Identificatie van zeldzame antigeenspecifieke T-cellen uit muizenlongen met peptide: belangrijke histocompatibiliteitscomplextetrameren
Summary
We bieden een gedetailleerd protocol voor het isoleren en identificeren van zeldzame antigeenspecifieke T-celpopulaties in muizenlongen door middel van T-celverrijking op basis van magnetische kralen en peptide:major histocompatibility complex (MHC)-tetrameren.
Abstract
De identificatie en karakterisering van antigeenspecifieke T-cellen tijdens gezondheid en ziekte blijft een sleutel tot het verbeteren van ons begrip van immuunpathofysiologie. De technische uitdagingen van het volgen van antigeenspecifieke T-celpopulaties binnen het endogene T-celrepertoire zijn enorm verbeterd door de ontwikkeling van peptide:MHC-tetrameerreagentia. Deze fluorescerend gelabelde oplosbare multimeren van MHC klasse I- of klasse II-moleculen gecomplexeerd tot antigene peptide-epitopen binden rechtstreeks aan T-cellen met overeenkomstige T-celreceptor (TCR) specificiteit en kunnen daarom antigeenspecifieke T-celpopulaties in hun oorspronkelijke staat identificeren zonder dat een functionele respons vereist is die wordt geïnduceerd door ex vivo stimulatie. Voor uiterst zeldzame populaties kunnen tetrameergebonden T-cellen magnetisch worden verrijkt om de gevoeligheid en betrouwbaarheid van de detectie te vergroten.
Naarmate het onderzoek naar de immuniteit van weefselresidente T-cellen zich verdiept, is er een dringende behoefte om antigeenspecifieke T-cellen te identificeren die naar niet-lymfoïde weefsels reizen en zich daarin bevinden. In dit protocol presenteren we een gedetailleerde reeks instructies voor de isolatie en karakterisering van antigeenspecifieke T-cellen die aanwezig zijn in de longen van muizen. Dit omvat de isolatie van T-cellen uit verteerd longweefsel, gevolgd door een algemene magnetische verrijkingsstap van T-cellen en tetrameerkleuring voor flowcytometrie, analyse en sortering. De stappen die in dit protocol worden benadrukt, maken gebruik van gangbare technieken en gemakkelijk verkrijgbare reagentia, waardoor het toegankelijk is voor bijna elke onderzoeker die zich bezighoudt met immunologie van T-cellen van muizen, en zijn zeer aanpasbaar voor een verscheidenheid aan stroomafwaartse analyses van elke laagfrequente antigeenspecifieke T-celpopulatie die zich in de longen bevindt.
Introduction
De kern van het adaptieve immuunsysteem ligt in het vermogen van een T-cel om een specifiek antigeen te herkennen en erop te reageren. Wanneer en waar een T-cel reageert op zijn verwante antigeen bepaalt de balans tussen infectie en auto-immuniteit, homeostase en kanker, gezondheid en ziekte1. Hieruit volgt dat de studie van T-cellen in een specifieke context van immuniteit zich moet richten op de cellen met specificiteit voor een relevant antigeen van belang. Onder de technologische vooruitgang die het vermogen om antigeenspecifieke T-celpopulaties te karakteriseren aanzienlijk heeft verbeterd, zijn fluorescerend gelabelde oplosbare multimeren (meestal tetrameren) van major histocompatibility complex (MHC) klasse I- of klasse II-moleculen gecomplexeerd tot antigene peptide-epitopen, beter bekend als “peptide:MHC-tetrameren”2,3,4,5 . Door de natuurlijke liganden van T-celantigeenreceptoren (TCR’s) weer te geven, bieden peptide:MHC klasse I- en klasse II-tetrameren een middel om respectievelijk antigeenspecifieke CD8+– en CD4+-T-cellen direct te identificeren binnen het endogene repertoire van T-cellen in het immuunsysteem zonder dat een reactie op antigeenstimulatie in een test vereist is. Tetrameren vertegenwoordigen een elegantere benadering van de studie van antigeenspecifieke T-cellen dan TCR transgene T-cel adoptieve transfermodellen6, en worden in toenemende mate gebruikt om vreemde en zelfantigeenspecifieke T-celpopulaties te identificeren in zowel experimentele muismodellen als menselijke ziekten 4,5.
