Metoder til at studere mitokondriel bioenergetik under fysiologisk relevante substratkoncentrationer i immunceller er begrænsede. Vi leverer en detaljeret protokol, der bruger højopløsningsfluorespirometri til at vurdere ændringer i mitokondriemembranpotentialets respons på energibehov i humane T-celler, monocytter og perifere mononukleære celler.
Perifere mononukleære celler (PBMC’er) udviser robuste ændringer i mitokondriel respirationskapacitet som reaktion på sundhed og sygdom. Selvom disse ændringer ikke altid afspejler, hvad der sker i andre væv, såsom skeletmuskulatur, er disse celler en tilgængelig og værdifuld kilde til levedygtige mitokondrier fra mennesker. PBMC’er udsættes for systemiske signaler, der påvirker deres bioenergetiske tilstand. Udvidelse af vores værktøjer til at undersøge mitokondriel metabolisme i denne population vil således belyse mekanismer relateret til sygdomsprogression. Funktionelle analyser af mitokondrier er ofte begrænset til at bruge respiratoriske output efter maksimale substrat-, inhibitor- og uncoupler-koncentrationer for at bestemme hele spektret af respirationskapacitet, som muligvis ikke kan opnås in vivo. Omdannelsen af adenosindiphosphat (ADP) til adenosintrifosfat (ATP) ved hjælp af ATP-syntase resulterer i et fald i mitokondriemembranpotentialet (mMP) og en stigning i iltforbruget. For at give en mere integreret analyse af mitokondriedynamik beskriver denne artikel brugen af højopløsningsfluorespirometri til at måle den samtidige respons af iltforbrug og mitokondriemembranpotentiale (mMP) på fysiologisk relevante koncentrationer af ADP. Denne teknik bruger tetramethylrhodaminmethylester (TMRM) til at måle mMP-polarisering som reaktion på ADP-titreringer efter maksimal hyperpolarisering med komplekse I- og II-substrater. Denne teknik kan bruges til at kvantificere, hvordan ændringer i sundhedstilstand, såsom aldring og metabolisk sygdom, påvirker følsomheden af mitokondriel respons på energibehov i PBMC’er, T-celler og monocytter fra mennesker.
En celles evne til at fungere og overleve i en periode med fysiologisk stress er i høj grad afhængig af dens evne til at opfylde det energetiske behov for at genoprette homeostase 1,2. Energiefterspørgslen stiger som reaktion på en række forskellige stimuli. For eksempel øger øget muskelsammentrækning under træning udnyttelsen af ATP og glukose i skeletmuskulaturen, og en stigning i proteinsyntese efter infektion øger immuncellernes udnyttelse af ATP til cytokinproduktion og -spredning 3,4,5,6. En stigning i energiefterspørgslen udløser en række bioenergetiske processer for at genoprette ATP/ADP-forholdet. Når ATP indtages, stiger ADP-niveauerne og stimulerer F1F0 ATP-syntase (kompleks V), som kræver en protonaktiv kraft til at drive dens mekaniske rotation og katalytiske omdannelse af ADP til ATP i mitokondriet7. Protonkraften er en elektrokemisk gradient skabt ved pumpning af protoner under overførsel af elektroner fra substrater til ilt gennem elektrontransportsystemet (ETS) i den indre mitokondriemembran. Den resulterende forskel i protonkoncentration (delta pH) og elektrisk potentiale (membranpotentiale) skaber den protondrevne kraft, der driver ATP-syntese og iltforbrug som reaktion på energibehov, hvilket reducerer ATP/ADP-forholdet eller hæver ADP-niveauet. Mitokondriernes affinitet til ADP kan bestemmes ved beregning af Km eller EC50 for ADP-stimuleret respiration af isolerede mitokondrier eller permeabiliserede celler 8,9. Denne metode har vist, at permeabiliserede muskelfibre fra ældre mennesker kræver en større koncentration af ADP for at stimulere 50 % af deres maksimale oxidative fosforyleringskapacitet end hos yngre forsøgspersoner9. På samme måde kræver aldrende museskeletmuskulatur mere ADP for at sænke produktionen af mitokondrielle reaktive iltarter (ROS)10,11. Derudover reduceres ADP-følsomheden i permeabiliserede muskelfibre hos mus med diætinduceret fedme i forhold til kontroller og forbedres i nærvær af insulin og efter nitratforbrug 12,13. Mitokondriernes evne til at reagere på energibehovet varierer således under forskellige fysiologiske forhold, men dette er ikke tidligere blevet undersøgt i forbindelse med immunceller.
