Mikroelektrotlar Kullanılarak Üç Boyutlu Gastrointestinal Organoidlerde Luminal pH Profili Oluşturma
Summary
Mevcut protokol, intraluminal fizyolojinin uzay-zamansal karakterizasyonu için mikroelektrotlar kullanılarak insan dokusundan türetilmiş mide organoidlerinde pH ölçümlerini açıklamaktadır.
Abstract
Gastrointestinal organoid modellerin optimizasyonu ve ayrıntılı karakterizasyonu, luminal ortamlarını analiz etmek için gelişmiş yöntemler gerektirir. Bu makale, mikromanipülatör kontrollü mikroelektrotlar aracılığıyla 3D insan mide organoidlerinin lümeni içindeki pH’ın hassas ölçümü için oldukça tekrarlanabilir bir yöntem sunmaktadır. pH mikroelektrotları ticari olarak temin edilebilir ve 25 μm çapında eğimli cam uçlardan oluşur. Ölçümler için, pH mikroelektrodu, Matrigel içinde süspanse edilmiş bir organoidin (>200 μm) lümenine ilerletilirken, bir referans elektrot kültür plakasındaki çevreleyen ortama daldırılır.
İnsan mide vücudundan türetilen organoidlerin profilini çıkarmak için bu tür mikroelektrotları kullanarak, luminal pH’ın her kültür kuyusu içinde ~ 7.7 ± 0.037’de nispeten tutarlı olduğunu ve en az 15 dakika boyunca sürekli ölçümlerin elde edilebileceğini gösteriyoruz. Bazı büyük organoidlerde, ölçümler epitel yüzeyi ile lümen arasında bir pH gradyanı ortaya çıkardı, bu da organoidlerdeki pH ölçümlerinin yüksek uzamsal çözünürlükle elde edilebileceğini düşündürdü. Önceki bir çalışmada, organoidlerdeki luminal oksijen konsantrasyonlarını ölçmek için mikroelektrotlar başarıyla kullanıldı ve bu da organoid analizleri için bu yöntemin çok yönlülüğünü gösterdi. Özetle, bu protokol, 3D organoidler içindeki karmaşık luminal boşluğun işlevsel karakterizasyonu için önemli bir aracı tanımlar.
Introduction
Organoidler – kök hücrelerden türetilen minyatür çok hücreli yapılar – insan fizyolojisini inceleme yeteneğimizde devrim yarattı ve düzenleyici ortamlarda bile hayvan modellerinin yerini almaya başladı1. 2009 yılında Sato ve arkadaşları tarafından bağırsak organoidlerinin ilk tanımından bu yana, organoid teknolojisi son derece popüler hale geldi2. Çok sayıda çalışma, organoid modellerin hücresel bileşimini ve işlevini ayrıntılı olarak karakterize etmiştir 3,4,5,6. Bununla birlikte, bu 3D çok hücreli yapıların luminal alanı büyük ölçüde tanımsız kalmaktadır 7,8. Lümen, polarize epitel hücrelerinin apikal kısımları ile çevrili mukozal dokulardan türetilen organoidlerin merkezi boşluğudur. Hücresel sekresyon ve emilim ağırlıklı olarak apikal epitel yüzeyinde meydana geldiğinden, organoidlerin luminal mikro çevresi bu önemli fizyolojik süreçler tarafından kontrol edilir. Şu anda kullanılan organoid modeller, hücre sinyal modellerinde, genel gövdede, metabolit konsantrasyon gradyanlarında ve çevresel koşullarda farklılıklar göstermektedir9. Bu nedenle organoid luminal fizyolojiyi anlamak, organ fonksiyonunun ve patolojisinin doğru modellenmesi için gereklidir. Ne yazık ki, lümenin göreceli olarak erişilemezliği, 3D organoidlerde luminal fizyolojinin fonksiyonel analizlerini önemli ölçüde engellemektedir10.
