Denne protokollen beskriver pH-målinger i humane vevsavledede gastriske organoider ved bruk av mikroelektroder for spatiotemporal karakterisering av intraluminal fysiologi.
Optimalisering og detaljert karakterisering av gastrointestinale organoidmodeller krever avanserte metoder for å analysere deres luminale miljøer. Denne artikkelen presenterer en svært reproduserbar metode for presis måling av pH i lumina til 3D-humane gastriske organoider via mikromanipulatorkontrollerte mikroelektroder. pH-mikroelektrodene er kommersielt tilgjengelige og består av skrå glassspisser med en diameter på 25 μm. For målinger føres pH-mikroelektroden inn i lumen til en organoid (>200 μm) som er suspendert i Matrigel, mens en referanseelektrode hviler nedsenket i det omkringliggende mediet i kulturplaten.
Ved å bruke slike mikroelektroder for å profilere organoider avledet fra den menneskelige magekroppen, demonstrerer vi at luminal pH er relativt konsistent i hver kulturbrønn ved ~7,7 ± 0,037 og at kontinuerlige målinger kan oppnås i minimum 15 minutter. I noen større organoider avslørte målingene en pH-gradient mellom epiteloverflaten og lumen, noe som tyder på at pH-målinger i organoider kan oppnås med høy romlig oppløsning. I en tidligere studie ble mikroelektroder brukt til å måle luminale oksygenkonsentrasjoner i organoider, noe som demonstrerte allsidigheten til denne metoden for organoidanalyser. Oppsummert beskriver denne protokollen et viktig verktøy for funksjonell karakterisering av det komplekse luminale rommet i 3D-organoider.
Organoider – miniatyr flercellede strukturer avledet fra stamceller – har revolusjonert vår evne til å studere menneskelig fysiologi og begynner å erstatte dyremodeller, selv i regulatoriske omgivelser1. Siden den første beskrivelsen av tarmorganoider av Sato et al. i 2009, har organoidteknologi blitt enormt populær2. Et stort antall studier har karakterisert den cellulære sammensetningen og funksjonen til organoidmodeller i detalj 3,4,5,6. Imidlertid forblir det lysende rommet til disse 3D flercellede strukturene stort sett udefinert 7,8. Lumen er det sentrale hulrommet i organoider avledet fra slimhinnevev som er omgitt av de apikale delene av polariserte epitelceller. Siden cellulær sekresjon og absorpsjon hovedsakelig forekommer ved den apikale epiteloverflaten, styres det luminale mikromiljøet til organoider av disse viktige fysiologiske prosessene. For tiden brukte organoidmodeller viser variasjoner i cellesignalmønstre, generell stamhet, metabolittkonsentrasjonsgradienter og miljøforhold9. Å forstå organoid luminal fysiologi er derfor nødvendig for nøyaktig modellering av organfunksjon og patologi. Dessverre hindrer den relative utilgjengeligheten av lumen betydelig funksjonelle analyser av luminal fysiologi i 3D-organoider10.
Evnen til å undersøke pH-profiler er spesielt viktig i magen, som er beryktet for å ha den bratteste protongradienten i kroppen, fra omtrent 1-3 i lumen, til nesten nøytral ved epitelet 11,12,13. Det er fortsatt et betydelig gap i vår forståelse av mikroskala vedlikehold av gastrisk pH-gradient, og relevansen av organoidmodeller for å rekapitulere dette dynamiske miljøet over mageslimlaget. Tradisjonelle tilnærminger for analyse av organoid pH har involvert bruk av pH-følsomme fargestoffer, som kan være fluorescerende eller kolorimetriske indikatorer. McCracken et al. brukte en luminal injeksjon av SNARF-5F-a ratiometrisk pH-indikator i organoider for å analysere et fall i luminal pH som respons på histaminbehandling. Slike fargestoffer kan inkorporeres i kulturmediet, noe som muliggjør sanntids, ikke-invasiv overvåking av pH. Ikke bare krever pH-følsomme fargestoffer komplekse kalibreringstrinn som bidrar til dårlig pålitelighet og nøyaktighet med målinger, men slike fargestoffer har også en tendens til å operere innenfor spesifikke deteksjonsområder som kanskje ikke er representative for hele pH-området i mikromiljøet av interesse14,15. Det kan imidlertid anses som rimelig å bruke indikatorfargestoffer til bekreftende eksperimenter. Optiske nanosensorer som bruker fluorescerende optodebaserte, pH-sensing tilnærminger er også utviklet; Imidlertid krever slike sensorteknikker mikroskopisk avbildning og er også utsatt for fotobleking, fototoksisitet, samt bildeskjevhet16,17. I tillegg har Brooks et al. 3D-printede multiwell-plater som inneholder mikroelektroder på toppen av hvilke organoider kan belegges18. Denne tilnærmingen tillater imidlertid ikke målinger direkte inne i organoidlumen.
