo al Proyecto de Despliegue Clave del Plan de Acción Trienal del Instituto de Microbiología de la Academia China de Ciencias.
Materials
| 100 mesh nylon fine mesh yarn | Guangzhou Huayu Trading limited company | hy-230724-2 | For AWF protein extraction |
| 50 ml centrifuge tubes | Vazyme | TCF00150 | For centrifuge |
| ClonExpress II one step cloning kit | Vazyme | C112-02 | For clone |
| FastDigest Sac1 | NEB | R3156S | For clone |
| FastDigest XbaI | NEB | FD0685 | For clone |
| ImageJ 1.5.0 | / | / | For greyscale analysis |
| Large filter | Thermo Fisher | NEST | For filtering |
| Laser scanning confocal microscopy | Leica SP8 | For subcellular localization | |
| Ni sepharose excel | Cytiva | 10339806 | For protein purification |
| Precast protein plus gel | YEASEN | 36246ES10 | For SDS-PAGE |
| Small filter | Nalgene | 1660045 | For filtering |
| SuperSignal West Femto Substrate Trial Kit | Thermo Fisher | 34076 | For western blotting |
| Triton X-100 | SCR | 30188928 | To configure the extraction buffer |
| Type rotaryvang vacuum pump | Zhejiang taizhouqiujing vacuum pump limited company | 2XZ-2 | For vacuum infiltration |
| Vertical mixer | Haimen Qilinbel Instrument Manufacturing limited company | BE-1200 | For mixing |
| β-mercaptoethanol | SIGMA | BCBK8223V | To configure the extraction buffer |
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