Summary

Profilering av luminal pH i tredimensjonale gastrointestinale organoider ved hjelp av mikroelektroder

Published: July 05, 2024
doi:

Summary

Denne protokollen beskriver pH-målinger i humane vevsavledede gastriske organoider ved bruk av mikroelektroder for spatiotemporal karakterisering av intraluminal fysiologi.

Abstract

Optimalisering og detaljert karakterisering av gastrointestinale organoidmodeller krever avanserte metoder for å analysere deres luminale miljøer. Denne artikkelen presenterer en svært reproduserbar metode for presis måling av pH i lumina til 3D-humane gastriske organoider via mikromanipulatorkontrollerte mikroelektroder. pH-mikroelektrodene er kommersielt tilgjengelige og består av skrå glassspisser med en diameter på 25 μm. For målinger føres pH-mikroelektroden inn i lumen til en organoid (>200 μm) som er suspendert i Matrigel, mens en referanseelektrode hviler nedsenket i det omkringliggende mediet i kulturplaten.

Ved å bruke slike mikroelektroder for å profilere organoider avledet fra den menneskelige magekroppen, demonstrerer vi at luminal pH er relativt konsistent i hver kulturbrønn ved ~7,7 ± 0,037 og at kontinuerlige målinger kan oppnås i minimum 15 minutter. I noen større organoider avslørte målingene en pH-gradient mellom epiteloverflaten og lumen, noe som tyder på at pH-målinger i organoider kan oppnås med høy romlig oppløsning. I en tidligere studie ble mikroelektroder brukt til å måle luminale oksygenkonsentrasjoner i organoider, noe som demonstrerte allsidigheten til denne metoden for organoidanalyser. Oppsummert beskriver denne protokollen et viktig verktøy for funksjonell karakterisering av det komplekse luminale rommet i 3D-organoider.

Introduction

Organoider – miniatyr flercellede strukturer avledet fra stamceller – har revolusjonert vår evne til å studere menneskelig fysiologi og begynner å erstatte dyremodeller, selv i regulatoriske omgivelser1. Siden den første beskrivelsen av tarmorganoider av Sato et al. i 2009, har organoidteknologi blitt enormt populær2. Et stort antall studier har karakterisert den cellulære sammensetningen og funksjonen til organoidmodeller i detalj 3,4,5,6. Imidlertid forblir det lysende rommet til disse 3D flercellede strukturene stort sett udefinert 7,8. Lumen er det sentrale hulrommet i organoider avledet fra slimhinnevev som er omgitt av de apikale delene av polariserte epitelceller. Siden cellulær sekresjon og absorpsjon hovedsakelig forekommer ved den apikale epiteloverflaten, styres det luminale mikromiljøet til organoider av disse viktige fysiologiske prosessene. For tiden brukte organoidmodeller viser variasjoner i cellesignalmønstre, generell stamhet, metabolittkonsentrasjonsgradienter og miljøforhold9. Å forstå organoid luminal fysiologi er derfor nødvendig for nøyaktig modellering av organfunksjon og patologi. Dessverre hindrer den relative utilgjengeligheten av lumen betydelig funksjonelle analyser av luminal fysiologi i 3D-organoider10.

Evnen til å undersøke pH-profiler er spesielt viktig i magen, som er beryktet for å ha den bratteste protongradienten i kroppen, fra omtrent 1-3 i lumen, til nesten nøytral ved epitelet 11,12,13. Det er fortsatt et betydelig gap i vår forståelse av mikroskala vedlikehold av gastrisk pH-gradient, og relevansen av organoidmodeller for å rekapitulere dette dynamiske miljøet over mageslimlaget. Tradisjonelle tilnærminger for analyse av organoid pH har involvert bruk av pH-følsomme fargestoffer, som kan være fluorescerende eller kolorimetriske indikatorer. McCracken et al. brukte en luminal injeksjon av SNARF-5F-a ratiometrisk pH-indikator i organoider for å analysere et fall i luminal pH som respons på histaminbehandling. Slike fargestoffer kan inkorporeres i kulturmediet, noe som muliggjør sanntids, ikke-invasiv overvåking av pH. Ikke bare krever pH-følsomme fargestoffer komplekse kalibreringstrinn som bidrar til dårlig pålitelighet og nøyaktighet med målinger, men slike fargestoffer har også en tendens til å operere innenfor spesifikke deteksjonsområder som kanskje ikke er representative for hele pH-området i mikromiljøet av interesse14,15. Det kan imidlertid anses som rimelig å bruke indikatorfargestoffer til bekreftende eksperimenter. Optiske nanosensorer som bruker fluorescerende optodebaserte, pH-sensing tilnærminger er også utviklet; Imidlertid krever slike sensorteknikker mikroskopisk avbildning og er også utsatt for fotobleking, fototoksisitet, samt bildeskjevhet16,17. I tillegg har Brooks et al. 3D-printede multiwell-plater som inneholder mikroelektroder på toppen av hvilke organoider kan belegges18. Denne tilnærmingen tillater imidlertid ikke målinger direkte inne i organoidlumen.