Elektrodebaserte pH-målinger kan oppnå forbedret nøyaktighet sammenlignet med andre metoder, samt gi pH-overvåking i sanntid. I tillegg gir pH-elektroder montert på mikromanipulatorer overlegen romlig oppløsning av pH-målinger, ettersom den nøyaktige plasseringen av elektrodespissen kan kontrolleres fint. Dette muliggjør høyest mulig fleksibilitet og reproduserbarhet i analysene av organoidmodeller. Elektrodene som brukes her er miniatyriserte pH-mikroelektroder som fungerer basert på diffusjon av protoner gjennom selektivt pH-glass som omgir en tynn platinatråd. Mikroelektroden kobles til en ekstern Ag-AgCl-referanseelektrode og kobles deretter til en millivoltmeter med høy impedans. Det elektriske potensialet mellom de to elektrodespissene når de er nedsenket i samme løsning vil reflektere pH i løsningen19. Slike mikroprofileringssystemer har blitt brukt i metabolsk analyse av biofilmer20,21, planktonalger22, humane sputumprøver23, og til og med i mesenkymale stamcellesfæroider24. Både laboratoriet vårt og Murphy et al. har tidligere brukt mikromanipulatorkontrollerte O 2-mikroelektroder for å evaluere oksygenkonsentrasjonene i luminalrommene til organoider. Murphy et al. paret denne metoden med matematisk modellering for å avsløre en oksygengradient i sfæroidene deres. Vår gruppe var i stand til å finne reduserte luminale oksygennivåer i vevsavledede gastriske organoider sammenlignet med den omkringliggende ekstracellulære matrisen25.
Her gir vi en detaljert metode for manuell mikroelektrodeprofilering av luminal pH i sfæriske gastrointestinale organoider som vil muliggjøre forbedret fysiologisk forståelse av deres komplekse luminale mikromiljø. Vi forventer at denne teknikken vil legge til en ny dimensjon til utforskningen av organoidfysiologi gjennom sanntids, høyoppløselige målinger av pH-nivåer på mikroskala. Videre kan følgende protokoll enkelt tilpasses for analyse av O2, N2O, H2, NO, H2S, redoks og temperatur i ulike typer organoidmodeller. Fysiologisk profilering fungerer som et verdifullt verktøy for å optimalisere organoidkulturforhold for bedre å etterligne in vivo-miljøer , og dermed øke relevansen og nytten av organoidmodeller i biomedisinsk forskning.
Begrenset tilgang til det luminale rommet til organoider har sterkt begrenset vår forståelse av den fysiologiske dynamikken i dette mikromiljøet. Et pålitelig verktøy for funksjonelle analyser av luminal fysiologi vil utvide vår evne til å utnytte organoider som in vitro-modeller for fysiologi, farmakologi og sykdomsforskning. Organoider er svært avstembare, fysiologisk relevante modeller med ekstra potensial til å replikere genetisk variasjon i den menneskelige populasjonen. Eksisterende metoder for pH…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gjerne anerkjenne Dr. Ellen Lauchnor, Dr. Phil Stewart og Bengisu Kilic for deres tidligere arbeid og assistanse med O 2-mikrosensorene; Andy Sebrell for opplæring i organoidkultur og mikromanipulasjon; Lexi Burcham for hjelp til organoidkultur, medieforberedelse, dataregistrering og organisering; og Dr. Susy Kohout for generelle råd innen elektrofysiologi. Vi vil gjerne takke Dr. Heidi Smith for hennes hjelp med bildebehandling og anerkjenne Center for Biofilm Engineering Bioimaging Facility ved Montana State University, som støttes av midler fra National Science Foundation MRI Program (2018562), M.J. Murdock Charitable Trust (202016116), US Department of Defense (77369LSRIP & W911NF1910288), og av Montana Nanotechnology Facility (et NNCI-medlem støttet av NSF Grant ECCS-2025391).