Perifere mononukleære blodceller (PBMC’er) bruges almindeligvis til at undersøge cellulær bioenergetik hos mennesker 14,15,16,17,18,19,20. Dette skyldes i høj grad, at celler let kan fås fra ukoagulerede blodprøver i kliniske undersøgelser, cellernes reaktionsevne på metaboliske forstyrrelser og de metoder, der er udviklet af forskellige grupper til at undersøge mitokondriemetabolisme ved hjælp af inhibitorer og afkoblinger til at bestemme den maksimale og minimale kapacitet af mitokondrieåndedræt 21,22. Disse metoder har ført til en forståelse af bioenergetiske stoffers rolle i aldring, metaboliske sygdomme og immunfunktion 14,20,23,24. Mitokondriel respirationskapacitet er ofte reduceret i skeletmuskulatur og PBMC’er under tilstande med hjertesvigt18,25. PBMC bioenergetik er også korreleret med kardiometaboliske risikofaktorer hos raske voksne17 og reagerer på behandlinger såsom nikotinamidribosid18. PBMC’er omfatter neutrofiler, lymfocytter (B-celler og T-celler), monocytter, naturlige dræberceller og dendritiske celler, som alle bidrager til PBMC-mitokondriekapacitet 26,27,28. Derudover spiller cellulær bioenergetik en afgørende rolle i immuncelleaktivering, proliferation og fornyelse23. En begrænsning ved disse metoder er imidlertid, at cellerne ikke fungerer under et fysiologisk udvalg af substrater. Der kræves derfor yderligere metoder til at undersøge mitokondriefunktion i substratkoncentrationer, der er mere relevante for, hvad celler oplever in vivo.
Mitokondriemembranpotentiale (mMP) er hovedkomponenten i en protonmotorisk kraft og er afgørende for en række mitokondrielle processer ud over ATP-produktion, såsom regulering af respiratorisk flux, produktion af reaktive iltarter, protein- og ionimport, autofagi og apoptose. mMP kan vurderes med elektrokemiske sonder eller fluorescerende farvestoffer, der er følsomme over for ændringer i membranpolarisering som JC-1, Rhod123, DiOC6, tetramethylrhodamin (TMRE) eller methylester (TMRM) og safranin. De to sidstnævnte er lipofile kationiske farvestoffer, der med succes er blevet brugt i højopløselig fluorespirometri af vævshomogenater, isolerede mitokondrier og permeabiliseret væv 11,29,30,31,32,33. I denne teknik bruges TMRM i quench-tilstand, hvor celler udsættes for en høj koncentration af TMRM, der akkumuleres i mitokondriematrixen, når den polariseres (høj mMP og protonmotorisk kraft), hvilket resulterer i slukning af cytosolisk TMRM-fluorescens. Når mitokondrier depolariseres som reaktion på ADP eller afkoblinger, frigives farvestoffet fra matrixen, hvilket øger TMRM-fluorescerende signal34,35. Formålet med denne metode er samtidig at måle ændringer i mitokondriel respiration og mMP som reaktion på ADP-titreringer i humant afledte PBMC’er, cirkulerende monocytter og T-celler, og den kan også anvendes på T-celler fra musemilt.
Denne protokol bruger højopløselig fluorespirometri til at måle følsomheden af mitokondrieresponsen på energibehov ved at måle spredningen af mMP som reaktion på stigende niveauer af ADP i PBMC’er, monocytter og T-celler. Dette gøres ved at tilføje komplekse I- og II-substrater for at maksimere mitokondriemembranpotentialet og titrere ADP for gradvist at stimulere ATP-syntase til at bruge protongradienten til ATP-generering.
Kritiske trin i protokollen omfatter indstilling af fluoroforens forstærkning og intensitet til 1000 og sikring af, at der opnås et TMRM-fluorescerende signal under TMRM-titreringen. Fordi TMRM-fluorescens falder efter hver titrering (en begrænsning ved denne metode), er det bydende nødvendigt at køre baggrundseksperimenter ved hjælp af blankprøver. Vi har også fundet, at DMSO har en hæmmende effekt på mitokondriel respiration og membranpotentiale og anbefaler derfor at fortynde arbejdsopløsningen af TMRM i Mir05 (supplerende figur 1).
Nogle ændringer, der kan bruges, når du prøver denne protokol, er justering af cellekoncentrationer og brug af standard 2 ml kammeret. Imidlertid foretrækkes 0,5 ml-kammeret til T-celler og monocytter på grund af den høje koncentration af celler, der er nødvendige for optimal respons i membranpotentiale og iltflux. En lavere koncentration af celler kan være optimal, når man tester celler med større respirationskapacitet, som makrofager.
Yderligere begrænsninger ved den metode, der præsenteres her, inkluderer kravet om mindst 5 millioner T-celler og 2,5 millioner monocytter. Vi kan ofte få nok celler fra ~20 ml blod fra raske deltagere, men disse tal kan variere efter helbredstilstand, alder og køn26. Derudover, som i de fleste metoder, der vurderer mitokondriekapacitet, skal cellerne være friskisolerede. Denne metode kan dog afprøves i kryokonserverede celler i fremtiden. I sammenligning med udbyttet fra menneskeligt blod er T-celleudbyttet fra milten hos raske mus højt nok til at udføre denne analyse.