Elektrodebaserte pH-målinger kan oppnå forbedret nøyaktighet sammenlignet med andre metoder, samt gi pH-overvåking i sanntid. I tillegg gir pH-elektroder montert på mikromanipulatorer overlegen romlig oppløsning av pH-målinger, ettersom den nøyaktige plasseringen av elektrodespissen kan kontrolleres fint. Dette muliggjør høyest mulig fleksibilitet og reproduserbarhet i analysene av organoidmodeller. Elektrodene som brukes her er miniatyriserte pH-mikroelektroder som fungerer basert på diffusjon av protoner gjennom selektivt pH-glass som omgir en tynn platinatråd. Mikroelektroden kobles til en ekstern Ag-AgCl-referanseelektrode og kobles deretter til en millivoltmeter med høy impedans. Det elektriske potensialet mellom de to elektrodespissene når de er nedsenket i samme løsning vil reflektere pH i løsningen19. Slike mikroprofileringssystemer har blitt brukt i metabolsk analyse av biofilmer20,21, planktonalger22, humane sputumprøver23, og til og med i mesenkymale stamcellesfæroider24. Både laboratoriet vårt og Murphy et al. har tidligere brukt mikromanipulatorkontrollerte O 2-mikroelektroder for å evaluere oksygenkonsentrasjonene i luminalrommene til organoider. Murphy et al. paret denne metoden med matematisk modellering for å avsløre en oksygengradient i sfæroidene deres. Vår gruppe var i stand til å finne reduserte luminale oksygennivåer i vevsavledede gastriske organoider sammenlignet med den omkringliggende ekstracellulære matrisen25.

Her gir vi en detaljert metode for manuell mikroelektrodeprofilering av luminal pH i sfæriske gastrointestinale organoider som vil muliggjøre forbedret fysiologisk forståelse av deres komplekse luminale mikromiljø. Vi forventer at denne teknikken vil legge til en ny dimensjon til utforskningen av organoidfysiologi gjennom sanntids, høyoppløselige målinger av pH-nivåer på mikroskala. Videre kan følgende protokoll enkelt tilpasses for analyse av O2, N2O, H2, NO, H2S, redoks og temperatur i ulike typer organoidmodeller. Fysiologisk profilering fungerer som et verdifullt verktøy for å optimalisere organoidkulturforhold for bedre å etterligne in vivo-miljøer , og dermed øke relevansen og nytten av organoidmodeller i biomedisinsk forskning.

Protocol

Denne protokollen krever 3D-organoider på minst 200 μm i diameter som har et distinkt lumen og som er innebygd i en kunstig ekstracellulær matrise (ECM, f.eks. Humant magevev for organoidavledning ble innhentet med godkjenning fra Institutional Review Board ved Montana State University og informert samtykke fra pasienter som gjennomgår øvre endoskopi ved Bozeman Health (protokoll # 2023-48-FCR, til DB) eller som unntatt gastrektomiprøver fra hele magen eller ermet fra National Disease Research Interchange (protokol…

Representative Results

Utskillelse av syre er en avgjørende funksjon i den menneskelige magen. I hvilken grad syresekresjon kan modelleres i organoider er imidlertid fortsatt et spørsmål om debatt 6,32,33,34. Vi utviklet derfor protokollen beskrevet ovenfor for nøyaktig å måle syreproduksjonen i gastriske organoider. Spesielt brukte vi ustimulerte voksne stamcelleavledede organoider dyrket under standard ekspan…