Hoewel tetrameren gemakkelijk hoogfrequente populaties van T-cellen kunnen identificeren die zijn uitgebreid als reactie op antigeenstimulatie, wordt hun gebruik voor naïeve, zelf-antigeenspecifieke of geheugen-T-cellen beperkt door de zeer lage frequenties van deze populaties7. Onze groep en anderen hebben op tetrameren gebaseerde magnetische verrijkingsstrategieën ontwikkeld en gepopulariseerd die de detectiegevoeligheid verhogen om studies van deze celpopulaties in lymfoïde weefsels van muizen mogelijk te maken 8,9,10,11.
De opkomst van weefsel-residente T-cellen in het veld heeft een verhoogde nadruk gelegd op het ontwikkelen van nieuwe manieren om T-cellen in de niet-lymfoïde ruimte te onderzoeken. Net als veel andere slijmvliesoppervlakken komen T-cellen in de longen een reeks zelf- en vreemde antigenen tegen die zijn afgeleid van gastheerepitheel, commensale en infectieuze microben en omgevingsentiteiten, waaronder allergenen. Transcriptionele analyse van T-cellen geoogst uit niet-lymfoïde weefsel (NLT) toont een geheugenachtig fenotype aan dat een uniek weefselspecifiek lot en functie heeft, vaak gericht op trafficking en weefselhomeostase12. Bovendien zijn weefsel-residente geheugen-T-cellen (Trms) meestal meer klonaal beperkt dan die in omloop13. Bepalen hoe en waarom antigenen de verblijfplaats van T-cellen in NLT aansturen, is van cruciaal belang om te begrijpen hoe het immuunsysteem beschermt tegen infectie, weefselhomeostase handhaaft en soms overgaat in auto-immuniteit. Er lijkt echter een grotere slijtage te zijn tussen weefsel-residente T-cellen uit de longen in vergelijking met andere NLT14. Dienovereenkomstig wordt het vermogen om endogene T-cellen van de long met een bepaalde antigeenspecificiteit te identificeren en te karakteriseren beperkt door hun inherente zeldzaamheid.
Door het gebruik van celverrijkingstechnieken op basis van magnetische kralen en peptide:MHC-tetrameerkleuring te combineren, zijn we erin geslaagd om uitgebreide maar zeldzame zelfantigeenspecifieke T-cellen in muizenlongen te detecteren15,16. Hier presenteren we een gedetailleerde beschrijving van een protocol dat we hebben geoptimaliseerd om elke zeldzame antigeenspecifieke T-celpopulatie die aanwezig is in muizenlongen betrouwbaar te isoleren en te karakteriseren (Figuur 1). Dit protocol omvat een in vivo antilichaamkleuringsstap om weefselresidente van vasculaire T-cellente onderscheiden 17, gevolgd door twee verschillende methoden voor de verwerking van longweefsel om tegemoet te komen aan de beschikbaarheid van hulpbronnen. Dit wordt dan gevolgd door een algemene stap van magnetische verrijking van T-cellen, tetrameerkleuring en analyse door middel van flowcytometrie. De levensvatbaarheid van de cellen en de tetrameerkleuring worden in dit protocol verder verbeterd door de toevoeging van aminoguanidine, dat induceerbare stikstofmonoxidesynthase (iNOS)-gemedieerde T-celactiveringsgeïnduceerde apoptose18 blokkeert en Dasatinib, dat de TCR-downregulatie19 beperkt. De stappen die in dit protocol worden benadrukt, maken gebruik van gangbare technieken en direct beschikbare reagentia, waardoor het toegankelijk is voor bijna elke onderzoeker die zich bezighoudt met muizen-T-celimmunologie en zeer aanpasbaar is voor een verscheidenheid aan stroomafwaartse analyses. Hoewel naïeve T-cellen waarschijnlijk niet in de longen worden gevonden, geloven we dat dit protocol bijzonder nuttig zal zijn voor de studie van zelf-antigeenspecifieke T-cellen en Trm’s in de longen.