PH profillerini inceleme yeteneği, lümende yaklaşık 1-3 arasında değişen, 11,12,13 epitelinde nötre yakın olana kadar vücuttaki en dik proton gradyanına sahip olmasıyla ünlü midede özellikle önemlidir. Gastrik pH gradyanının mikro ölçekte sürdürülmesi ve organoid modellerin gastrik mukus tabakası boyunca bu dinamik ortamın özetlenmesindeki önemi hakkındaki anlayışımızda önemli bir boşluk bulunmaktadır. Organoid pH analizi için geleneksel yaklaşımlar, floresan veya kolorimetrik indikatörler olabilen pH’a duyarlı boyaların kullanımını içermektedir. McCracken ve ark. histamin tedavisine yanıt olarak luminal pH’daki bir düşüşü analiz etmek için organoidlere SNARF-5F-bir oransal pH indikatörünün luminal enjeksiyonunu kullandı. Bu tür boyalar, pH’ın gerçek zamanlı, invaziv olmayan izlenmesine izin verecek şekilde kültür ortamına dahil edilebilir. pH’a duyarlı boyalar, ölçümlerde düşük güvenilirlik ve doğruluğa katkıda bulunan karmaşık kalibrasyon adımları gerektirmekle kalmaz, aynı zamanda bu tür boyalar, ilgilenilen mikro ortam14,15 içindeki tam pH aralığını temsil etmeyebilecek belirli algılama aralıkları içinde çalışma eğilimindedir. Bununla birlikte, doğrulayıcı deneyler için gösterge boyalarının kullanılması makul kabul edilebilir. Floresan optod bazlı, pH algılama yaklaşımlarını kullanan optik nanosensörler de geliştirilmiştir; Bununla birlikte, bu tür algılama teknikleri mikroskobik görüntüleme gerektirir ve ayrıca fotoağartma, fototoksisite ve görüntüleme yanlılığına karşı hassastır16,17. Ek olarak, Brooks ve ark. üzerine organoidlerin kaplanabileceği mikroelektrotlar içeren 3D baskılı çok kuyulu plakalar18. Ancak bu yaklaşım, doğrudan organoid lümen içinde ölçümlere izin vermez.
Elektrot bazlı pH ölçümleri, diğer yöntemlere kıyasla daha fazla doğruluk sağlayabilir ve gerçek zamanlı pH izleme sağlayabilir. Ek olarak, mikromanipülatörlere monte edilen pH elektrotları, elektrot ucunun hassas konumu hassas bir şekilde kontrol edilebildiğinden, pH ölçümlerinin üstün uzamsal çözünürlüğüne izin verir. Bu, organoid modellerin analizlerinde mümkün olan en yüksek esnekliği ve tekrarlanabilirliği sağlar. Burada kullanılan elektrotlar, ince bir platin teli çevreleyen seçici pH camından protonların difüzyonuna dayalı olarak çalışan minyatür pH mikroelektrotlarıdır. Mikroelektrot, harici bir Ag-AgCl referans elektroduna bağlanır ve daha sonra yüksek empedanslı bir milivolt metreye bağlanır. Aynı çözeltiye daldırıldığında iki elektrot ucu arasındaki elektrik potansiyeli, çözeltinin19 pH’ını yansıtacaktır. Bu tür mikroprofil oluşturma sistemleri, biyofilmlerin20,21, planktonik alglerin22, insan balgam örneklerinin23 ve hatta mezenkimal kök hücre sferoidlerinin24 metabolik analizinde kullanılmıştır. Hem laboratuvarımız hem de Murphy ve ark. daha önce organoidlerin lümen boşluklarındaki oksijen konsantrasyonlarını değerlendirmek için mikromanipülatör kontrollü O2 mikroelektrotları kullanmışlardır. Murphy ve ark. bu yöntemi matematiksel modelleme ile eşleştirerek sferoidleri içinde bir oksijen gradyanı ortaya çıkardı. Grubumuz, çevredeki hücre dışı matriks25 ile karşılaştırıldığında, doku kaynaklı mide organoidlerinde azalmış luminal oksijen seviyeleri bulabildi.