Discussion

Begrenset tilgang til det luminale rommet til organoider har sterkt begrenset vår forståelse av den fysiologiske dynamikken i dette mikromiljøet. Et pålitelig verktøy for funksjonelle analyser av luminal fysiologi vil utvide vår evne til å utnytte organoider som in vitro-modeller for fysiologi, farmakologi og sykdomsforskning. Organoider er svært avstembare, fysiologisk relevante modeller med ekstra potensial til å replikere genetisk variasjon i den menneskelige populasjonen. Eksisterende metoder for pH…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Forfatterne vil gjerne anerkjenne Dr. Ellen Lauchnor, Dr. Phil Stewart og Bengisu Kilic for deres tidligere arbeid og assistanse med O 2-mikrosensorene; Andy Sebrell for opplæring i organoidkultur og mikromanipulasjon; Lexi Burcham for hjelp til organoidkultur, medieforberedelse, dataregistrering og organisering; og Dr. Susy Kohout for generelle råd innen elektrofysiologi. Vi vil gjerne takke Dr. Heidi Smith for hennes hjelp med bildebehandling og anerkjenne Center for Biofilm Engineering Bioimaging Facility ved Montana State University, som støttes av midler fra National Science Foundation MRI Program (2018562), M.J. Murdock Charitable Trust (202016116), US Department of Defense (77369LSRIP & W911NF1910288), og av Montana Nanotechnology Facility (et NNCI-medlem støttet av NSF Grant ECCS-2025391).

Spesiell takk til hele Unisense-teamet som gjorde dette arbeidet mulig, spesielt Dr. Andrew Cerskus, Dr. Laura Woods, Dr. Lars Larsen, Dr. Tage Dalsgaard, Dr. Line Daugaard, Dr. Karen Maegaard og Mette Gammelgaard. Finansiering av studien vår ble gitt av National Institutes of Health-tilskuddene R01 GM13140801 (DB, RB) og UL1 TR002319 (KNL), og en Research Expansion Award fra Montana State University Office for Research and Economic Development (DB). Figur 1A ble laget med BioRender.

Materials

3 M KCl Unisense
5 mL Wobble-not Serological Pipet, Individually Wrapped, Paper/Plastic, Bag, Sterile CellTreat 229091B
10 mL Wobble-not Serological Pipet, Individually Wrapped, Paper/Plastic, Bag, Sterile CellTreat 229092B
15 mL Centrifuge Tube – Foam Rack, Sterile CellTreat 229412
24 Well Tissue Culture Plate, Sterile CellTreat 229124
25 mL Wobble-not Serological Pipet, Individually Wrapped, Paper/Plastic, Bag, Sterile CellTreat 229093B
35 mm Dish | No. 1.5 Coverslip | 20 mm Glass Diameter | Uncoated MatTek P35G-1.5-20-C
50 mL Centrifuge Tube – Foam Rack, Sterile CellTreat 229422
70% Ethanol BP82031GAL BP82031GAL
70 μm Cell Strainer, Individually Wrapped, Sterile CellTreat 229483 
1,000 µL Extended Length Low Retention Pipette Tips, Racked, Sterile CellTreat 229037
Amphotericin B (Fungizone) Solution HyClone Laboratories, Inc SV30078.01
Biosafety Cabinet Nuaire  NU-425-600 Class II Type A/B3
Bovine Serum Albumin Fisher Bioreagents BP1605-100
Cell recovery solution Corning 354253 Cell dissociation solution
DMEM/F-12 (Advanced DMEM) Gibco 12-491-015
Dulbecco's Modification of Eagles Medium (DMEM) Fisher Scientific 15017CV
Fetal Bovine Serum HyClone Laboratories, Inc SH30088
G418 Sulfate Corning 30-234-CR
Gentamycin sulfate IBI Scientific IB02030
HEPES, Free Acid Cytiva SH30237.01
HP Pavillion 2-in-1 14" Laptop Intel Core i3 HP M03840-001
Hydrochloric acid Fisher Scientific A144C-212
Incubator Fisher Scientific 11676604
iPhone 12 camera Apple
L-glutamine Cytiva SH3003401
Large Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply Fisher Scientific 34133
M 205 FA Stereomicroscope Leica
Matrigel Membrane Matrix 354234 Corning CB-40234
MC-1 UniMotor Controller Unisense
Methyl red
MM33 Micromanipulator Marzhauser Wetzlar 61-42-113-0000 Right handed
MS-15 Motorized Stage Unisense
Nanoject-II Drummond 3-000-204 nanoliter autoinjector
Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco 15-140-148
pH Microelectrodes Unisense 50-109158, 25-203452, 25-205272, 25-111626, 25-109160 SensorTrace software is not compatible with Apple computers
Reference Electrode Unisense REF-RM-001652 SensorTrace software is not compatible with Apple computers
SB 431542 Tocris Bioscience 16-141-0
Smartphone Camera Adapter Gosky
Specifications Laboratory Stand LS Unisense LS-009238
Trypsin-EDTA 0.025%, phenol red Gibco 25-200-056
UniAmp Unisense 11632
United Biosystems Inc MINI CELL SCRAPERS 200/PK Fisher MCS-200
Y-27632 dihydrochloride Tocris Bioscience 12-541-0
µSensor Calibration Kit Unisense/ Mettler Toledo 51-305-070, 51-302-069 pH 4.01 and 9.21, 20 mL packets