Spesiell takk til hele Unisense-teamet som gjorde dette arbeidet mulig, spesielt Dr. Andrew Cerskus, Dr. Laura Woods, Dr. Lars Larsen, Dr. Tage Dalsgaard, Dr. Line Daugaard, Dr. Karen Maegaard og Mette Gammelgaard. Finansiering av studien vår ble gitt av National Institutes of Health-tilskuddene R01 GM13140801 (DB, RB) og UL1 TR002319 (KNL), og en Research Expansion Award fra Montana State University Office for Research and Economic Development (DB). Figur 1A ble laget med BioRender.
3 M KCl | Unisense | ||
5 mL Wobble-not Serological Pipet, Individually Wrapped, Paper/Plastic, Bag, Sterile | CellTreat | 229091B | |
10 mL Wobble-not Serological Pipet, Individually Wrapped, Paper/Plastic, Bag, Sterile | CellTreat | 229092B | |
15 mL Centrifuge Tube – Foam Rack, Sterile | CellTreat | 229412 | |
24 Well Tissue Culture Plate, Sterile | CellTreat | 229124 | |
25 mL Wobble-not Serological Pipet, Individually Wrapped, Paper/Plastic, Bag, Sterile | CellTreat | 229093B | |
35 mm Dish | No. 1.5 Coverslip | 20 mm Glass Diameter | Uncoated | MatTek | P35G-1.5-20-C | |
50 mL Centrifuge Tube – Foam Rack, Sterile | CellTreat | 229422 | |
70% Ethanol | BP82031GAL | BP82031GAL | |
70 μm Cell Strainer, Individually Wrapped, Sterile | CellTreat | 229483 | |
1,000 µL Extended Length Low Retention Pipette Tips, Racked, Sterile | CellTreat | 229037 | |
Amphotericin B (Fungizone) Solution | HyClone Laboratories, Inc | SV30078.01 | |
Biosafety Cabinet | Nuaire | NU-425-600 | Class II Type A/B3 |
Bovine Serum Albumin | Fisher Bioreagents | BP1605-100 | |
Cell recovery solution | Corning | 354253 | Cell dissociation solution |
DMEM/F-12 (Advanced DMEM) | Gibco | 12-491-015 | |
Dulbecco's Modification of Eagles Medium (DMEM) | Fisher Scientific | 15017CV | |
Fetal Bovine Serum | HyClone Laboratories, Inc | SH30088 | |
G418 Sulfate | Corning | 30-234-CR | |
Gentamycin sulfate | IBI Scientific | IB02030 | |
HEPES, Free Acid | Cytiva | SH30237.01 | |
HP Pavillion 2-in-1 14" Laptop Intel Core i3 | HP | M03840-001 | |
Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144C-212 | |
Incubator | Fisher Scientific | 11676604 | |
iPhone 12 camera | Apple | ||
L-glutamine | Cytiva | SH3003401 | |
Large Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply | Fisher Scientific | 34133 | |
M 205 FA Stereomicroscope | Leica | ||
Matrigel Membrane Matrix 354234 | Corning | CB-40234 | |
MC-1 UniMotor Controller | Unisense | ||
Methyl red | |||
MM33 Micromanipulator | Marzhauser Wetzlar | 61-42-113-0000 | Right handed |
MS-15 Motorized Stage | Unisense | ||
Nanoject-II | Drummond | 3-000-204 | nanoliter autoinjector |
Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15-140-148 | |
pH Microelectrodes | Unisense | 50-109158, 25-203452, 25-205272, 25-111626, 25-109160 | SensorTrace software is not compatible with Apple computers |
Reference Electrode | Unisense | REF-RM-001652 | SensorTrace software is not compatible with Apple computers |
SB 431542 | Tocris Bioscience | 16-141-0 | |
Smartphone Camera Adapter | Gosky | ||
Specifications Laboratory Stand LS | Unisense | LS-009238 | |
Trypsin-EDTA 0.025%, phenol red | Gibco | 25-200-056 | |
UniAmp | Unisense | 11632 | |
United Biosystems Inc MINI CELL SCRAPERS 200/PK | Fisher | MCS-200 | |
Y-27632 dihydrochloride | Tocris Bioscience | 12-541-0 | |
µSensor Calibration Kit | Unisense/ Mettler Toledo | 51-305-070, 51-302-069 | pH 4.01 and 9.21, 20 mL packets |