Burada, karmaşık luminal mikro çevrelerinin daha iyi fizyolojik olarak anlaşılmasını sağlayacak küresel gastrointestinal sistem organoidlerinde luminal pH’ın manuel mikroelektrot profili için ayrıntılı bir yöntem sunuyoruz. Bu tekniğin, mikro ölçekte pH seviyelerinin gerçek zamanlı, yüksek çözünürlüklü ölçümleri yoluyla organoid fizyolojisinin araştırılmasına yeni bir boyut katacağını tahmin ediyoruz. Ayrıca, aşağıdaki protokol, çeşitli organoid model türlerindeO2, N2O, H2, NO, H2S, redoks ve sıcaklık analizi için kolayca uyarlanabilir. Fizyolojik profilleme, in vivo ortamları daha iyi taklit etmek için organoid kültür koşullarını optimize etmek için değerli bir araç olarak hizmet eder, böylece biyomedikal araştırmalarda organoid modellerin alaka düzeyini ve faydasını artırır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Organoidlerin luminal boşluğuna sınırlı erişim, bu mikro çevrenin fizyolojik dinamikleri hakkındaki anlayışımızı ciddi şekilde kısıtlamıştır. Luminal fizyolojinin fonksiyonel analizleri için güvenilir bir araç, fizyoloji, farmakoloji ve hastalık araştırmaları için in vitro modeller olarak organoidlerden yararlanma yeteneğimizi artıracaktır. Organoidler, insan popülasyonu içindeki genetik değişkenliği çoğaltma potansiyeline sahip, son derece ayarlanabilir, fizyolojik olarak il…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, Dr. Ellen Lauchnor, Dr. Phil Stewart ve Bengisu Kılıç’a önceki çalışmaları ve O2 mikrosensörleri ile ilgili yardımları için teşekkür eder; Organoid kültür ve mikromanipülasyon eğitimi için Andy Sebrell; Organoid kültürü, medya hazırlama, veri kaydı ve organizasyon konularında yardım için Lexi Burcham; ve elektrofizyoloji konusunda genel tavsiyeler için Dr. Susy Kohout. Görüntüleme konusundaki yardımları için Dr. Heidi Smith’e teşekkür eder ve Ulusal Bilim Vakfı MRI Programı (2018562), MJ Murdock Charitable Trust (202016116), ABD Savunma Bakanlığı (77369LSRIP & W911NF1910288) ve Montana Nanoteknoloji Tesisi (NSF Grant ECCS-2025391 tarafından desteklenen bir NNCI üyesi) tarafından sağlanan fonlarla desteklenen Montana Eyalet Üniversitesi’ndeki Biyofilm Mühendisliği Biyogörüntüleme Tesisi’ne teşekkür ederiz.
Bu çalışmayı mümkün kılan tüm Unisense ekibine, özellikle Dr. Andrew Cerskus, Dr. Laura Woods, Dr. Lars Larsen, Dr. Tage Dalsgaard, Dr. Line Daugaard, Dr. Karen Maegaard ve Mette Gammelgaard’a özel teşekkürler. Çalışmamızın finansmanı, Ulusal Sağlık Enstitüleri hibeleri R01 GM13140801 (DB, RB) ve UL1 TR002319 (KNL) ve Montana Eyalet Üniversitesi Araştırma ve Ekonomik Kalkınma Ofisi’nden (DB) bir Araştırma Genişletme Ödülü tarafından sağlandı. Şekil 1A , BioRender ile oluşturulmuştur.
Materials
| 3 M KCl | Unisense | ||
| 5 mL Wobble-not Serological Pipet, Individually Wrapped, Paper/Plastic, Bag, Sterile | CellTreat | 229091B | |
| 10 mL Wobble-not Serological Pipet, Individually Wrapped, Paper/Plastic, Bag, Sterile | CellTreat | 229092B | |
| 15 mL Centrifuge Tube – Foam Rack, Sterile | CellTreat | 229412 | |
| 24 Well Tissue Culture Plate, Sterile | CellTreat | 229124 | |
| 25 mL Wobble-not Serological Pipet, Individually Wrapped, Paper/Plastic, Bag, Sterile | CellTreat | 229093B | |
| 35 mm Dish | No. 1.5 Coverslip | 20 mm Glass Diameter | Uncoated | MatTek | P35G-1.5-20-C | |
| 50 mL Centrifuge Tube – Foam Rack, Sterile | CellTreat | 229422 | |
| 70% Ethanol | BP82031GAL | BP82031GAL | |
| 70 μm Cell Strainer, Individually Wrapped, Sterile | CellTreat | 229483 | |
| 1,000 µL Extended Length Low Retention Pipette Tips, Racked, Sterile | CellTreat | 229037 | |
| Amphotericin B (Fungizone) Solution | HyClone Laboratories, Inc | SV30078.01 | |
| Biosafety Cabinet | Nuaire | NU-425-600 | Class II Type A/B3 |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Bioreagents | BP1605-100 | |
| Cell recovery solution | Corning | 354253 | Cell dissociation solution |
| DMEM/F-12 (Advanced DMEM) | Gibco | 12-491-015 | |
| Dulbecco's Modification of Eagles Medium (DMEM) | Fisher Scientific | 15017CV | |
| Fetal Bovine Serum | HyClone Laboratories, Inc | SH30088 | |
| G418 Sulfate | Corning | 30-234-CR | |
| Gentamycin sulfate | IBI Scientific | IB02030 | |
| HEPES, Free Acid | Cytiva | SH30237.01 | |