Figuur 1: Overzicht van de protocolworkflow. Longen worden geoogst van muizen en gedissocieerd in enkele cellen. Monsters worden vervolgens verrijkt voor T-cellen voordat ze worden gekleurd met peptide:MHC-tetrameren en fluorescerend gelabelde antilichamen voor flowcytometrische analyse. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Eerdere karakteriseringen van antigeenspecifieke T-cellen uit de longen hebben geprofiteerd van het robuuste aantal antigeenspecifieke T-cellen dat zich uitbreidt na een acute priming-gebeurtenis zoals intranasale immunisatie of infectie 20,21,22. Zeldzamere T-celpopulaties in de longen, zoals zelf-antigeenspecifieke T-cellen of weefsel-residente geheugen-T-cellen, zijn echter moeilijk te detecteren zonder enige vorm van monster…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken L. Kuhn voor de technische ondersteuning bij de weefselverwerking en de productie van tetrameren. Dit werk werd gefinancierd door de National Institutes of Health (R01 AI107020 en P01 AI165072 aan J.J.M., T32 AI007512 aan D.S.S.), het Massachusetts Consortium on Pathogen Readiness (J.J.M.) en het Massachusetts General Hospital Executive Committee on Research (J.J.M.).
Materials
| 100 mm cell strainer | Fisher Scientific | 22-363-549 | |
| 10x PBS without Ca++ or Mg++ | Corning | 46-013-CM | |
| 1x PBS without Ca++ or Mg++ | Corning | 21-031-CV | |
| AccuCheck Counting Beads | Invitrogen | PCB100 | |
| Aminoguanidine Hemisulfate Salt | Sigma-Aldrich | A7009 | |
| CD90.2 microbeads, mouse | Miltenyi | 130-121-278 | |
| Cell separation magnet (MidiMACS Separator) | Miltenyi | 130-042-302 | Holds single LS column |
| Cell separation magnet (QuadroMACS Separator) | Miltenyi | 130-090-976 | Holds 4 LS columns |
| Dasatinib | Sigma-Aldrich | CDS023389 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| Eagle’s Ham’s Amino Acids medium | Sigma-Aldrich | C5572 | |
| gentleMACS | Miltenyi | 130-093-235 | Automated tissue dissociator |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi | 130-093-237 | Automated tissue dissociator tubes |
| Hank's Balanced Salt Solution with Ca++ or Mg++ | Corning | 21-020-CM | |
| HEPES | Gibco | 15630080 | |
| Ketamine | Vedco | NDC 50989-996-06 | |
| Liberase TM | Roche | 5401119001 | |
| Pacific Blue anti-mouse CD45 antibody (Clone: 30-F11) | Biolegend | 103126 | |
| Paramagnetic cell separation columns (LS Columns) | Miltenyi | 130-042-401 | Comes with plunger |
| Purified anti mouse CD16/32 antibody (Clone: 93) | Biolegend | 101302 | |
| RPMI 1640 medium without L-glutamine | Corning | 15-040-CM | |
| Sodium Chloride 0.9% (Normal Saline) | Cytiva | Z1376 | |
| Xylazine | Pivetal | NDC 466066-750-02 |
References
- Sun, L., Su, Y., Jiao, A., Wang, X., Zhang, B. T cells in health and disease. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 235 (2023).
- Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
- Crawford, F., Kozono, H., White, J., Marrack, P., Kappler, J. Detection of antigen-specific T cells with multivalent soluble class II MHC covalent peptide complexes. Immunity. 8 (6), 675-682 (1998).
- Nepom, G. T., et al. HLA class II tetramers: tools for direct analysis of antigen-specific CD4 + T cells. Arthritis Rheum. 46 (1), 5-12 (2002).
- Davis, M. M., Altman, J. D., Newell, E. W. Interrogating the repertoire: broadening the scope of peptide-MHC multimer analysis. Nat Rev Immunol. 11 (8), 551-558 (2011).
- Moon, J. J., et al. Tracking epitope-specific T cells. Nat Protoc. 4 (4), 565-581 (2009).
- Jenkins, M. K., Moon, J. J. The role of naive T cell precursor frequency and recruitment in dictating immune response magnitude. J Immunol. 188 (9), 4135-4140 (2012).
- Moon, J. J., et al. Naive CD4(+) T cell frequency varies for different epitopes and predicts repertoire diversity and response magnitude. Immunity. 27 (2), 203-213 (2007).