References

  1. Zhang, N., et al. Tissue spatial omics dissects organoid biomimicry. GEN Biotechnology. 2 (5), 372-383 (2023).
  2. Sato, T., et al. Single lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  3. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  4. Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease modeling in stem cell-derived 3d organoid systems. Trends Mol Med. 23 (5), 393-410 (2017).
  5. Achberger, K., et al. Merging organoid and organ-on-a-chip technology to generate complex multi-layer tissue models in a human retina-on-a-chip platform. Elife. 8, e46188 (2019).
  6. Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).
  7. Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nat Cell Biol. 18 (3), 246-254 (2016).
  8. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  9. Davies, J. A., Davies, J. A., Lawrence, M. L. . Organoids and Mini-organs. , 3-40 (2018).
  10. Ambrosini, Y. M., et al. Recapitulation of the accessible interface of biopsy-derived canine intestinal organoids to study epithelial-luminal interactions. PLoS One. 15 (4), e0231423 (2020).
  11. Williams, S. E., Turnberg, L. A. Demonstration of a pH gradient across mucus adherent to rabbit gastric mucosa: Evidence for a ‘mucus-bicarbonate’ barrier. Gut. 22 (2), 94-96 (1981).
  12. Schubert, M. L. Gastric secretion. Curr Opin Gastroenterol. 20 (6), 519-525 (2004).
  13. Celli, J. P., et al. Rheology of gastric mucin exhibits a pH-dependent sol−gel transition. Biomacromolecules. 8 (5), 1580-1586 (2007).
  14. Takeshita, Y., et al. Assessment of pH-dependent errors in spectrophotometric pH measurements of seawater. Marine Chemistry. 223, 103801 (2020).
  15. Mccracken, K. W., et al. Wnt/β-catenin promotes gastric fundus specification in mice and humans. Nature. 541 (7636), 182-187 (2017).
  16. Larsen, M., Borisov, S. M., Grunwald, B., Klimant, I., Glud, R. N. A simple and inexpensive high resolution color ratiometric planar optode imaging approach: Application to oxygen and ph sensing. Limnology and Oceanography: Methods. 9 (9), 348-360 (2011).
  17. Jewell, M. P., Galyean, A. A., Kirk Harris, J., Zemanick, E. T., Cash, K. J. Luminescent nanosensors for ratiometric monitoring of three-dimensional oxygen gradients in laboratory and clinical pseudomonas aeruginosa biofilms. Appl Environ Microbiol. 85 (20), e01116-e01119 (2019).
  18. Brooks, E. L., Hussain, K. K., Kotecha, K., Abdalla, A., Patel, B. A. Three-dimensional-printed electrochemical multiwell plates for monitoring food intolerance from intestinal organoids. ACS Sens. 8 (2), 712-720 (2023).
  19. pH and reference electrode manual. Unisense Available from: https://unisense.com/wp-content/uploads/2023/05/2023.05-pH-and-ref-sensor-manual.pdf (2023)
  20. Villahermosa, D., Corzo, A., Garcia-Robledo, E., Gonzalez, J. M., Papaspyrou, S. Kinetics of indigenous nitrate reducing sulfide oxidizing activity in microaerophilic wastewater biofilms. PLoS One. 11 (2), 0149096 (2016).
  21. Pabst, B., Pitts, B., Lauchnor, E., Stewart, P. S. Gel-entrapped staphylococcus aureus bacteria as models of biofilm infection exhibit growth in dense aggregates, oxygen limitation, antibiotic tolerance, and heterogeneous gene expression. Antimicrob Agents Chemother. 60 (10), 6294-6301 (2016).
  22. Ploug, H., Stolte, W., Epping, E. H. G., Jørgensen, B. B. Diffusive boundary layers, photosynthesis, and respiration of the colony-forming plankton algae, phaeocystis sp. Limnology and Oceanography. 44 (8), 1949-1958 (1999).
  23. Kolpen, M., et al. Nitrous oxide production in sputum from cystic fibrosis patients with chronic pseudomonas aeruginosa lung infection. PLoS One. 9 (1), 84353 (2014).
  24. Murphy, K. C., et al. Measurement of oxygen tension within mesenchymal stem cell spheroids. J R Soc Interface. 14 (127), 20160851 (2017).
