Identifizierung seltener antigenspezifischer T-Zellen aus der Lunge von Mäusen mit Peptid:Major-Histokompatibilitätskomplex-Tetrameren
Summary
Wir bieten ein detailliertes Protokoll für die Isolierung und Identifizierung seltener antigenspezifischer T-Zellpopulationen in der Lunge von Mäusen durch magnetische T-Zell-Anreicherung und Peptid:Major Histocompatibility Complex (MHC)-Tetramere.
Abstract
Die Identifizierung und Charakterisierung antigenspezifischer T-Zellen während der Zeit von Gesundheit und Krankheit ist nach wie vor ein Schlüssel zur Verbesserung unseres Verständnisses der Immunpathophysiologie. Die technischen Herausforderungen bei der Verfolgung antigenspezifischer T-Zellpopulationen innerhalb des endogenen T-Zell-Repertoires wurden durch die Entwicklung von Peptid:MHC-Tetramerreagenzien erheblich vorangetrieben. Diese fluoreszenzmarkierten löslichen Multimere von MHC-Molekülen der Klasse I oder II, die an antigene Peptidepitope komplexiert sind, binden direkt an T-Zellen mit entsprechender T-Zell-Rezeptor (TCR)-Spezifität und können daher antigenspezifische T-Zellpopulationen in ihrem nativen Zustand identifizieren, ohne dass eine durch ex vivo induzierte funktionelle Reaktion erforderlich ist Anregung. Für äußerst seltene Populationen können tetramergebundene T-Zellen magnetisch angereichert werden, um die Empfindlichkeit und Zuverlässigkeit des Nachweises zu erhöhen.
Da sich die Untersuchung der geweberesidenten T-Zell-Immunität vertieft, besteht ein dringender Bedarf, antigenspezifische T-Zellen zu identifizieren, die zu nicht-lymphoiden Geweben gelangen und sich dort aufhalten. In diesem Protokoll stellen wir eine detaillierte Reihe von Anweisungen für die Isolierung und Charakterisierung von antigenspezifischen T-Zellen vor, die in der Lunge von Mäusen vorhanden sind. Dies beinhaltet die Isolierung von T-Zellen aus verdautem Lungengewebe, gefolgt von einem allgemeinen Schritt der magnetischen Anreicherung von T-Zellen und einer Tetramerfärbung für die durchflusszytometrische Analyse und Sortierung. Die in diesem Protokoll hervorgehobenen Schritte verwenden gängige Techniken und leicht verfügbare Reagenzien, so dass es für nahezu jeden Forscher, der sich mit Maus-T-Zell-Immunologie beschäftigt, zugänglich ist, und sind hochgradig anpassbar für eine Vielzahl von nachgelagerten Analysen jeder niederfrequenten antigenspezifischen T-Zell-Population, die sich in der Lunge befindet.
Introduction
Das Herzstück des adaptiven Immunsystems ist die Fähigkeit einer T-Zelle, ein bestimmtes Antigen zu erkennen und darauf zu reagieren. Wann und wo eine T-Zelle auf ihr verwandtes Antigen reagiert, bestimmt das Gleichgewicht von Infektion und Autoimmunität, Homöostase und Krebs, Gesundheit und Krankheit1. Daraus folgt, dass sich die Untersuchung von T-Zellen in einem spezifischen Kontext der Immunität auf die Zellen konzentrieren sollte, die spezifisch für ein relevantes Antigen von Interesse sind. Zu den technologischen Fortschritten, die die Fähigkeit zur Charakterisierung antigenspezifischer T-Zellpopulationen erheblich verbessert haben, gehören fluoreszenzmarkierte lösliche Multimere (in der Regel Tetramere) von Molekülen der Klasse I oder II des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC), die an antigene Peptidepitope komplexiert sind, besser bekannt als “Peptid:MHC-Tetramere”2,3,4,5 . Indem sie die natürlichen Liganden von T-Zell-Antigenrezeptoren (TCRs) darstellen, bieten Peptid:MHC-Tetramere der Klassen I und II ein Mittel zur direkten Identifizierung von antigenspezifischen CD8+– bzw. CD4+-T-Zellen innerhalb des endogenen Repertoires von T-Zellen im Immunsystem, ohne dass eine Reaktion auf die Antigenstimulation in einem Assay erforderlich ist. Tetramere stellen einen eleganteren Ansatz für die Untersuchung antigenspezifischer T-Zellen dar als TCR-transgene T-Zell-Adoptionstransfermodelle6 und werden zunehmend zur Identifizierung fremder und selbstantigenspezifischer T-Zellpopulationen sowohl in experimentellen Mausmodellen als auch in menschlichen Krankheiten verwendet 4,5.