| HP Pavillion 2-in-1 14" Laptop Intel Core i3 | HP | M03840-001 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144C-212 | |
| Incubator | Fisher Scientific | 11676604 | |
| iPhone 12 camera | Apple | ||
| L-glutamine | Cytiva | SH3003401 | |
| Large Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply | Fisher Scientific | 34133 | |
| M 205 FA Stereomicroscope | Leica | ||
| Matrigel Membrane Matrix 354234 | Corning | CB-40234 | |
| MC-1 UniMotor Controller | Unisense | ||
| Methyl red | |||
| MM33 Micromanipulator | Marzhauser Wetzlar | 61-42-113-0000 | Right handed |
| MS-15 Motorized Stage | Unisense | ||
| Nanoject-II | Drummond | 3-000-204 | nanoliter autoinjector |
| Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15-140-148 | |
| pH Microelectrodes | Unisense | 50-109158, 25-203452, 25-205272, 25-111626, 25-109160 | SensorTrace software is not compatible with Apple computers |
| Reference Electrode | Unisense | REF-RM-001652 | SensorTrace software is not compatible with Apple computers |
| SB 431542 | Tocris Bioscience | 16-141-0 | |
| Smartphone Camera Adapter | Gosky | ||
| Specifications Laboratory Stand LS | Unisense | LS-009238 | |
| Trypsin-EDTA 0.025%, phenol red | Gibco | 25-200-056 | |
| UniAmp | Unisense | 11632 | |
| United Biosystems Inc MINI CELL SCRAPERS 200/PK | Fisher | MCS-200 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris Bioscience | 12-541-0 | |
| µSensor Calibration Kit | Unisense/ Mettler Toledo | 51-305-070, 51-302-069 | pH 4.01 and 9.21, 20 mL packets |
References
- Zhang, N., et al. Tissue spatial omics dissects organoid biomimicry. GEN Biotechnology. 2 (5), 372-383 (2023).
- Sato, T., et al. Single lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease modeling in stem cell-derived 3d organoid systems. Trends Mol Med. 23 (5), 393-410 (2017).
- Achberger, K., et al. Merging organoid and organ-on-a-chip technology to generate complex multi-layer tissue models in a human retina-on-a-chip platform. Elife. 8, e46188 (2019).
- Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).
- Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nat Cell Biol. 18 (3), 246-254 (2016).
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Davies, J. A., Davies, J. A., Lawrence, M. L. . Organoids and Mini-organs. , 3-40 (2018).
- Ambrosini, Y. M., et al. Recapitulation of the accessible interface of biopsy-derived canine intestinal organoids to study epithelial-luminal interactions. PLoS One. 15 (4), e0231423 (2020).
- Williams, S. E., Turnberg, L. A. Demonstration of a pH gradient across mucus adherent to rabbit gastric mucosa: Evidence for a ‘mucus-bicarbonate’ barrier. Gut. 22 (2), 94-96 (1981).
- Schubert, M. L. Gastric secretion. Curr Opin Gastroenterol. 20 (6), 519-525 (2004).
- Celli, J. P., et al. Rheology of gastric mucin exhibits a pH-dependent sol−gel transition. Biomacromolecules. 8 (5), 1580-1586 (2007).
- Takeshita, Y., et al. Assessment of pH-dependent errors in spectrophotometric pH measurements of seawater. Marine Chemistry. 223, 103801 (2020).
- Mccracken, K. W., et al. Wnt/β-catenin promotes gastric fundus specification in mice and humans. Nature. 541 (7636), 182-187 (2017).
- Larsen, M., Borisov, S. M., Grunwald, B., Klimant, I., Glud, R. N. A simple and inexpensive high resolution color ratiometric planar optode imaging approach: Application to oxygen and ph sensing. Limnology and Oceanography: Methods. 9 (9), 348-360 (2011).
- Jewell, M. P., Galyean, A. A., Kirk Harris, J., Zemanick, E. T., Cash, K. J. Luminescent nanosensors for ratiometric monitoring of three-dimensional oxygen gradients in laboratory and clinical pseudomonas aeruginosa biofilms. Appl Environ Microbiol. 85 (20), e01116-e01119 (2019).
- Brooks, E. L., Hussain, K. K., Kotecha, K., Abdalla, A., Patel, B. A. Three-dimensional-printed electrochemical multiwell plates for monitoring food intolerance from intestinal organoids. ACS Sens. 8 (2), 712-720 (2023).
- pH and reference electrode manual. Unisense Available from: https://unisense.com/wp-content/uploads/2023/05/2023.05-pH-and-ref-sensor-manual.pdf (2023)
- Villahermosa, D., Corzo, A., Garcia-Robledo, E., Gonzalez, J. M., Papaspyrou, S. Kinetics of indigenous nitrate reducing sulfide oxidizing activity in microaerophilic wastewater biofilms. PLoS One. 11 (2), 0149096 (2016).