  25. Sebrell, T. A., et al. A novel gastric spheroid co-culture model reveals chemokine-dependent recruitment of human dendritic cells to the gastric epithelium. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 8 (1), 157-171 (2019).
  26. Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nat Protoc. 8 (12), 2471-2482 (2013).
  27. Takase, Y., Fujishima, K., Takahashi, T. The 3d culturing of organoids from murine intestinal crypts and a single stem cell for organoid research. J Vis Exp. (194), e65219 (2023).
  28. Cherne, M. D., et al. A synthetic hydrogel, vitrogel((r)) organoid-3, improves immune cell-epithelial interactions in a tissue chip co-culture model of human gastric organoids and dendritic cells. Front Pharmacol. 12, 707891 (2021).
  29. Sebrell, T. A., et al. Live imaging analysis of human gastric epithelial spheroids reveals spontaneous rupture, rotation and fusion events. Cell Tissue Res. 371 (2), 293-307 (2018).
  30. Sensortrace suite user manual. 3.3. Unisense Available from: https://unisense.com/wp-content/uploads/2021/10/SensorTrace-Suite-Manual.pdf (2023)
  31. Microprofiling system user manual. Unisense Available from: https://unisense.com/wp-content/uploads/2021/09/2023.11-MicroProfiling-System-2.pdf (2023)
  32. Wolffling, S., et al. Egf and bmps govern differentiation and patterning in human gastric glands. Gastroenterology. 161 (2), 623-636 (2021).
  33. Boccellato, F., et al. Polarised epithelial monolayers of the gastric mucosa reveal insights into mucosal homeostasis and defence against infection. Gut. 68 (3), 400-413 (2019).
  34. Mccracken, K. W., et al. Modelling human development and disease in pluripotent stem-cell-derived gastric organoids. Nature. 516 (7531), 400-404 (2014).
  35. Schumacher, M. A., et al. The use of murine-derived fundic organoids in studies of gastric physiology. J Physiol. 593 (8), 1809-1827 (2015).
  36. . Unisense Available from: https://unisense.com/products/ph-microelectrode/ (2024)
  37. Mccracken, K. W., et al. Wnt/beta-catenin promotes gastric fundus specification in mice and humans. Nature. 541 (7636), 182-187 (2017).
  38. Schreiber, S., et al. In situ measurement of ph in the secreting canaliculus of the gastric parietal cell and adjacent structures. Cell Tissue Res. 329 (2), 313-320 (2007).
  39. Xu, H., Li, J., Chen, H., Wang, C., Ghishan, F. K. Nhe8 plays important roles in gastric mucosal protection. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 304 (3), G257-G261 (2013).
  40. Gawenis, L. R., et al. Impaired gastric acid secretion in mice with a targeted disruption of the nhe4 na+/h+ exchanger. J Biol Chem. 280 (13), 12781-12789 (2005).
  41. Lewis, O. L., Keener, J. P., Fogelson, A. L. A physics-based model for maintenance of the ph gradient in the gastric mucus layer. Am J Physiol-Gastrointest Liver Physiol. 313 (6), G599-G612 (2017).
  42. Okkelman, I. A., Neto, N., Papkovsky, D. B., Monaghan, M. G., Dmitriev, R. I. A deeper understanding of intestinal organoid metabolism revealed by combining fluorescence lifetime imaging microscopy (flim) and extracellular flux analyses. Redox Biol. 30, 101420 (2020).
  43. Pleguezuelos-Manzano, C., et al. Establishment and culture of human intestinal organoids derived from adult stem cells. Curr Protoc Immunol. 130 (1), e106 (2020).
  44. Guimera, X., et al. A minimally invasive microsensor specially designed for simultaneous dissolved oxygen and ph biofilm profiling. Sensors (Basel). 19 (21), 4747 (2019).

Play Video

Cite This Article
Lyon, K., Bansil, R., Bimczok, D. Profiling Luminal pH in Three-Dimensional Gastrointestinal Organoids Using Microelectrodes. J. Vis. Exp. (209), e66900, doi:10.3791/66900 (2024).

View Video