Dimostrazione del trasporto di membrana dell'istidina utilizzando sacche intestinali invertite di capra: uno strumento pedagogico esperienziale per studenti universitari
Summary
Qui, riportiamo un metodo economico e riproducibile che dimostra il trasporto di membrana dell’istidina nell’intestino di una capra. Questo processo avviene attraverso il co-trasporto di istidina e ioni sodio abilitati dal gradiente di sodio attraverso la membrana degli enterociti. Questo metodo sfrutta la pedagogia dell’apprendimento esperienziale per comprendere meglio il movimento dei soluti attraverso le membrane biologiche.
Abstract
L’istidina è un aminoacido essenziale che è anche un precursore dei metaboliti implicati nel sistema immunitario, nella ventilazione polmonare e nella circolazione vascolare. L’assorbimento dell’istidina alimentare si basa in gran parte sul trasporto di aminoacidi neutri accoppiati al sodio da parte del trasportatore di aminoacidi neutri Broad (B0AT) presente sulla membrana apicale dell’enterocita. Qui, dimostriamo l’assorbimento dell’istidina da parte degli enterociti dei villi intestinali dal lume utilizzando le sacche invertite digiunali di capra. Le sacche digiunali esposte a concentrazioni variabili di sodio e istidina sono state analizzate per determinare la concentrazione di istidina all’interno delle sacche in funzione del tempo. I risultati mostrano un assorbimento attivo dell’istidina. L’aumento della concentrazione di sale ha comportato un maggiore assorbimento dell’istidina, suggerendo un simportone dell’assorbimento di sodio e istidina nelle sacche intestinali invertite di capra. Questo protocollo può essere applicato per visualizzare la mobilità intestinale di aminoacidi o altri metaboliti con le opportune modifiche. Proponiamo questo esperimento come strumento pedagogico esperienziale che può aiutare gli studenti universitari a comprendere il concetto di trasporto a membrana.
Introduction
Le cellule biologiche sono circondate da un doppio strato lipidico di membrana che separa il citosol intracellulare dal contenuto extracellulare. La membrana funge da barriera semipermeabile che regola il movimento dei soluti1. Il trasporto attraverso le membrane biologiche è influenzato dal coefficiente di permeabilità di un soluto, che dipende da diversi fattori, tra cui la concentrazione e la carica del soluto. In generale, i soluti si muovono attraverso la membrana utilizzando tre meccanismi (Figura 1): diffusione passiva, diffusione facilitata e trasporto attivo2. La diffusione semplice è il processo mediante il quale soluti solubili, non caricati e non polari passano lungo il loro gradiente di concentrazione attraverso una membrana semipermeabile (Figura 1A). Le proteine di membrana non aiutano in questo processo poiché comporta il movimento dei soluti da una regione di concentrazione più alta a una regione di concentrazione più bassa. Il tasso di diffusione si basa sulla legge di Fick3. D’altra parte, la diffusione facilitata è un trasporto proteino-dipendente in cui la membrana consente solo ai soluti selettivi di passare lungo un gradiente di concentrazione senza il dispendio di energia (Figura 1B). Questo tipo di trasporto è specifico e differisce dalla semplice diffusione nell’esibire una cinetica di saturazione.
Il trasporto attivo è un trasporto proteino-dipendente di molecole rispetto al loro gradiente di concentrazione, cioè dalla regione di concentrazione più bassa a una regione di concentrazione più alta con l’uso di gradienti di ATP o ioni (Figura 1C). Quando il trasportatore idrolizza l’ATP, il trasporto è definito trasporto attivo primario (Figura 1C; pannello di sinistra). Un’altra forma di trasporto attivo è il trasporto attivo secondario (Figura 1C; pannello di destra). Nel trasporto attivo secondario, i soluti vengono spostati in base a un gradiente elettrochimico. Si verifica quando una proteina trasportatrice accoppia il movimento di uno ione (tipicamente Na+) lungo il suo gradiente di concentrazione con il movimento di un’altra molecola o di uno ione contro il suo gradiente di concentrazione. Questo tipo di movimento del soluto può essere un co-trasporto (Symport) in cui sia il soluto che lo ione si muovono nella stessa direzione o uno scambio (Antiport), nel qual caso il soluto e lo ione si muovono in direzioni opposte.