Cirkulerende T-celler, især langlivet hukommelse(TM) og regulatoriske (Treg) celler, er afhængige af oxidativ fosforylering til energi37. Mens deres energibehov og iltforbrug er lavt (f.eks. sammenlignet med hvilemuskler), er deres overlevelse afgørende for et effektivt immunrespons på reinfektion og kræft 38,39,40. En reduktion i T-celle oxidativ phosphorylering resulterer i nedsat proliferativ kapacitet og fremmer T-celleudmattelse og aldring 5,41. Derudover fremmer mitokondriel hyperpolarisering en vedvarende produktion af cytokiner (IL-4 og IL-21) af effektor CD4 T-celler under aktivering42. Ved infektion kan energibehovet til aktivering og spredning af immunceller være så højt som 25%-30% af den basale stofskiftehastighed43. Derfor fungerer immunceller i et bredt og ekstremt område af energibehov, og denne protokol kan teste mitokondrieresponser inden for dette område.
Kronisk betændelse er et almindeligt træk ved fedme, diabetes og aldring. Dysregulerede niveauer af cirkulerende hormoner, lipider og glukose har systemiske virkninger og kan således påvirke, hvordan mitokondrier reagerer på en energisk udfordring. Her har vi præsenteret en metode til at vurdere mitokondriel ADP-følsomhed i cirkulerende PBMC’er. Yderligere undersøgelser er nødvendige for at bestemme, hvordan ADP-følsomhed kan moduleres ved metabolisk sygdom, og hvordan det påvirker sundhedstilstanden.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke de venlige frivillige, der donerede blod til dette projekt. Vi udtrykker også vores oprigtige taknemmelighed til Dr. Ellen Schur og hendes team for at give os yderligere prøver fra deres undersøgelse. Vi vil også gerne takke Andrew Kirsh for at gennemgå manuskriptet og redigere det for læsbarhed. Dette arbejde blev støttet af følgende finansieringskilder: P01AG001751, R01AG078279, P30AR074990, P30DK035816, P30DK017047, R01DK089036, K01HL154761 T32AG066574.
Adenosine Diphosphate | Sigma-Aldrich | A5285 | Fluorespirometry |
Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | Fluorespirometry |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A6003 | Mir05 buffer |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A6003 | Cell isolation |
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone | Sigma-Aldrich | C2920 | Fluorespirometry |
Cell strainers | Fisher Scientific | 22-363-548 | Isolation of T-cells from mouse spleen protocol |
CD14 Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | Cell isolation |
CD3 Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-050-101 | Cell isolation |
DatLab | Oroboros | Version 8 | |
Digitonin | Sigma-Aldrich | D141 | Fluorespirometry |
D-Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | Mir05 buffer |
Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E4378 | Mir05 buffer |
Filter Set AmR | Oroboros | 44321-01 | |
HBSS (10x) | Gibco | 12060-040 | |
HEPES sodium salt | Sigma-Aldrich | H7523 | Mir05 buffer |
Histopaque 1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | Cell isolation |
K2EDTA blood collection tubes | BD Vacutainer | 366643 | Cell isolation |
Lactobionic acid | Sigma-Aldrich | 153516 | Mir05 buffer |
L-Glutamic acid | Sigma-Aldrich | G1626 | Fluorespirometry |
L-Malic Acid | Sigma-Aldrich | M1000 | Fluorespirometry |
LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Cell isolation |
Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M9272 | Mir05 buffer |
Multi-MACS stand and MidiMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-301 | Cell isolation |
O2k-Fluo Smart-Module | Oroboros | 12100-03 | |
O2k-FluoRespirometer series J | Oroboros | 10201-03 | |
O2k-sV-Module (0.5 chamber) | Oroboros | 11200-01 | |
Oligomycin | Sigma-Aldrich | 04876 | Fluorespirometry |
Pan T Cell Isolation Kit II, mouse | Miltenyi | 130095130 | Isolation of T-cells from mouse spleen protocol |
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P0662 | Mir05 buffer |
Potassium Hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | 221473 | Mir05 buffer |
Prism | GraphPad | Version 10 | |
Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | Fluorespirometry |
RPMI Buffer | Corning | 17-105-CV | Cell isolation |
Sodium Pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | Fluorespirometry |
Succinate disodium salt | Sigma-Aldrich | S2378 | Fluorespirometry |
Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | Mir05 buffer |
Tetramethyrhodamine methyl ester perchlorite | Sigma-Aldrich | T5428 | Fluorespirometry |