Während Tetramere hochfrequente Populationen von T-Zellen, die sich als Reaktion auf Antigenstimulation vergrößert haben, leicht identifizieren können, ist ihre Verwendung für naive, selbstantigenspezifische oder Gedächtnis-T-Zellen durch die sehr niedrigen Frequenzen dieser Populationen begrenzt7. Unsere Gruppe und andere haben Tetramer-basierte magnetische Anreicherungsstrategien entwickelt und populär gemacht, die die Empfindlichkeit des Nachweises erhöhen, um Studien dieser Zellpopulationen in lymphatischen Geweben der Maus zu ermöglichen 8,9,10,11.
Das Auftauchen von geweberesidenten T-Zellen in diesem Feld hat einen verstärkten Schwerpunkt auf die Entwicklung neuer Wege zur Untersuchung von T-Zellen im nicht-lymphoiden Raum gelegt. Wie viele andere Schleimhautoberflächen treffen auch T-Zellen in der Lunge auf eine Reihe von eigenen und fremden Antigenen, die vom Wirtsepithel, kommensalen und infektiösen Mikroben und Umweltentitäten, einschließlich Allergenen, abgeleitet sind. Die transkriptionelle Analyse von T-Zellen, die aus nicht-lymphatischem Gewebe (NLT) gewonnen wurden, zeigt einen gedächtnisähnlichen Phänotyp, der ein einzigartiges gewebespezifisches Schicksal und eine einzigartige Funktion aufweist und oft auf den Transport und die Gewebehomöostase gerichtet ist12. Darüber hinaus neigen geweberesidente Gedächtnis-T-Zellen (Trms) dazu, klonal stärker eingeschränkt zu sein als solche, die sich im Blut befinden13. Die Bestimmung, wie und warum Antigene die T-Zell-Residenz bei NLT antreiben, ist entscheidend für das Verständnis, wie das Immunsystem vor Infektionen schützt, die Gewebehomöostase aufrechterhält und sich manchmal in Autoimmunität verwandelt. Es scheint jedoch eine größere Abnutzung bei geweberesidenten T-Zellen aus der Lunge im Vergleich zu anderen NLT14 zu geben. Dementsprechend ist die Fähigkeit, endogene T-Zellen der Lunge mit einer gegebenen Antigenspezifität zu identifizieren und zu charakterisieren, durch ihre inhärente Seltenheit begrenzt.
Durch die Kombination von magnetischen Kügelchen-basierten Zellanreicherungstechniken und Peptid:MHC-Tetramerfärbung ist es uns gelungen, expandierte, aber seltene selbstantigenspezifische T-Zellen in der Lunge von Mäusen nachzuweisen15,16. Hier präsentieren wir eine detaillierte Beschreibung eines Protokolls, das wir optimiert haben, um jede seltene antigenspezifische T-Zellpopulation in der Lunge von Mäusen zuverlässig zu isolieren und zu charakterisieren (Abbildung 1). Dieses Protokoll umfasst einen In-vivo-Antikörperfärbeschritt zur Unterscheidung von geweberesidenten von vaskulären T-Zellen17, gefolgt von zwei verschiedenen Verfahren zur Verarbeitung von Lungengewebe, um die Verfügbarkeit von Ressourcen zu berücksichtigen. Darauf folgt ein allgemeiner Schritt der magnetischen Anreicherung von T-Zellen, eine Tetramerfärbung und eine Analyse mittels Durchflusszytometrie. Die Lebensfähigkeit der Zellen und die Tetramerfärbung werden in diesem Protokoll durch die Zugabe von Aminoguanidin, das die induzierbare Stickstoffmonoxidsynthase (iNOS)-vermittelte T-Zell-Aktivierungs-induzierte Apoptose blockiert18, und Dasatinib, das die TCR-Herunterregulierung begrenzt19, weiter verbessert. Die in diesem Protokoll hervorgehobenen Schritte verwenden gängige Techniken und leicht verfügbare Reagenzien, so dass es für nahezu jeden Forscher zugänglich ist, der sich mit Maus-T-Zell-Immunologie beschäftigt, und sehr anpassungsfähig für eine Vielzahl von nachgelagerten Analysen ist. Obwohl naive T-Zellen wahrscheinlich nicht in der Lunge zu finden sind, glauben wir, dass dieses Protokoll besonders hilfreich für die Untersuchung von selbstantigenspezifischen T-Zellen und Trms in der Lunge sein wird.