- Pabst, B., Pitts, B., Lauchnor, E., Stewart, P. S. Gel-entrapped staphylococcus aureus bacteria as models of biofilm infection exhibit growth in dense aggregates, oxygen limitation, antibiotic tolerance, and heterogeneous gene expression. Antimicrob Agents Chemother. 60 (10), 6294-6301 (2016).
- Ploug, H., Stolte, W., Epping, E. H. G., Jørgensen, B. B. Diffusive boundary layers, photosynthesis, and respiration of the colony-forming plankton algae, phaeocystis sp. Limnology and Oceanography. 44 (8), 1949-1958 (1999).
- Kolpen, M., et al. Nitrous oxide production in sputum from cystic fibrosis patients with chronic pseudomonas aeruginosa lung infection. PLoS One. 9 (1), 84353 (2014).
- Murphy, K. C., et al. Measurement of oxygen tension within mesenchymal stem cell spheroids. J R Soc Interface. 14 (127), 20160851 (2017).
- Sebrell, T. A., et al. A novel gastric spheroid co-culture model reveals chemokine-dependent recruitment of human dendritic cells to the gastric epithelium. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 8 (1), 157-171 (2019).
- Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nat Protoc. 8 (12), 2471-2482 (2013).
- Takase, Y., Fujishima, K., Takahashi, T. The 3d culturing of organoids from murine intestinal crypts and a single stem cell for organoid research. J Vis Exp. (194), e65219 (2023).
- Cherne, M. D., et al. A synthetic hydrogel, vitrogel((r)) organoid-3, improves immune cell-epithelial interactions in a tissue chip co-culture model of human gastric organoids and dendritic cells. Front Pharmacol. 12, 707891 (2021).
- Sebrell, T. A., et al. Live imaging analysis of human gastric epithelial spheroids reveals spontaneous rupture, rotation and fusion events. Cell Tissue Res. 371 (2), 293-307 (2018).
- Sensortrace suite user manual. 3.3. Unisense Available from: https://unisense.com/wp-content/uploads/2021/10/SensorTrace-Suite-Manual.pdf (2023)
- Microprofiling system user manual. Unisense Available from: https://unisense.com/wp-content/uploads/2021/09/2023.11-MicroProfiling-System-2.pdf (2023)
- Wolffling, S., et al. Egf and bmps govern differentiation and patterning in human gastric glands. Gastroenterology. 161 (2), 623-636 (2021).
- Boccellato, F., et al. Polarised epithelial monolayers of the gastric mucosa reveal insights into mucosal homeostasis and defence against infection. Gut. 68 (3), 400-413 (2019).
- Mccracken, K. W., et al. Modelling human development and disease in pluripotent stem-cell-derived gastric organoids. Nature. 516 (7531), 400-404 (2014).
- Schumacher, M. A., et al. The use of murine-derived fundic organoids in studies of gastric physiology. J Physiol. 593 (8), 1809-1827 (2015).
- . Unisense Available from: https://unisense.com/products/ph-microelectrode/ (2024)
- Mccracken, K. W., et al. Wnt/beta-catenin promotes gastric fundus specification in mice and humans. Nature. 541 (7636), 182-187 (2017).
- Schreiber, S., et al. In situ measurement of ph in the secreting canaliculus of the gastric parietal cell and adjacent structures. Cell Tissue Res. 329 (2), 313-320 (2007).
- Xu, H., Li, J., Chen, H., Wang, C., Ghishan, F. K. Nhe8 plays important roles in gastric mucosal protection. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 304 (3), G257-G261 (2013).
- Gawenis, L. R., et al. Impaired gastric acid secretion in mice with a targeted disruption of the nhe4 na+/h+ exchanger. J Biol Chem. 280 (13), 12781-12789 (2005).
- Lewis, O. L., Keener, J. P., Fogelson, A. L. A physics-based model for maintenance of the ph gradient in the gastric mucus layer. Am J Physiol-Gastrointest Liver Physiol. 313 (6), G599-G612 (2017).
- Okkelman, I. A., Neto, N., Papkovsky, D. B., Monaghan, M. G., Dmitriev, R. I. A deeper understanding of intestinal organoid metabolism revealed by combining fluorescence lifetime imaging microscopy (flim) and extracellular flux analyses. Redox Biol. 30, 101420 (2020).
- Pleguezuelos-Manzano, C., et al. Establishment and culture of human intestinal organoids derived from adult stem cells. Curr Protoc Immunol. 130 (1), e106 (2020).
- Guimera, X., et al. A minimally invasive microsensor specially designed for simultaneous dissolved oxygen and ph biofilm profiling. Sensors (Basel). 19 (21), 4747 (2019).