Gli aminoacidi alimentari e i monosaccaridi provenienti da fonti alimentari vengono assorbiti nell’intestino tenue. L’intestino tenue può essere diviso funzionalmente in tre segmenti: duodeno, digiuno e ileo (Figura 2). L’assorbimento del soluto avviene in tutto l’intestino tenue, con il massimo assorbimento che si verifica al digiuno e all’estremità prossimale dell’ileo. Gli enterociti intestinali sono cellule polarizzate e le giunzioni strette che collegano due cellule adiacenti creano due siti di membrana distinti: il sito della membrana basolaterale e quello apicale (Figura 2). L’assorbimento dei soluti luminali generati dalla digestione avviene sul sito4 della membrana apicale.
Il trasporto dell’istidina negli enterociti intestinali alla membrana apicale è un esempio di un simporto attivo secondario che è sodio-dipendente. All’estremità basolaterale, l’istidina che entra nell’enterocita si sposta lungo il gradiente di concentrazione nella circolazione portale epatica. Le concentrazioni intracellulari di sodio all’interno dell’enterocita sono mantenute a 12 mmoli/L1, che è inferiore alle concentrazioni extracellulari/luminali, a causa del pompaggio attivo di sodio fuori dalla cellula da parte della Na+ K+ATPasi situata sulla membrana basolaterale (Figura 3). A livello della membrana apicale degli enterociti, l’AT B0e il trasportatore di amminoacidi neutri di sodio (SNAT) 5 sono i principali trasportatori che trasportano non solo l’istidina ma anche gli aminoacidi come l’asparagina e la glutammina in un cotrasporto sodio-dipendente 5,6. Un’altra proteina di trasporto chiamata Large Amino Acid Transporter (LAT)1 presente sulla membrana basolaterale degli enterociti trasporta grandi amminoacidi neutri come leucina, triptofano, tirosina e fenilalanina attraverso la membrana7.
Con l’obiettivo di insegnare il concetto di trasporto a membrana integrato con tecniche come la spettrofotometria e i saggi biochimici di routine attraverso la pedagogia dell’apprendimento esperienziale, è imperativo sviluppare metodologie che possano non solo dimostrare il concetto in termini di facile comprensione, ma anche consentire l’apprendimento partecipativo per gli studenti universitari. Attualmente, ci sono risorse limitate a disposizione degli studenti per l’impegno pratico nell’apprendimento di tali concetti di biochimica. Qui, riportiamo un semplice protocollo per dimostrare il trasporto dell’istidina attraverso la membrana intestinale della capra che è facile da riprodurre nei laboratori universitari e può essere adattato per valutare il trasporto anche di altri metaboliti. Ancora più importante, il metodo utilizza materiali poco costosi in un laboratorio universitario, consentendo così l’apprendimento esperienziale anche nel più semplice dei laboratori.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il trasporto a membrana è uno dei concetti fondamentali insegnati agli studenti universitari di tutte le principali discipline delle scienze biologiche, di base o applicate. Tradizionalmente, il movimento attraverso le membrane è stato visualizzato utilizzando metaboliti marcati con isotopi radioattivi. Tuttavia, questi metodi sono estremamente pericolosi e non fattibili per l’insegnamento o l’apprendimento. Sebbene l’apprendimento esperienziale sia la migliore tecnica pedagogica per c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato supportato dal Dipartimento di Biochimica, Sri Venkateswara College, Università di Delhi. Gli autori ringraziano il personale del laboratorio per il loro supporto.
Materials
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | TARSONS | 500020 | |
| 10 mL Test Tubes | BOROSIL | 9800U04 | |
| 50 mL Sterile Falcon Tubes | TARSONS | 546041 | |
| 500 mL Beaker | BOROSIL | 10044977 | |
| 500 mL Conical Flask | BOROSIL | 691467 | |
| D-Glucose | SRL | 42738 | |
| Digital Spectrophotometer | SYSTRONICS | 2710 | |
| Ethanol | EMSURE | 1009831000 | |
| Finpipettes | THERMOFISHER | 4642090 | |
| Glass Stirrer Rod | BOROSIL | 9850107 | |
| L-Histidine | SRL | 17849 | |
| NaCl | SRL | 41721 | |
| Nitrile Gloves | KIMTECH | 112-4847 | |
| Petri Dish | TARSONS | 460090 | |
| Phosphate Buffered Saline (ph 7.4) | SRL | 95131 | |
| Pipette Tips | ABDOS | P10102 | |
| Sodium Carbonate | SRL | 89382 | |
| Sodium Nitrate | SRL | 44618 | |
| Sodium Phosphate Dibasic (anhydrous) | SRL | 53046 | |
| Sodium Phosphate Monobasic (anhydrous) | SRL | 22249 | |
| Sulphanilic Acid | SRL | 15354 |
References
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