Abbildung 1: Überblick über den Protokoll-Workflow. Lungen werden von Mäusen entnommen und in einzelne Zellen dissoziiert. Die Proben werden anschließend für T-Zellen angereichert, bevor sie mit Peptid:MHC-Tetrameren und fluoreszenzmarkierten Antikörpern für die durchflusszytometrische Analyse gefärbt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Frühere Charakterisierungen von antigenspezifischen T-Zellen aus der Lunge haben von der robusten Anzahl antigenspezifischer T-Zellen profitiert, die sich nach einem akuten Priming-Ereignis wie einer intranasalen Immunisierung oder Infektion vermehren 20,21,22. Seltenere T-Zellpopulationen in der Lunge, wie z. B. selbstantigenspezifische T-Zellen oder geweberesidente Gedächtnis-T-Zellen, sind jedoch ohne irgendeine Form der Pr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken L. Kuhn für die technische Unterstützung bei der Gewebeverarbeitung und der Tetramerproduktion. Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health (R01 AI107020 und P01 AI165072 an J.J.M., T32 AI007512 an D.S.S.), dem Massachusetts Consortium on Pathogen Readiness (J.J.M.) und dem Massachusetts General Hospital Executive Committee on Research (J.J.M.) finanziert.
Materials
| 100 mm cell strainer | Fisher Scientific | 22-363-549 | |
| 10x PBS without Ca++ or Mg++ | Corning | 46-013-CM | |
| 1x PBS without Ca++ or Mg++ | Corning | 21-031-CV | |
| AccuCheck Counting Beads | Invitrogen | PCB100 | |
| Aminoguanidine Hemisulfate Salt | Sigma-Aldrich | A7009 | |
| CD90.2 microbeads, mouse | Miltenyi | 130-121-278 | |
| Cell separation magnet (MidiMACS Separator) | Miltenyi | 130-042-302 | Holds single LS column |
| Cell separation magnet (QuadroMACS Separator) | Miltenyi | 130-090-976 | Holds 4 LS columns |
| Dasatinib | Sigma-Aldrich | CDS023389 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| Eagle’s Ham’s Amino Acids medium | Sigma-Aldrich | C5572 | |
| gentleMACS | Miltenyi | 130-093-235 | Automated tissue dissociator |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi | 130-093-237 | Automated tissue dissociator tubes |
| Hank's Balanced Salt Solution with Ca++ or Mg++ | Corning | 21-020-CM | |
| HEPES | Gibco | 15630080 | |
| Ketamine | Vedco | NDC 50989-996-06 | |
| Liberase TM | Roche | 5401119001 | |
| Pacific Blue anti-mouse CD45 antibody (Clone: 30-F11) | Biolegend | 103126 | |
| Paramagnetic cell separation columns (LS Columns) | Miltenyi | 130-042-401 | Comes with plunger |
| Purified anti mouse CD16/32 antibody (Clone: 93) | Biolegend | 101302 | |
| RPMI 1640 medium without L-glutamine | Corning | 15-040-CM | |
| Sodium Chloride 0.9% (Normal Saline) | Cytiva | Z1376 | |
| Xylazine | Pivetal | NDC 466066-750-02 |
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