- Obar, J. J., Khanna, K. M., Lefrancois, L. Endogenous naive CD8+ T cell precursor frequency regulates primary and memory responses to infection. Immunity. 28 (6), 859-869 (2008).
- Kotturi, M. F., et al. Naive precursor frequencies and MHC binding rather than the degree of epitope diversity shape CD8+ T cell immunodominance. J Immunol. 181 (3), 2124-2133 (2008).
- Legoux, F. P., Moon, J. J. Peptide:MHC tetramer-based enrichment of epitope-specific T cells. J Vis Exp. 68, 4420 (2012).
- Szabo, P. A., Miron, M., Farber, D. L. Location, location, location: Tissue resident memory T cells in mice and humans. Sci Immunol. 4 (34), eaas9673 (2019).
- Poon, M. M. L., et al. Tissue adaptation and clonal segregation of human memory T cells in barrier sites. Nat Immunol. 24 (2), 309-319 (2023).
- Wakim, M. Z. M., Zheng, L. M. Tissue resident memory T cells in the respiratory tract. Mucosal Immunol. 15 (3), 379-388 (2022).
- Legoux, F. P., et al. CD4+ T cell tolerance to tissue-restricted self antigens is mediated by antigen-specific regulatory T Cells rather than deletion. Immunity. 43 (5), 896-908 (2015).
- Shin, D. S., et al. Lung injury induces a polarized immune response by self-antigen-specific CD4(+) Foxp3(+) regulatory T cells. Cell Rep. 42 (8), 112839 (2023).
- Anderson, K. G., et al. Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes. Nat Protoc. 9 (1), 209-222 (2014).
- Vig, M., et al. Inducible nitric oxide synthase in T cells regulates T cell death and immune memory. J Clin Invest. 113 (12), 1734-1742 (2004).
- Lissina, A., et al. Protein kinase inhibitors substantially improve the physical detection of T-cells with peptide-MHC tetramers. J Immunol Methods. 340 (1), 11-24 (2009).
- Hogan, R. J., et al. Protection from respiratory virus infections can be mediated by antigen-specific CD4(+) T cells that persist in the lungs. J Exp Med. 193 (8), 981-986 (2001).
- Hogan, R. J., et al. Activated antigen-specific CD8+ T cells persist in the lungs following recovery from respiratory virus infections. J Immunol. 166 (3), 1813-1822 (2001).
- Zhao, J., et al. Airway memory CD4(+) T cells mediate protective immunity against emerging respiratory coronaviruses. Immunity. 44 (6), 1379-1391 (2016).
- Hondowicz, B. D., et al. Interleukin-2-dependent allergen-specific tissue-resident memory cells drive asthma. Immunity. 44 (1), 155-166 (2016).
- Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Standardized preparation of single-cell suspensions from mouse lung tissue using the gentleMACS Dissociator. J Vis Exp. 29, 1266 (2009).
- Faustino, L. D., et al. Interleukin-33 activates regulatory T cells to suppress innate gammadelta T cell responses in the lung. Nat Immunol. 21 (11), 1371-1383 (2020).
- Atif, S. M., Gibbings, S. L., Jakubzick, C. V. Isolation and identification of interstitial macrophages from the lungs using different digestion enzymes and staining strategies. Methods Mol Biol. 1784, 69-76 (2018).
- Pape, K. A., Taylor, J. J., Maul, R. W., Gearhart, P. J., Jenkins, M. K. Different B cell populations mediate early and late memory during an endogenous immune response. Science. 331 (6021), 1203-1207 (2011).
- Naeher, D., et al. A constant affinity threshold for T cell tolerance. J Exp Med. 204 (11), 2553-2559 (2007).
- Moon, J. J., et al. Quantitative impact of thymic selection on Foxp3+ and Foxp3- subsets of self-peptide/MHC class II-specific CD4+ T cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (35), 14602-14607 (2011).
- Koehli, S., Naeher, D., Galati-Fournier, V., Zehn, D., Palmer, E. Optimal T-cell receptor affinity for inducing autoimmunity. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (48), 17248-17253 (2014).
- Zhang, Z., Legoux, F. P., Vaughan, S. W., Moon, J. J. Opposing peripheral fates of tissue-restricted self antigen-specific conventional and regulatory CD4(+) T cells. Eur J Immunol. 50 (1), 63-72 (2020).
